產(chǎn)GABA乳酸菌工藝優(yōu)化及其產(chǎn)物抗氧化活性研究

施生玲 ，郭星晨 ，馬金璞 ，楊雪妍 ，宋禮，高丹丹

1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（蘭州 730124）；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（蘭州 730030）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又稱哌叮酸[1]，是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有改善糖尿病、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、舒緩疲勞、改善睡眠和癲癇等[2-4]多種功能，被廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。GABA可通過(guò)微生物發(fā)酵法制備，該方法具有發(fā)酵產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有產(chǎn)GABA的能力，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[5]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[6]、布氏乳桿菌（Lactobacillus brucei）[7]、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）[8]等。由于乳酸菌獨(dú)特的益生特性和安全性，采用乳酸菌生產(chǎn)GABA成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，不僅具有極大的市場(chǎng)應(yīng)用前景，還具有很高的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。

試驗(yàn)從甘肅本地牧民家中自制牦牛酸奶篩選出產(chǎn)GABA的乳酸菌，通過(guò)對(duì)比不同接種量、碳源、氮源、pH和發(fā)酵時(shí)間，探究乳酸菌產(chǎn)GABA的最佳條件，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)GABA的發(fā)酵工藝條件，分析發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，為產(chǎn)GABA乳酸菌功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶（甘肅省甘南藏族自治州牧民自制牦牛酸奶）；DPPH、γ-氨基丁酸（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；L-谷氨酸鈉（L-Glu，BR，索萊寶化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器設(shè)備

ZWYR-2401恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；L3S可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；SG2-FK便攜式pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；GNP-9050恒溫培養(yǎng)箱（湖南波儀爾科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選鑒定

1.3.1.1 乳酸菌菌株的篩選

將適量酸奶接種于MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-3~10-8，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布法接種，接種量為100 μL，于37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶解圈的菌落，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，直至產(chǎn)生單一菌落，將菌株于4 ℃條件儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 乳酸菌菌株的鑒定

將純化的1.3.1所述的菌落形態(tài)的產(chǎn)GABA的菌株按照革蘭染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡觀察其細(xì)胞特征。

1.3.1.3 培養(yǎng)液產(chǎn)GABA的定性和定量的分析

采用紙層析法定性測(cè)定GABA。參考萬(wàn)玉蓮[9]方法操作并加以修改，展開(kāi)劑為正丁醇-冰醋酸-水4∶1∶3（V/V），其中加入0.4%的茚三酮[10]。采用Berthelot比色法定量分析GABA[11]。

1.3.2 產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以MRS液體發(fā)酵培養(yǎng)基（含L-谷氨酸鈉）為基礎(chǔ)，以GABA產(chǎn)量為指標(biāo)，考察不同接種量（1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%）、不同碳源（可溶性淀粉，麥芽糖，乳糖，葡萄糖和蔗糖）、不同pH（4.5，5.0，5.5，6.0和6.5）、不同時(shí)間（24，36，48，60和72 h）對(duì)乳酸菌GABA產(chǎn)量的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以GABA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，pH（A）、接種量（B）和時(shí)間（C）為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

表2 4株菌株菌落形態(tài)描述

1.3.3 GABA抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 羥自由基清除率測(cè)定

參考陳嘉佳等[12]的方法操作并加以修改，羥自由基的清除率按式（1）計(jì)算。

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為試驗(yàn)組吸光度；A2為對(duì)照組吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考陳明[13]的方法操作并加以修改。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

參考李丹丹[14]的方法測(cè)定超氧陰離子自由基的清除率，按式（2）計(jì)算。

式中：P為超氧陰離子自由基清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為試驗(yàn)組吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0、Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選鑒定

2.1.1 乳酸菌菌株的分離純化

將乳酸菌菌株接種在MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的碳酸鈣溶解圈（圖1），挑選單一菌落進(jìn)行培養(yǎng)，菌落形態(tài)如圖1所示，乳酸菌菌落形態(tài)為菌落呈圓形，乳白色不透明，濕潤(rùn)，邊緣整齊。

圖1 菌株形態(tài)圖

2.1.2 乳酸菌菌株的鑒定

對(duì)菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4進(jìn)行革蘭染色，革蘭染色結(jié)果呈現(xiàn)藍(lán)色，均為革蘭陽(yáng)性菌，菌株呈短桿狀，如圖2所示。

圖2 革蘭染色結(jié)果圖

2.1.3 培養(yǎng)液產(chǎn)GABA的定性和定量分析

2.1.3.1 層析法定性測(cè)定GABA

從圖3可以看出：初篩出的4株菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4都產(chǎn)有與標(biāo)準(zhǔn)品GABA相同的Rf值，說(shuō)明4株菌株都產(chǎn)GABA，菌株XBMU436-2顏色最深，說(shuō)明菌株XBMU436-2產(chǎn)生的GABA含量最高，因此，以菌株XBMU436-2為試驗(yàn)菌株。

圖3 紙層析法試驗(yàn)結(jié)果圖

2.1.3.2 Berthelot比色法定量分析GABA

試驗(yàn)采用Berthelot比色法檢測(cè)GABA含量，試驗(yàn)得到線性關(guān)系Y=0.742 4X+0.012 8（R2=0.999）。試驗(yàn)菌株測(cè)定結(jié)果如圖4所示。菌株XBMU436-2的培養(yǎng)液產(chǎn)的GABA含量最高，其產(chǎn)量為1.80 g/L。

圖4 初篩菌GABA含量測(cè)定圖

2.2 高產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 接種量、碳源、pH、發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌GABA產(chǎn)量的影響

如圖5（a）所示，接種量1.5%~2.5%時(shí)，GABA含量呈上升趨勢(shì)，接種量2.5%時(shí)，GABA含量最高，為3.51 g/L，接種量大于3.0%時(shí)，GABA含量開(kāi)始下降。因此，選用接種量2.5%為菌體生長(zhǎng)中的最佳接種量。

圖5 接種量、碳源、pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌GABA含量的影響

如圖5（b）所示：菌株對(duì)不同碳源的利用程度具有一定差異性，測(cè)得以葡萄糖為唯一碳源時(shí)乳酸菌產(chǎn)GABA最多，為5.44 g/L，即菌株對(duì)葡萄糖的利用程度較好，其原因是可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖和蔗糖為多糖，多糖為微生物提供能量則需要先分解，而葡萄糖是單糖，單糖與其他麥芽糖等多糖比起來(lái)，可直接為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，選擇葡萄糖作為菌體生長(zhǎng)中的最佳碳源。

如圖5（c）所示：在pH 5.0~6.0時(shí)，GABA含量呈上升趨勢(shì)，pH 6.0時(shí)，GABA含量最高，為3.14 g/L，但超過(guò)pH 6.0時(shí)，GABA含量開(kāi)始減少，呈現(xiàn)直線下降趨勢(shì)。培養(yǎng)基pH對(duì)微生物的影響很大，pH的大小會(huì)引起細(xì)胞滲透性的變化和各種酶的活性，從而影響微生物的生長(zhǎng)和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用程度，使得乳酸菌產(chǎn)GABA的產(chǎn)量不同。因此，選用pH 6.0為菌株生長(zhǎng)的最佳pH。

如圖5（d）所示：培養(yǎng)時(shí)間為24~48 h時(shí)，GABA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，48 h時(shí)，GABA產(chǎn)量最高，為5.19 g/L，60 h以后GABA含量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，選用48 h為菌體生長(zhǎng)中的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取pH、接種量和時(shí)間這3個(gè)因素，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，根據(jù)中心Box-Behnken組合原理設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，其中，5組為重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用軟件Design-Expert 8.0，對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行一系列回歸分析，對(duì)pH、接種量和時(shí)間3個(gè)單因素進(jìn)行回歸擬合，得到以GABA產(chǎn)量（A）為響應(yīng)值的回歸方程：Y=3.91-0.16A+0.38B+0.31C-0.12AB-0.19AC+0.063BC-0.55A2-0.59B2-0.67C2。

回歸方差分析如表4所示。

表4 回歸方差分析和結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，顯著性檢驗(yàn)表明該回歸模型的擬合極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P＞0.05）不顯著。模型與實(shí)際擬合較好（R2=0.968 6，Radj2=0.927 2），表明模型擬合度可靠性強(qiáng)，觀察值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性良好，該模型可用于優(yōu)化GABA發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

圖6是單因素pH、接種量和時(shí)間交互作用3D響應(yīng)面和等高線圖，2個(gè)因變量相互作用對(duì)GABA產(chǎn)量的影響在3D響應(yīng)面圖中均表現(xiàn)為光滑的彎曲面，彎曲度越大，證明兩變量之間相互作用越強(qiáng)。如圖6（a）所示，在pH一定時(shí)，隨著接種量的增加，培養(yǎng)液中GABA產(chǎn)量先增加后減少，響應(yīng)曲面彎曲度較?。蝗鐖D6（b）所示，pH一定時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中GABA產(chǎn)量先增加后減少，響應(yīng)面曲面彎曲度較?。蝗鐖D6（c）所示，接種量一定時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中GABA產(chǎn)量先增加后減少，響應(yīng)面曲面彎曲度較小。

圖6 pH、時(shí)間和接種量交互作用對(duì)GABA含量的影響及等高線圖

2.3 GABA抗氧化活性的研究

2.3.1 羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

如圖7所示：發(fā)酵液質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL時(shí)，發(fā)酵液對(duì)羥自由基、DPPH、超氧陰離子自由基的清除率逐漸增大，三種自由基的清除率在發(fā)酵液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)最大。圖7（a）顯示，菌液對(duì)羥自由基清除率為80.64%±0.39%，IC50=0.12 mg/mL，同等條件下，VC的清除率為92.85%±0.30%，IC50=0.03 mg/mL；圖7（b）顯示，菌液對(duì)DPPH自由基清除率為57.55%±0.54%，IC50=0.52 mg/mL，同等條件下，VC對(duì)超氧陰離子清除率為85.44%±0.34%，IC50=0.10 mg/mL；圖7（c）顯示，菌液對(duì)超氧陰離子自由基清除率為83.83%±0.20%，IC50=0.20 mg/mL，同等條件下，VC對(duì)自由基的清除率為88.59%±0.15%，IC50=0.14 mg/mL。以VC為標(biāo)準(zhǔn)，GABA對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基有一定清除能力。

圖7 羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)從牦牛酸奶中篩選出4株產(chǎn)GABA乳酸菌，菌株XBMU436-2產(chǎn)GABA最多，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其工藝發(fā)酵條件，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：以葡萄糖為唯一碳源、pH 6.0、接種量2.5%、時(shí)間36 h，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后GABA產(chǎn)量達(dá)4.11 g/L，相比于優(yōu)化前有很大提升，證明響應(yīng)面分析法可有效優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)GABA的工藝條件。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液抗氧化活性的研究，其培養(yǎng)液對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的IC50分別為0.12，0.52和0.20 mg/mL，同等條件下，VC對(duì)羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子的IC50為0.03，0.52和0.14 mg/mL，證明培養(yǎng)液具有一定的抗氧化能力。試驗(yàn)結(jié)果為產(chǎn)GABA乳酸菌功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定基礎(chǔ)。