HPLC 法同時測定龍船花提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量

徐娟，朱彩芳，曹旭

（1.鎮(zhèn)江華康大藥房連鎖有限公司，鎮(zhèn)江 212200；2.丹陽市中醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212300；3.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，鎮(zhèn)江 212009）

龍船花始載于《新修本草》，又名賣子木《新修本草》、紅繡球《學圃雜疏》、五月花《生草藥性備要》、映山紅《本草求原》、大將軍《廣西中藥志》、仙丹花《云南中藥資源名錄》及百日紅《廣西藥用植物名錄》等，其為茜草科植物龍船花Ixora chinensis Lam的花，味甘、淡，性涼，具清熱涼血，散瘀止痛之功效，常用于高血壓、月經不調、閉經、跌打損傷、瘡瘍癤腫的治療[1]。本品于農歷五月盛開紅花，聚集如繡球，此時正是民間賽龍船之時，故稱龍船花。本品富含揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、甾體類及有機酸類等成分[2-4]?，F代藥理研究表明，龍船花具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎、抗妊娠及抗突變等藥理作用[5-8]。本研究提取純化工藝制備龍船花提取物，采用HPLC法同時測定提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素4 種成分的含量，為龍船花的保健食品及新藥產品的開發(fā)奠定實驗基礎。

1 儀器與材料

Waterse 高效液相色譜儀（紫外檢測器），旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮），微量移液器（北京大龍），超聲清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲），真空干燥機（上海儀昕），BAL 電子天平（賽多利斯）。京尼平苷酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111828-201805）、綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-202119）、山奈酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-202013）、異鼠李素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110860-202012）。龍船花提取物（自制，批號：20220318、20220422、20220516），色譜純乙腈（霍尼韋爾），純化水（怡寶），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相組成0.15%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），按表1 進行梯度洗脫；流速：1 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：260 nm。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 提取物制備

稱取經烘干的龍船花藥材適量，粉碎過50 目篩，加15 倍量水回流提取3 次，合并3 次提取液，減壓濃縮至相對密度為1.30，加藥用乙醇醇沉至含醇量達60%，靜置18 小時，離心取上清液，減壓濃縮至無醇味，采用D101 大孔吸附樹脂進行吸附，依次用水、20%乙醇和40%乙醇洗脫以去除水溶性雜質及部分醇溶性雜質，用65%乙醇洗脫5 倍柱體積，收集洗脫液，濃縮干燥后即得。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 對照品溶液配制

精密稱取京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素對照品適量于量瓶中，稀釋液（乙腈∶0.15%醋酸水溶液=80∶20）溶解并定容，配成含京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素分別為89.6 mg·L-1、236.9 mg·L-1、139.4 mg·L-1和177.8 mg·L-1的混合對照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液制備

稱取龍船花提取物100 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，用3 mL 65%乙醇超聲溶解，稀釋液定容，搖勻后即得，過0.45 μm 濾膜后備用。

2.4 方法專屬性

按“2.1 色譜條件”下進樣分析，得到混合對照品和龍船花提取物的HPLC 色譜圖，見圖1。在本實驗色譜條件下，京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的分離度良好，檢測無干擾。

圖1 混合對照品和龍船花提取物色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance and the extract of Ixora Chinensis Lam

2.5 線性關系考察

吸取“2.3.1 對照品溶液配制”中混合對照品適量，稀釋液定容得京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素濃度分別為2.24、4.48、8.96、22.4、44.8、89.6 mg · L-1、5.922 5、11.845、23.69、59.225、118.45、236.9 mg·L-1、3.485、6.97、13.94、34.85、69.7、139.4 mg·L-1和4.445、8.89、17.78、44.45、88.9、177.8 mg·L-1系列對照品溶液。按“2.1 色譜條件”進樣并記錄峰面積，并以峰面積（A）對對照品溶液濃度（C）進行線性回歸，得京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的回歸方程及線性范圍分別如表2所示。

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equation and linear range

2.6 精密度試驗

精密吸取含京尼平苷酸8.96 mg·L-1、綠原酸23.69 mg·L-1、山奈酚13.94 mg·L-1和異鼠李素17.78 mg·L-1的混合對照品10 μL，按“2.1 色譜條件”重復進樣6 次，記錄各成分的峰面積，結果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.57%、1.28%、1.39%和1.61%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

稱取龍船花提取物（20220318 批）6 份，每份約100 mg，精密稱定，按“2.3.2 供試品溶液的制備”配制供試品溶液，再按“2.1 色譜條件”下條件進樣，記錄京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素分別的峰面積，計算各自的測定結果。結果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素在龍船花提取物的含量分別 為1.968 mg·g-1、6.149 mg·g-1、3.625 mg·g-1和4.513 mg·g-1，各成分的RSD 值分別為1.74%、1.55%、1.36%和1.42%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一龍船花提取物供試品溶液，按“2.1色譜條件”分別在0，1，3，6，9，12，18，24，48 h 分別進樣測定，記錄京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積，結果京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素峰面積的RSD 分別為1.72%、1.80%、1.19 %和1.26%，表明供試品溶液在48 h 內穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗

稱取已知含量的龍船花提取物（20220318 批）6 份，每份約50 mg，精密稱定，用3 mL 65%乙醇超聲溶解，再加入5 mL 京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素為22.4 mg·L-1、59.225 mg·L-1、34.85 mg·L-1和44.45 mg·L-1的混合對照品溶液，于10 mL 容量瓶中，稀釋液稀釋定容。各樣品均經0.45 μm 濾膜濾過，進樣并記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD 值，結果見表3。

表3 加樣回收率結果Tab.3 Results of sample addition recovery

2.10 樣品測定

精密稱取3 個批次龍船花提取物，每批約100 mg，按“2.3.2 供試品溶液制備”制備供試品溶液，HPLC 進樣分析，記錄峰面積，分別計算龍船花提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量，如表4 所示。

表4 樣品中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量Tab.4 Content of geniposide，chlorogenic acid，kaempferol and isorhamnetin in the sample

3 討論

我們將京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素對照品分別經紫外全波長掃描，結果京尼平苷酸在266 nm 波長處有最大吸收，綠原酸在273 nm 和326 nm 波長處有最大吸收，山奈酚在254 nm 波長處有最大吸收，異鼠李素在255 nm 和358 nm 波長處有最大吸收，經過實驗比較，當檢測波長為260 nm時，各色譜峰的峰型及分離度均良好。在選擇流動相時，考察發(fā)現乙腈-水體系的基線相對平穩(wěn)、峰型較好，且能較好地分離京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素四種成分，同時加0.15%的甲酸調整峰型，使峰型更優(yōu)。

通過實驗結果發(fā)現，龍船花提取物中綠原酸的含量最高（6.048 mg·g-1），其他3 種成分含量分別為京尼平苷酸（1.987 mg·g-1）、山奈酚（3.647 mg·g-1）和異鼠李素（4.442 mg·g-1）。長期研究證明，綠原酸在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等領域具有良好的藥理作用[9]，京尼平苷酸亦表現出優(yōu)良的抗炎作用[10]，同時山奈酚和異鼠李素均被學者證明有較好的抗炎止痛作用[11-12]。這些也從側面證明了龍船花自古就有記載的“清熱涼血，散瘀止痛”的功效的合理性。

本研究建立HPLC 法同時測定龍船花提取物中京尼平苷酸、綠原酸、山奈酚和異鼠李素的含量，該方法簡便、準確，重現性好，可用于龍船花提取物的質量控制與評價。由于本實驗中研究對象僅為大孔樹脂純化后的提取物，成分種類較藥材本身要精簡，我們將進一步擴大基礎性研究，以期獲得更深入的發(fā) 現。