報(bào)告基因法檢測(cè)人生長(zhǎng)激素生物學(xué)活性

俞露，劉玉林，朱秋媚，張宇，李繼宏，劉瑩，劉景會(huì)

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司重組蛋白藥物研究室，吉林 長(zhǎng)春 130000

人生長(zhǎng)激素（human growth hormone，hGH）在臨床上廣泛用于治療GH 缺乏癥（growth hormone deficiency，GHD）、特納綜合征、嚴(yán)重?zé)齻奥阅I臟病等［1-8］。生物學(xué)活性作為生物制品最關(guān)鍵的質(zhì)量屬性是產(chǎn)品必檢項(xiàng)目［8-9］，而對(duì)于hGH，目前《中國(guó)藥典》及《美國(guó)藥典》中的檢測(cè)方法均為幼齡大鼠去垂體法。由于去垂體可能導(dǎo)致大鼠死亡，也可能出現(xiàn)去除不凈而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確的情況，制備模型需要較高的實(shí)驗(yàn)水平，且從建模至實(shí)驗(yàn)結(jié)束需至少25 d，目前大部分研發(fā)公司無(wú)法達(dá)到此項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需要的清潔條件［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立報(bào)告基因法（reporter gene assay，RGA）檢測(cè)hGH 的生物學(xué)活性：以HEK293／GH-Luc細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)hGH 與細(xì)胞膜上的hGH 受體（hGH receptor，hGHR）結(jié)合，從而激活熒光素酶（luciferase，Luc）的表達(dá)，Luc的表達(dá)水平與hGH 的生物學(xué)活性成正相關(guān)，加入細(xì)胞裂解液和Luc 底物后，測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，以此確定hGH 的生物學(xué)活性。該方法快速、靈敏且操作簡(jiǎn)便，有望替代傳統(tǒng)體內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)方法，用于hGH 的活性評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及樣品 HEK293／GH-Luc 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；hGH 原液（批號(hào)：S20200303）及成品（批號(hào)：S20190501）由本公司重組蛋白藥物研究室制備。

1.2 主要試劑及儀器 hGH 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（3.0 IU／1.0 mg，批號(hào)：140635-201805）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；96 孔透明培養(yǎng)板和底部透明白板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293／GH-Luc 細(xì)胞復(fù)蘇后，每2 ～3 d 按1∶4 傳代1 次，培養(yǎng)基為含10% FBS 的MEM，細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于活性檢測(cè)。

1.4 方法的建立 將標(biāo)準(zhǔn)品及樣品預(yù)稀釋至1 μg／mL，在透明細(xì)胞板中3倍系列稀釋后，每孔取70 μL 移入白板中，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)復(fù)孔；將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293／GH-Luc 細(xì)胞消化后，用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為（3.5 ～3.8）×105個(gè)／mL，加入白板中，70 μL／孔，并設(shè)陰性對(duì)照（用培養(yǎng)基替代），將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)18 ～24 h；棄去培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液，100 μL／孔，作用10 min；加入底物溶液（Bright-Glo Luciferase Assay Substrate），80 μL／孔，避光作用2 min，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀讀取相對(duì)光單位（relative light unit，RLU）值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 利用分析軟件Gen5 Secure 3.08 進(jìn)行四-參數(shù)Logistic回歸，擬合劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算樣品的相對(duì)效價(jià)。

式中Pr 為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性；Ds 為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)；Dr 為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)；Es 為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)；Er 為標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 專屬性 分別使用hGH 原液、原液緩沖體系、注射劑緩沖體系、FBS、陰性對(duì)照作為供試品進(jìn)行活性檢測(cè)，驗(yàn)證產(chǎn)品的輔料成分及培養(yǎng)基中的血清成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

1.6.2 重復(fù)性 對(duì)1 批樣品重復(fù)檢測(cè)6 次，計(jì)算相對(duì)效價(jià)的幾何變異系數(shù)（geometric coefficient of variation，GCV）。

1.6.3 中間精密度 由2 名實(shí)驗(yàn)員在不同時(shí)間分別對(duì)不同批次原液進(jìn)行活性測(cè)定，各檢測(cè)3 次。分別計(jì)算4批原液6次相對(duì)效價(jià)測(cè)定值的GCV。

1.6.4 相對(duì)準(zhǔn)確度及線性范圍 取hGH標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋至1 μg／mL的60%（0.6 μg／mL）、80%（0.8 μg／mL）、100%（1.0 μg／mL）、160%（1.6 μg／mL）作為供試品，每個(gè)濃度分別重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算相對(duì)偏差。以效價(jià)理論值的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)效價(jià)測(cè)定值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)做圖，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程的斜率及決定系數(shù)，并評(píng)估符合相對(duì)準(zhǔn)確度、線性要求時(shí)的效價(jià)水平范圍，該范圍應(yīng)至少涵蓋相對(duì)效價(jià)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍（80%～150%）。

1.6.5 耐用性 取3批原液、1批成品作為供試品，將第10、28代HEK293／GH-Luc細(xì)胞分別按3.5×105、3.8 × 105個(gè)／mL 的密度鋪板，并在4 次檢測(cè)中將4批樣品分別依次置于細(xì)胞板的不同位置，見(jiàn)表1；另取1 批原液，在加入熒光酶底物后顯色時(shí)間分別設(shè)為2、8、16 min，以驗(yàn)證方法的耐用性。計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)條件下相對(duì)效價(jià)測(cè)定值的GCV。

表1 耐用性驗(yàn)證方案1Tab.1 Scheme 1 for durability verification

1.7 方法的應(yīng)用 應(yīng)用建立的方法對(duì)市售不同廠家（1、2）的GH產(chǎn)品及1批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 原液及注射劑緩沖液、FBS無(wú)效應(yīng)曲線，吸收值與陰性對(duì)照相似，表明產(chǎn)品中輔料成分及培養(yǎng)基中血清成分不會(huì)對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Verification for specificity

2.1.2 重復(fù)性 1 批樣品重復(fù)檢測(cè)6 次相對(duì)效價(jià)的GCV為6.794%，遠(yuǎn)小于《生物制品生物活性／效價(jià)測(cè)定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》要求（低于20%）。見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Verification for repeatability

2.1.3 中間精密度 2 名實(shí)驗(yàn)員不同時(shí)間對(duì)不同批次樣品檢測(cè)的相對(duì)效價(jià)GCV均低于20%，見(jiàn)表3。

表3 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification for intermediate precision

2.1.4 相對(duì)準(zhǔn)確度及線性范圍 不同濃度供試品相對(duì)效價(jià)測(cè)定值的相對(duì)偏差均在±12%范圍內(nèi)?；貧w方程的斜率為0.982，在0.80 ～1.25 范圍內(nèi)；決定系數(shù)（R2）為0.997，大于0.9；該方法中符合相對(duì)準(zhǔn)確度、線性要求時(shí)的效價(jià)水平范圍為60% ～160%，涵蓋了其成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（80% ～150%）范圍。見(jiàn)圖2和表4。

圖2 線性范圍驗(yàn)證回歸曲線Fig.2 Regression curve of linear range verification

表4 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Verification for linear range

2.1.5 耐用性 3 批原液及1 批成品在不同細(xì)胞代次、細(xì)胞密度及加樣位置的條件下，相對(duì)效價(jià)測(cè)定值的GCV分別為4.758%、4.430%、7.294%和2.771%，均小于20%，見(jiàn)表5；同1 批原液加入熒光素酶底物反應(yīng)不同時(shí)間結(jié)果的GCV為0.998%，雖然酶標(biāo)板各孔的吸收值隨著時(shí)間變化有所降低，但活性檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯變化，表明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可發(fā)生的條件變化不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

表5 耐用性驗(yàn)證結(jié)果（IU／mg）Tab.5 Verification for durability（IU／mg）

2.2 方法的應(yīng)用 使用建立的方法對(duì)市售不同廠家的GH進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)，廠家1檢測(cè)結(jié)果為5.02 IU／瓶，廠家2 為4.85 IU／瓶，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為3.1 IU／支（均與標(biāo)示量一致），本公司原液比活性為3.3 IU／mg，滿足《中國(guó)藥典》三部（2020 版）關(guān)于GH 比活性應(yīng)不低于2.5 IU／mg的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法可用于GH的生物學(xué)活性評(píng)價(jià)。見(jiàn)圖3和表6。

圖3 市售產(chǎn)品檢測(cè)曲線Fig.3 Detection curve of commercial products

表6 RGA檢測(cè)市售、標(biāo)準(zhǔn)品及在研GH結(jié)果Tab.6 RGA results of commercially available，standard products and GH under development

3 討 論

RGA 是通過(guò)分子生物學(xué)手段，將報(bào)告基因整合入待測(cè)生物系統(tǒng)中，繼而通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因產(chǎn)生的信號(hào)，研究特定的生物學(xué)過(guò)程的方法［12-16］。RGA 目前逐漸應(yīng)用于生物制品的生物學(xué)活性檢測(cè)，一般是建立細(xì)胞模型后，通過(guò)待測(cè)藥物激活特定信號(hào)通路啟動(dòng)效應(yīng)物質(zhì)表達(dá)，從而反映藥物的生物學(xué)活性［17-21］。目前該方法已廣泛應(yīng)用于IFN、促胰島素分泌肽融合蛋白［22］、促紅細(xì)胞生成素［23］等生物制品的活性檢測(cè)。生物制品的微小工藝變化均可能影響蛋白的修飾、結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)的產(chǎn)生等，從而影響產(chǎn)品的活性，而傳統(tǒng)的活性檢測(cè)方法如細(xì)胞增殖法、細(xì)胞病變法等一般靈敏度較低，無(wú)法顯示出微弱的差異，且目前GH 生物學(xué)活性檢測(cè)方法為大鼠去垂體法，該方法存在一定的難度，《中國(guó)藥典》對(duì)于GH生物學(xué)活性只需每年檢測(cè)1 次，但對(duì)于研發(fā)人員，產(chǎn)品的生物學(xué)活性代表最重要的質(zhì)量參數(shù)，因此，建立快速、靈敏的檢測(cè)方法至關(guān)重要，可指導(dǎo)工藝開(kāi)發(fā)優(yōu)化、產(chǎn)品穩(wěn)定性研究等，提高研發(fā)效率。

在方法建立過(guò)程中，由于血清成分中可能含GH類似物，對(duì)FBS 是否會(huì)干擾GH 活性檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，33%以下濃度的血清對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，與陰性一致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)起始濃度、細(xì)胞密度、稀釋梯度等各項(xiàng)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了篩選及優(yōu)化，成功建立了RGA 檢測(cè)hGH 生物學(xué)活性，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。專屬性驗(yàn)證主要考察了各種輔料成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，檢測(cè)范圍指能滿足準(zhǔn)確度、線性且涵蓋產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確范圍，耐用性驗(yàn)證重點(diǎn)考察了細(xì)胞密度、細(xì)胞代次、加樣位置、加入底物反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，因?yàn)檫@幾個(gè)試驗(yàn)因素在日常檢測(cè)過(guò)程中是不能準(zhǔn)確控制的因素，驗(yàn)證結(jié)果顯示，均符合要求。本研究建立的方法有望替代大鼠去垂體法，作為hGH生物學(xué)活性的評(píng)價(jià)方法。