HBV核酸血篩試劑國(guó)家參考品的研制

李克堅(jiān)，郝曉甜，周誠(chéng)

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷一室，北京 100050

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性分布，全世界約有2.57 億人感染HBV［1-2］，我國(guó)為肝病大國(guó)，2019 年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在乙類傳染病中，病毒性肝炎的報(bào)告發(fā)病率位列首位，報(bào)告死亡率位列第三，其中HBV 報(bào)告發(fā)病率為71.77／10 萬(wàn)［3］。HBV 傳播途徑與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）相同，主要是通過(guò)接觸受感染的血液或血液制品、某些體液或組織，以及母嬰傳播，HBV、HCV 和HIV 均為輸血相關(guān)的重要病原體［4-7］。我國(guó)血站、漿站用于從獻(xiàn)血者采集的血漿和血清樣本中進(jìn)行血液篩查的HBV、HCV及HIV 核酸檢測(cè)試劑為乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒核酸檢測(cè)試劑盒（通常稱HBVHCVHIV 核酸血篩試劑盒），根據(jù)國(guó)家藥品管理辦法［8］，該品種按藥品管理，實(shí)行批簽發(fā)。本文研制了HBV 核酸血篩試劑國(guó)家參考品，用于HBVHCVHIV 核酸聯(lián)檢血篩試劑盒檢測(cè)中，為我國(guó)HBV 核酸血篩試劑的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 從上海、甘肅、河南、湖南、湖北等地域的血液中心、漿站、生物制品公司等收集到的多份人HBV抗體陽(yáng)性或HBV感染者血漿樣品，為本室?guī)齑妗?/p>

1.2 現(xiàn)行HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品 第四代WHOHBVDNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（4th WHO International Standard for HBV DNA forNAT，NIBSCcode：10／266），定量值為955000IU／mL，對(duì)數(shù)值為5.98 lgIU／mL；HBV DNA 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：340021-201701），定量值為1.0 × 108IU／mL，對(duì)數(shù)值為8.0 lgIU／mL。

1.3 主要試劑 乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）為羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的Roche Diagnostics GmbH 產(chǎn)品；乙型肝炎病毒五項(xiàng)（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法）為北京東南悅達(dá)公司的雅培貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；HBVHCVHIV 核酸血篩檢測(cè)試劑為羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的cobas?Taq Screen MPX Test（cobas s 201 系統(tǒng)）產(chǎn)品及上藥康德樂(lè)（上海）醫(yī)藥有限公司代理銷售的Grifols Diagnostic Solutions Inc.產(chǎn)品，ProcleixUltrio Elite Assay。

1.4 HBV DNA參考品候選品的篩選 將收集的血漿樣品進(jìn)行HBV五項(xiàng)檢測(cè)、HBV DNA檢測(cè)及HBVHCV HIV 核酸血篩檢測(cè)，選擇HBsAb 抗體水平較高、HBV DNA 結(jié)果為陰性的樣品作為陰性參考品候選品；選擇HBV DNA 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品作為陽(yáng)性參考品候選品。

1.5 最低檢出量（limit of detection，LOD）參考品的制備 取2支第四代WHO HBV DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（每支加0.5 mL無(wú)菌水溶解后，濃度為9.55×105IU／mL），用人無(wú)HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 及HBV 五項(xiàng)全陰性血（本室?guī)齑媾R床血漿樣本）進(jìn)行10倍系列稀釋，共4 個(gè)濃度梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)定；同時(shí)，取1 支HBV DNA 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，用相同的人HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA及HBV五項(xiàng)全陰性血，進(jìn)行10倍系列稀釋至1.0×103IU／mL，作為L(zhǎng)OD 參考品候選品。將上述兩種稀釋好的樣品同時(shí)進(jìn)行HBV DNA 測(cè)定；以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為定量標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算LOD 參考品候選品中HBV DNA 含量。計(jì)算方法①：將WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋實(shí)測(cè)值與其理論濃度繪圖，根據(jù)得到的方程，計(jì)算LOD 參考品3個(gè)實(shí)測(cè)值均值相對(duì)該WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)濃度值；計(jì)算方法②：將WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品及待標(biāo)定LOD參考品濃度均值進(jìn)行比較，計(jì)算待標(biāo)品相對(duì)該WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)濃度值。

1.6 HBV 核酸參考品候選品的協(xié)作標(biāo)定 將上述HBV 核酸血篩國(guó)家陰性及陽(yáng)性參考品候選品、1 支LOD 參考品待標(biāo)品，分發(fā)至8 家企業(yè)實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)為①～⑧），分別進(jìn)行HBVHCVHIV核酸血篩聯(lián)檢測(cè)定。

1.7 陰性參考品及陽(yáng)性參考品的定量測(cè)定 將上述標(biāo)定后篩選出的陰性及陽(yáng)性參考品，分別用羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司的HBV DNA 檢測(cè)試劑、湖南圣湘生物科技有限公司的HCV RNA 檢測(cè)試劑及北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司的HIV RNA檢測(cè)試劑，進(jìn)行病毒核酸載量檢測(cè)；同時(shí)，驗(yàn)證標(biāo)定分裝后結(jié)果是否正確。

1.8 均勻性考察 分別隨機(jī)抽取分裝過(guò)程中前、中、后的陽(yáng)性參考品P1 ～P9及LOD 參考品分裝樣品，各2 支，分別測(cè)定HBV DNA 2 次，根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020 版）要求進(jìn)行結(jié)果判定［9］，采用SPSS 22［10］分別進(jìn)行方差分析比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.9 穩(wěn)定性驗(yàn)證 根據(jù)生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，將參考盤中的陽(yáng)性參考品P1 ～P9 及LOD 參考品分別按以下條件處理：反復(fù)凍融2、3、4 次；4 ℃放置2、3、4、5 d；室溫保存16、24 h。用乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，分別取均值（lgIU／mL），結(jié)果與存放于-80 ℃條件下的參考品進(jìn)行比較，計(jì)算出絕對(duì)偏差，考察參考品的凍融穩(wěn)定性及加速穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA參考品候選品的篩選

2.1.1 陰性參考品 共選擇出18 份HBV、HCV、HIV均為陰性的樣品作為陰性參考品候選品。

2.1.2 陽(yáng)性參考品 共選擇出18 份HBV 為陽(yáng)性的樣品作為陽(yáng)性參考品候選品。

2.2 LOD參考品的標(biāo)定 方法①計(jì)算結(jié)果：相對(duì)WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為1.07 × 103IU／mL；方法②計(jì)算結(jié)果：相對(duì)WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為1.06×103IU／mL。最終，確定LOD 相對(duì)第四代WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為1×103IU／mL（n=3，CV為4.2%），作為HBV核酸血篩國(guó)家參考品LOD的定值。

2.3 HBV 核酸參考品候選品的協(xié)作標(biāo)定 根據(jù)8 家企業(yè)實(shí)驗(yàn)室用HBVHCVHIV 核酸血篩試劑標(biāo)定結(jié)果，18 份陰性參考品候選品均為陰性，從中選擇出8份陰性參考品候選品，作為國(guó)家HBV 核酸血篩試劑國(guó)家陰性參考品（N1 ～N8）。18 份陽(yáng)性參考品候選品標(biāo)定結(jié)果均為HBV 陽(yáng)性，從中選擇出9 份陽(yáng)性參考品，作為國(guó)家HBV 核酸血篩試劑國(guó)家陽(yáng)性參考品（P1 ～P9）。

2.4 陰性參考品及陽(yáng)性參考品的定量 陰性參考品HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA病毒載量均為0 IU／mL。陽(yáng)性參考品HBV DNA 病毒載量為103～105IU／mL，其中，P6、P9為HBV DNA及HCV RNA共感染樣品；P1、P8為HBV DNA、HCV RNA 及HIV RNA 共感染樣品。見(jiàn)表1。特別指出，該定量值僅作為驗(yàn)證存在HBV、HCV或HIV核酸，不能作為病毒定量標(biāo)準(zhǔn)值使用。

表1 HBV DNA、HCV RNA 及HIV RNA 3 種病毒載量測(cè)定（IU／mL）Tab.1 Determination of viral loads of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA（IU／mL）

2.5 均勻性 陽(yáng)性參考品P1 ～P9 及LOD 參考品均勻性考察結(jié)果經(jīng)方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），分組比較結(jié)果差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表2。表明分裝均勻性好，分裝的參考品支與支間無(wú)差異。

表2 均勻性分析Tab.2 Homogeneity analysis

2.6 參考品穩(wěn)定性

2.6.1 反復(fù)凍融穩(wěn)定性 分別與存放于-80 ℃條件下的相應(yīng)參考品進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差均小于PCR 誤差允許范圍0.50 lgIU／mL，見(jiàn)表3。表明參考品反復(fù)凍融2 ～4次穩(wěn)定性好。

表3 反復(fù)凍融的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.3 Comparison of stability of repeated freeze-thaw measurements（lgIU／mL，，n=3）

表3 反復(fù)凍融的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.3 Comparison of stability of repeated freeze-thaw measurements（lgIU／mL，，n=3）

參考品LOD P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9-80 ℃保存3.06 4.75 4.88 4.12 5.25 4.60 4.73 4.81 3.99 5.49凍融2次0.01 0.05-0.05-0.04-0.01-0.02-0.01 0.07-0.06-0.05凍融3次0.00 0.07-0.07 0.00-0.03 0.01 0.02 0.09-0.05-0.11凍融4次-0.01 0.06-0.07-0.02-0.05 0.01-0.02 0.02 0.41-0.15

2.6.2 4 ℃保存穩(wěn)定性 分別與存放于-80 ℃條件下的相應(yīng)參考品進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差均小于PCR 誤差允許范圍0.50 lgIU／mL，見(jiàn)表4。表明參考品4 ℃保存2 ～5 d穩(wěn)定性好。

表4 4 ℃保存不同時(shí)間的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.4 Stability comparison under different storage durations at 4 ℃（lgIU／mL，，n=3）

表4 4 ℃保存不同時(shí)間的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.4 Stability comparison under different storage durations at 4 ℃（lgIU／mL，，n=3）

參考品LOD P1 P2 P3 P4 P5 P6-80 ℃保存3.06 4.75 4.88 4.12 5.25 4.60 4.73 2 d 0.01-0.01-0.08 0.01-0.04-0.01-0.05 3 d 0.01-0.36-0.05 0.02-0.04-0.01-0.03 4 d 0.04-0.26-0.21 0.05-0.01-0.03-0.36 5 d 0.03-0.42-0.28-0.02-0.04 0.00-0.49

2.6.3 室溫保存穩(wěn)定性 分別與存放于-80 ℃條件下的相應(yīng)參考品進(jìn)行比較，絕對(duì)偏差均小于PCR 誤差允許范圍0.50 lgIU／mL，見(jiàn)表5。表明參考品室溫保存16 ～24 h穩(wěn)定性好。

表5 室溫保存不同時(shí)間的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.5 Stability comparison under different storage durations at room temperature（lgIU／mL，，n=3）

表5 室溫保存不同時(shí)間的穩(wěn)定性比較（lgIU／mL，，n=3）Tab.5 Stability comparison under different storage durations at room temperature（lgIU／mL，，n=3）

參考品LOD P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9-80 ℃保存3.06 4.75 4.88 4.12 5.25 4.60 4.73 4.81 3.99 5.49室溫16 h-0.03-0.25-0.07 0.00-0.04 0.03-0.36-0.45 0.20-0.04室溫24 h-0.07-0.44-0.06-0.04-0.06-0.09 0.05 0.05-0.15-0.12

2.7 參考品標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020版）乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒1 型核酸檢測(cè)試劑盒部分，制定HBV 核酸血篩試劑國(guó)家參考品標(biāo)準(zhǔn)。本參考品用于HBV 核酸血篩檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)滿足以下要求：8 份HBV 核酸血篩試劑陰性參考品，符合率（-／-）為8／8；9份HBV核酸血篩試劑陽(yáng)性參考品，符合率（+／+）為9／9；HBV核酸血篩試劑LOD 參考品，用HBV、HCV、HIV 核酸檢測(cè)均為陰性人血清／血漿為稀釋液進(jìn)行稀釋后檢測(cè)，混樣檢測(cè)系統(tǒng)的LOD不低于15×nIU／mL（n為混樣系數(shù)），單檢／拆分／鑒別檢測(cè)模式LOD不低于15 IU／mL，且稀釋用人血清／血漿HBV、HCV、HIV核酸檢測(cè)均為陰性。

3 討論

HBV 屬于嗜肝DNA 病毒科，為目前發(fā)現(xiàn)最小的DNA 病毒，具有獨(dú)特的帶有部分單鏈區(qū)的雙鏈DNA環(huán)狀模式［11］。研究表明，HBV DNA 核酸檢測(cè)，能在檢測(cè)出HBsAg 之前數(shù)周檢測(cè)出HBV 感染，可在感染早期階段血清陰性樣品中，以及感染晚期階段HBc抗體陽(yáng)性／HBsAg陰性樣品中，檢測(cè)出低水平的HBV DNA，是機(jī)體內(nèi)HBV 的數(shù)量、復(fù)制水平、傳染性、藥物治療效果、制定治療策略等評(píng)估指標(biāo)，也是唯一能幫助確診隱匿性HBV 感染和隱匿性慢性HBV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)［12-14］。

目前無(wú)償獻(xiàn)血是我國(guó)臨床用血的主要來(lái)源［15］，隨著對(duì)輸血相關(guān)病原體的認(rèn)識(shí)日益深化，經(jīng)血傳播疾病的嚴(yán)重性引起社會(huì)廣泛關(guān)注。根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》［16］要求，血站除了使用傳統(tǒng)ELISA 方法檢測(cè)獻(xiàn)血者血液中各種病原體的抗原、抗體外，核酸檢測(cè)（nucleic acid testing，NAT）作為一種新的檢測(cè)策略被納入整體檢測(cè)體系中。對(duì)獻(xiàn)血者血液進(jìn)行HBV、HCV及HIV核酸檢測(cè)，可大大縮短“窗口期”，更好地控制血液質(zhì)量，最大程度地減少輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。該HBV、HCV及HIV核酸聯(lián)合檢測(cè)，主要檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光PCR 法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）法等，為定性分析，不能定量檢測(cè)。主要用于血液中心、血站、漿站，測(cè)試個(gè)體血漿樣本或多個(gè)合并在一起的混合血漿樣本，即單人份（拆分／鑒別）及混樣檢測(cè)。混樣檢測(cè)主要包括6、8、16、24、48及96混樣檢測(cè)等，因各企業(yè)產(chǎn)品不同而有不同混樣的設(shè)置。

本參考品建立的目的即為了該HBVHCVHIV 核酸血篩試劑盒檢測(cè)中HBV 核酸血篩檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制而設(shè)立。目前已經(jīng)實(shí)行批簽發(fā)的生產(chǎn)企業(yè)共9 家（進(jìn)口兩家、國(guó)產(chǎn)7 家），分別為上藥康德樂(lè)醫(yī)藥科技（上海）有限公司（Grifols公司產(chǎn)品）、羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司（Roche）、湖南圣湘生物科技有限公司、蘇州新波生物技術(shù)有限公司、北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司、珠海麗珠試劑股份有限公司、上?？迫A生物工程股份有限公司、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司及蘇州華益美生物科技有限公司。

由于不同企業(yè)在檢測(cè)模式、LOD 上的不同設(shè)置，考慮到有企業(yè)單人份檢驗(yàn)，如果HBV、HCV或HIV中有任何一項(xiàng)為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，需要進(jìn)一步鑒別檢測(cè)，才能準(zhǔn)確判定出為HBV、HCV 或HIV 陽(yáng)性。為了不必要的麻煩，陰性參考品樣本的選擇，采用人HBV、HCV或HIV核酸全陰性血漿。陽(yáng)性參考品樣本的選擇，考慮HBV與HCV重疊感染的發(fā)生率比較高，HBV 與HIV 共感染的情況也時(shí)有發(fā)生［17-18］，不排除HBV 陽(yáng)性樣本中混有HCV 或HIV 共感染的血漿，同時(shí)，考慮到該參考品設(shè)立的目的是質(zhì)量控制，如果HBV DNA 濃度太高，易引起儀器污染，影響后續(xù)正常工作，因此選擇HBV DNA 病毒載量不超過(guò)105IU／mL的HBV DNA陽(yáng)性血漿。對(duì)于LOD國(guó)家參考品，考慮到核酸血篩試劑的靈敏度較高，由于各企業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中LOD的要求不同，檢測(cè)模式的不同，將LOD國(guó)家參考品的濃度設(shè)置為1 支高于所有企業(yè)所有檢測(cè)模式的樣本，使用時(shí)，可按照不同企業(yè)藥品注冊(cè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)或產(chǎn)品制檢規(guī)程，用人HBV、HCV或HIV全陰性血漿稀釋后檢測(cè)判定。溯源上可以溯源至現(xiàn)行的第四代WHO HBV DNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code：10／266）。

綜上所述，HBVHCVHIV 核酸血篩試劑是按藥品管理的品種，實(shí)行批簽發(fā)，但一直未單獨(dú)用于其中HBV 核酸血篩試劑部分用的國(guó)家參考品，該參考品的建立彌補(bǔ)了這一空缺，有利于保證血液質(zhì)量和安全用血，極大地促進(jìn)了該產(chǎn)品批簽發(fā)的發(fā)展，有利于該產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化研究。