長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸FRAPT在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

何賽，劉志芳，李瑞瑋

1.云南省第三人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，云南 昆明 650011；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650011；3.云南省第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南 昆明 650011

乳腺癌是一類異質(zhì)性腫瘤，根據(jù)基因表達(dá)譜，通?？蓪⑵浞譃? 種亞型：Luminal A 型、Luminal B 型、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）陽(yáng)性型、正常細(xì)胞樣型（normal-like）和基底型乳腺癌（basal-like breast cancer，BLBC）［1］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指癌組織免疫組織化學(xué)法檢測(cè)雌激素受體（estrogen receptor alpha，ERα）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和Her-2 均為陰性的乳腺癌（占15% ～20%），相對(duì)于基因表達(dá)譜的檢測(cè)方法，免疫組織化學(xué)法的分型檢測(cè)更省時(shí)簡(jiǎn)便，因此TNBC的概念在臨床上使用廣泛［2］。TNBC 是乳腺癌治療的難點(diǎn)及研究熱點(diǎn)，TNBC 確診后，存活期超過5 年的患者僅26.9%［3-4］。因此，研究TNBC新的治療方法具有重要意義。

近年來的大量研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）在生命活動(dòng)中具有重要調(diào)節(jié)功能，并發(fā)揮重要作用。lncRNA 表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，lncRNA 起著非常關(guān)鍵的作用［5-6］。從調(diào)控水平上來說，lncRNA 可在表觀水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用［7］。研究表明，lncRNA NKILA 可與炎癌轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵信號(hào)通路NF-κB 相互作用，通過結(jié)合NFκB／IκB 抑制IkB 激酶（IκB kinase，IKK）誘導(dǎo)的IκB磷酸化，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移［8］。也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TROJAN通過泛素化促進(jìn)ZMYND8降解，從而促進(jìn)TNBC 的增殖及轉(zhuǎn)移，其在TNBC 細(xì)胞中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)［9］。lncRNA 參與乳腺癌的耐藥調(diào)控也有報(bào)道，如lncRNA GAS5、HOTAIR與乳腺癌他莫昔芬耐藥密切相關(guān)［10-13］。因此，研究lncRNA 為解析乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新視角，并具有重要意義。目前尚未見有關(guān)lncRNA FRAPT的報(bào)道，因此，本研究在TNBC 細(xì)胞中表達(dá)了lncRNA FRAPT，并分析其對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及耐藥的影響，為TNBC的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及siRNA 人TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231、HCC1806）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)，分別用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640、F12 培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；lncRNA FRAPT 的siRNA（si-lncRNA FRAPT-1#、si-lncRNA FRAPT-2#）、siRNA 陰性對(duì)照（si-Ctrl）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000 試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、RPMI1640、F12培養(yǎng)基購(gòu)自深圳碩擎生物技術(shù)有限公司；化療藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作，將si-lncRNA FRAPT-1#、si-lncRNA FRAPT-2#和si-Ctrl（陰性對(duì)照）分別與40 nmol／L寡核苷酸和LipofectamineTM2000 試劑混合后，轉(zhuǎn)染MDAMB-231、HCC1806細(xì)胞，48 h 后，收集細(xì)胞。

1.4 生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用scRNASeqDB及TCGA 在線生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)，分析lncRNA FRAPT在TNBC中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 沉默lncRNA FRAPT 對(duì)細(xì)胞增殖能力影響的檢測(cè) 采用磺酰羅丹明B（Sulforhodamine B，SRB）試驗(yàn)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231、HCC1806細(xì)胞，以1×104個(gè)／孔接種96 孔板，分別加入RPMI1640和F12 培養(yǎng)基，100 μL／孔，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、24、48、72 h后加入10%TCA溶液，200 μL／孔，固定24 h；棄固定液，1×PBS洗滌1次，加入SRB 溶液，室溫?fù)u床10 min；加入Tris-HCl 溶解，200 μL／孔，用酶標(biāo)儀于530 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。

1.6 沉默lncRNA FRAPT 對(duì)細(xì)胞周期影響的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。將MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，加入75%酒精，4 ℃固定過夜；重新懸浮在0.6%NP-40溶液中，每1×106個(gè)細(xì)胞中加入1 μL 10 mg／mL PI及1μL 100mg／mL RNaseA（PI終濃度為0.1mg／mL，RNaseA 終濃度為1 mg／mL），避光染色30 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 沉默lncRNA FRAPT對(duì)細(xì)胞耐藥性影響的檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231、HCC1806 細(xì)胞，以2×104個(gè)／孔接種96 孔板，每孔分別加入RPMI1640和F12 培養(yǎng)基，100 μL／孔，置37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，加入PTX處理細(xì)胞，20 μmoL／（L·孔），分別在培養(yǎng)0、24、48、72 h后加入10%TCA溶液，200 μL／孔，固定24 h，其他步驟同1.5項(xiàng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA FRAPT 在TNBC 中的表達(dá)及預(yù)后分析 分析發(fā)現(xiàn)，TNBC中有許多差異化表達(dá)的lncRNA，見圖1。選取10個(gè)在芯片檢測(cè)結(jié)果中差異表達(dá)前10的候選基因進(jìn)行后續(xù)分析，見表1。ENCORI 網(wǎng)站工具（http：／／starbase.sysu.edu.cn／index.php）預(yù)后相關(guān)性分析顯示，這些高表達(dá)于TNBC 的lncRNA 中，lncRNA FRAPT 高表達(dá)與患者較差的預(yù)后呈正相關(guān)，研究對(duì)象的生存時(shí)間從隨機(jī)化時(shí)開始計(jì)算，因此最開始時(shí)兩組研究對(duì)象的生存率均為100%（生命值均為100%）。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組研究對(duì)象的生存率持續(xù)下降，但lncRNA FRAPT 高表達(dá)組（綠線）下降速度較快，即Hazard大于低表達(dá)組（棕線），綠線一直處于棕線上方，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Hazard Ratio=1.66，P=0.047）。見圖2。表明lncRNA FRAPT可能在TNBC 中發(fā)揮重要功能。因此，選擇lncRNA FRAPT用于后續(xù)功能研究。

圖1 TNBC 和癌旁組織基因差異化表達(dá)分析熱圖（A）及火山圖（B）Fig.1 Heat map（A）and volcanic map（B）of differential expression gene analysis of TNBC and adjacent tissues

圖2 lncRNA FRAPT臨床預(yù)后相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of clinical prognosis of lncRNA FRAPT

表1 TNBC和癌旁組織基因差異表達(dá)前10的候選基因Tab.1 Top 10 candidate genes differentially expressed in TNBC and adjacent tissues

2.2 沉默lncRNA FRAPT對(duì)TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響 敲低lncRNA FRAPT 可顯著抑制MDAMB-231 細(xì)胞生長(zhǎng)，24 h 后細(xì)胞增殖能力始終低于陰性對(duì)照組，72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（si-lncRNA FRAPT-1#：t= 9.731，P= 0.010 4；si-lncRNA FRAPT-2#：t=6.913，P=0.002 3），見圖3。與陰性對(duì)照組相比，silncRNA FRAPT-1#和si-lncRNA FRAPT-2#組S期細(xì)胞占比明顯降低（t分別為21.35和20.77，P均＜0.000 1），細(xì)胞周期被阻滯在G1期，見圖4和圖5，提示lncRNA FRAPT在TNBC細(xì)胞中發(fā)揮重要功能。

圖3 敲低lncRNA FRAPT 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of knocking down lncRNA FRAPT on proliferation of MDA-MB-231 cells

圖4 TNBC細(xì)胞周期變化情況的流式細(xì)胞圖Fig.4 Flow cytometry of cell cycle changes in TNBC cells

圖5 沉默lncRNA FRAPT對(duì)TNBC細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of silencing lncRNA FRAPT on TNBC cell cycle

2.3 沉默lncRNA FRAPT 對(duì)TNBC 細(xì)胞耐藥性的影響 沉默lncRNA FRAPT 的TNBC 兩個(gè)細(xì)胞系對(duì)PTX的耐藥性均降低。處理72 h后，與陰性對(duì)照組相比，si-lncRNA FRAPT-1#和si-lncRNA FRAPT-2#組MDA-MB-231 和HCC1806 細(xì)胞對(duì)PTX 的耐藥性均顯著降低（t分別為51.43和49.85，P分別為0.004和＜0.001；t分別為11.00 和14.10，P分別為0.008 2 和0.001）。見圖6。表明在沉默lncRNA FRAPT 的兩個(gè)細(xì)胞系中，PTX 有效性較陰性對(duì)照組得到顯著增強(qiáng)，lncRNA FRAPT 在TNBC 中高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

圖6 敲低lncRNA FRAPT 的HCC1806（A）和MDA-MB-231細(xì)胞（B）對(duì)PTX的耐藥性Fig.6 PTX resistance of HCC1806（A）and MDA-MB-231（B）cells knocked down lncRNA FRAPT

3 討論

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，2018 年全球約有210萬乳腺癌新發(fā)病例和63萬乳腺癌死亡病例，乳腺癌發(fā)病率和死亡率均居女性癌癥第1位［10-11］。目前乳腺癌的治療方法通常包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療以及靶向治療，盡管這些方法明顯提高了乳腺癌患者的生存率，但治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題仍然未得到很好解決。尤其是TNBC與其他乳腺癌相比，具有異質(zhì)性高、發(fā)病年齡早、臨床分期晚且更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，且TNBC不表達(dá)ERα、PR、Her-2，缺少有效的治療靶點(diǎn)，不能進(jìn)行內(nèi)分泌治療和抗Her-2靶向治療，一般采用化療［14-15］。因此，亟待對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行深入研究，以便尋找有效的治療方法。

PTX 是乳腺癌治療中常用的化療藥物，但乳腺癌細(xì)胞對(duì)PTX的耐藥性嚴(yán)重影響臨床治療效果［16-17］。目前，乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制尚不清楚?；虻漠惓１磉_(dá)可能影響腫瘤對(duì)PTX 等化療藥物的敏感性。lncRNA 參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療耐性，可作為逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐性的分子靶點(diǎn)。

許多研究表明，lncRNA 在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能。lncRNA表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病甚至腫瘤發(fā)生，且其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［7，18-21］。本研究數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA FRAPT 在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加，提示其在乳腺癌中發(fā)揮重要作用。lncRNA FRAPT是一條全新的lncRNA，目前尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FRAPT 可顯著促進(jìn)TNBC 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期，且可以在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。干擾lncRNA FRAPT的表達(dá)降低了TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231和HCC1806對(duì)化療藥物PTX的敏感性。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合lncRNA FRAPT 反義寡核酸反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）抑制劑，加上化療藥物的使用，可為TNBC 的進(jìn)展和耐藥性提供新的思路，也為TNBC 的治療提供新的策略。

綜上所述，TNBC 組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA FRAPT高表達(dá)，敲低lncRNA FRAPT 可顯著抑制TNBC 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期，并增強(qiáng)了TNBC 細(xì)胞對(duì)化療藥物PTX的敏感性。進(jìn)一步明確了lncRNA FRAPT在TNBC中的作用具有重要意義和潛在臨床價(jià)值。本研究為體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，后期需要從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床隊(duì)列研究的角度進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。