GⅠ.1型人札如病毒的體外培養(yǎng)及其衣殼蛋白VP1多克隆抗體的制備

杜文靜，劉丹，叢鑫，龐立麗，毛彤瑤，段招軍

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

札如病毒（sapovirus，SaV）為杯狀病毒科札幌病毒屬成員，于1976 年首次在英國人腹瀉糞便樣本中發(fā)現(xiàn)，是引起人及動(dòng)物急性胃腸炎的重要非細(xì)菌性病原體，各年齡段人群均可被感染并導(dǎo)致疾病的發(fā)生［1-2］。

SaV為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長7 100 ～7 700 bp，編碼2 或3 個(gè)開放閱讀框（open reading flame，ORF），其中ORF1 編碼1 個(gè)大的多聚蛋白，隨后被切割為6 個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4、NS5 和NS6-7）和1 個(gè)主要衣殼蛋白VP1；ORF2編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2；ORF3 編碼1 個(gè)小的堿性蛋白，但其功能尚不明確［3-4］。根據(jù)VP1基因的多樣性，SaV 被分為5 個(gè)基因群（GⅠ～GⅤ），其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ主要感染人［3-9］。2015 年，OKA 等［4］根據(jù)完整VP1核苷酸序列，又將人SaV（HuSaV）進(jìn)一步分為17個(gè)基因型，即GⅠ.1 ～7、GⅡ.1 ～7、GⅣ.1和GⅤ.1 ～2。

雖然SaV 已發(fā)現(xiàn)幾十年，但體外培養(yǎng)的完整體系尚未建立，嚴(yán)重阻礙了其進(jìn)一步研究。目前僅有少數(shù)幾株豬SaV 成功在原代豬腎細(xì)胞或豬腎細(xì)胞系（即LLC-PK1）中獲得培養(yǎng)，而這些毒株的成功培養(yǎng)依賴于豬腸內(nèi)容物或膽汁酸的存在［10-12］。膽汁酸的存在是病毒從內(nèi)體逃逸至細(xì)胞質(zhì)以啟動(dòng)病毒復(fù)制的關(guān)鍵［13-15］。由于HuSaV 具有高度的遺傳多樣性，隨著研究的深入及時(shí)間的推移，新基因群或基因型還可能會(huì)出現(xiàn)，這將給檢測(cè)、治療及防控帶來更多的困難。為此，本研究對(duì)GⅠ.1 型HuSaV 進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)及其VP1 蛋白多克隆抗體的制備，以期為進(jìn)一步研究該病毒的感染機(jī)制及血清學(xué)診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本、載體及細(xì)胞 GⅠ.1型HuSaV陽性糞便標(biāo)本和pGEX-6P-1 載體均由中國疾病預(yù)防中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室保存；人十二指腸腺癌細(xì)胞（HuTu-80）購自ATCC；E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2 只SPF 級(jí)新西蘭大白兔，6 ～8 月齡，雌性，體質(zhì)量2.5 kg，購自蘇州博奧龍科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2022-0004。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且嚴(yán)格按照中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（20200921048）。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM和FBS購自美國Gibco公司；甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）、甘氨膽酸（GCA）、IPTG 和弗氏佐劑購自美國Sigma 公司；SuperScript?Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Invitrogen 公司；預(yù)染蛋白marker 購自加拿大Fermentas 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自英國Abcam 公司；谷胱甘肽瓊脂糖磁珠和凝膠層析純化柱Superdex20010／600GL購自美國GE Healthcare Life Sciences 公司；QIAGEN One-step RT-PCR 和IAamp 病毒RNA 提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Quick Taq HS購自日本Toyobo公司。

1.4 GⅠ.1型HuSaV糞便懸液及稀釋液的制備 在生物安全柜內(nèi)取GⅠ.1 型HuSaV 陽性糞便標(biāo)本并稱重，取0.5 g，加入4.5 mL 無菌DMEM，混勻，用渦旋振蕩器反復(fù)振蕩3 ～4次，4 ℃，1 800×g離心20 min；收集上清至潔凈無菌離心管中，重復(fù)離心1 次；用0.45 和0.22 μm 的濾膜分別過濾離心后的糞便濾液，分裝10%糞便懸液，100 μL／管，置-80 ℃保存。將10%糞便懸液按1∶10 比例用無菌DMEM 稀釋：取10 μL 10%糞便懸液（2×108拷貝／μL），加至90 μL DMEM 中，混勻，得到1∶10 的工作液；再取100 μL 1∶10 工作液，加至900 μL DMEM 中，混勻，得到1∶100的10%糞便懸液。

1.5 HuSaV感染HuTu-80細(xì)胞及其在細(xì)胞中生長動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 將生長狀態(tài)良好的HuTu-80 細(xì)胞均勻接種于7.5 cm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至70% ～80%單層后棄去上清，加入100 μL 制備的病毒稀釋液（約2×106個(gè)拷貝數(shù)），同時(shí)分別添加終濃度為500 μmol／L的GCDCA或1 000 μmol／L GCA，每種膽酸鹽設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加病毒稀釋液的細(xì)胞作為陰性對(duì)照［16］，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；用500 μL 無血清DMEM 洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿3 次，加入1 mL 含2% ～3%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d；取各培養(yǎng)皿細(xì)胞上清液，利用病毒RNA 提取試劑盒提取病毒RNA，通過SuperScript?Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以其為模板，用Quick Taq HS PCR擴(kuò)增VP1基因（279 bp）。上游引物1245Rfwd：5'-TAGTGTTTGARATGGAGGG-3'；下游引物SV-G1-R：5'-CCCBGGTGGKAYGACAGAAG-3'，SV-G2-R：5'-CCANCCAGCAAACATNGCRCT-3'，SV-G4-R：5'-GCGTAGCAGATCCCAGATAA-3'，SV-G5-R：5'-TTGGAGGWTGTTGCTCCTGTG-3'（確定膽酸鹽的選擇）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃2 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，68 ℃25 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃7 min。

為確定GⅠ.1 型HuSaV 感染HuTu-80 細(xì)胞不同時(shí)間的感染動(dòng)力學(xué)，采用上述病毒液接種方式，同時(shí)添加1 000 μmol／L選擇的膽酸鹽，分別于感染后1、3、5 和7 d 收獲細(xì)胞上清液，于-80 ℃保存，提取病毒RNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，引物及探針設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［16］。首先制備標(biāo)準(zhǔn)品：取2 μL濃度為1011拷貝／μL的RNA加入18 μL DEPC水中，渦旋振蕩混勻后，取10 μL加入90 μL DEPC 水中，依次稀釋，直至100拷貝／μL。利用QIAGEN One-step RT-PCR 試劑盒對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-qPCR。

1.6 不同代次GⅠ.1型HuSaV對(duì)HuTu-80細(xì)胞感染性的檢測(cè) 將P1、P2、P3 代次病毒液（約1.5 × 106拷貝）分別接種HuTu-80細(xì)胞，同時(shí)添加1 000 μmol／L選擇的膽酸鹽，分別于感染后1、3、5 d收獲細(xì)胞上清液，提取病毒RNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。每代次不同時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7VP1基因的擴(kuò)增 根據(jù)GⅠ.1 型HuSaV 基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP1全長基因引物。上游引物：5'-GAGGATCCATGGAGGGCAATGGCTCCAATTC-3'（斜體部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-ACGCGTCGACTCATTGGAACACCCGTCTGGCC-3'（斜體部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為1 686 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。利用QIAamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA，通過SuperScript?Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：98 ℃30 s；98 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。

1.8 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用DNA膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，通過T4DNA 連接酶連接至同樣經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的載體pGEX-6P-1 中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP1，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板，隨機(jī)挑取單個(gè)陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序分析。

1.9 重組VP1 蛋白的表達(dá)及純化 將測(cè)序正確的陽性菌液按1%比例轉(zhuǎn)接至新的1.5 L LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 ～4 h，待菌液A600達(dá)0.6 ～1.0時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol／L 的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)過夜；7 000×g離心10 min，棄上清，收集菌體，PBS 重懸，置于冰浴中超聲破碎（功率80%，超聲4 s，間隔7 s）90 min；4 ℃，16 000×g離心60 min，0.45 μm 濾膜過濾上清并留取樣本；同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒pGEX-6P-1 轉(zhuǎn)化后并誘導(dǎo)菌液作為陰性對(duì)照。利用谷胱甘肽進(jìn)行蛋白純化：取過濾上清，與谷胱甘肽瓊脂糖磁珠混合，置于翻轉(zhuǎn)搖床中，4 ℃結(jié)合；用25 mL PBS 清洗7 次，加入3C 蛋白酶去除GST 蛋白標(biāo)簽，4 ℃翻轉(zhuǎn)過夜；于親和層析柱中收取流穿液，獲得目的蛋白。12%SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定表達(dá)及純化產(chǎn)物。

1.10 動(dòng)物免疫 按照每劑500 μg 將純化的VP1 蛋白與弗氏佐劑混合，單劑組分：VP1 抗原380 μL，佐劑500 μL，120 μL 0.9% NaCl。經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射2 只新西蘭大耳白兔，1 mL／只，注射前采集少量兔耳中動(dòng)脈血作為陰性對(duì)照。于18、28、38 d按照初次免疫相同方法分別加強(qiáng)免疫1次。

1.11 血清效價(jià)的檢測(cè) 免疫后18、28、38 和48 d 采集兔耳中動(dòng)脈血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)：將濃度為2 μg／mL 純化VP1 蛋白包被96 孔酶標(biāo)板，60 μL／孔，4 ℃孵育過夜；PBS-T 洗滌3 次，加入5%脫脂乳，250 μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBS-T 洗滌3次，加入倍比稀釋的待測(cè)血清（起始稀釋度為1∶500），60 μL／孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性血清對(duì)照孔，37 ℃孵育2 h；PBS-T 洗滌3次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋），60 μL／孔，37 ℃孵育1 h；TMB顯色，1%NaF終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphpadPrism7.0軟件（Graph-Pad Software，CA，USA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HuSaV體外培養(yǎng)膽酸鹽的選擇 GⅠ.1型HuSaV感染的HuTu-80 細(xì)胞添加GCDCA 或GCA 培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞上清的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見279 bp的特異條帶，大小與預(yù)期一致，且GCA能有效促進(jìn)病毒對(duì)細(xì)胞的感染。見圖1。

圖1 HuSaV感染的HuTu-80的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of HuTu-80 infected by HuSaV

2.2 GⅠ.1型HuSaV 在HuTu-80細(xì)胞中的生長動(dòng)力學(xué)分析 GⅠ.1 型HuSaV 感染HuTu-80 細(xì)胞并添加GCA后，病毒滴度從感染后1 d的2 log10拷貝／140 μL快速增加至3 d 的4.1 log10拷貝／140 μL，5 d 時(shí)達(dá)病毒增殖平臺(tái)期（約4.5 log10拷貝／140 μL），見圖2。表明GⅠ.1 型HuSaV 感染HuTu80 細(xì)胞后可顯著增殖。

圖2 GⅠ.1型HuSaV在HuTu-80細(xì)胞中的生長動(dòng)力學(xué)Fig.2 Growth kinetics of HuSaV GI.1 in HuTu-80 cells

2.3 不同代次GⅠ.1型HuSaV對(duì)HuTu-80細(xì)胞的感染性 RT-qPCR 結(jié)果顯示，P1、P2、P3 代次GⅠ.1 型HuSaV 均可感染HuTu-80 細(xì)胞，且各代次病毒感染后3、5 d 與1 d 相比，RNA 拷貝數(shù)均顯著上升（P1：F= 143.5，P＜0.000 1；P2：F= 41.04，P= 0.000 3；P3：F= 124.3，P＜0.000 1），見圖3。表明GⅠ.1 型HuSaV在HuTu-80細(xì)胞中能穩(wěn)定連續(xù)傳3代次。

圖3 不同代次GⅠ.1型HuSaV感染性的鑒定Fig.3 Identification of infectivity of different passages of HuSaV GⅠ.1

2.4VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 686 bp 的特異性片段，大小與預(yù)期一致，見圖4。

圖4 VP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of PCR product of VP1 gene

2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-GⅠ.1-VP1經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，可見4 984 bp的載體片段和1 686 bp的目的基因片段，大小均與預(yù)期一致，見圖5。測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-GⅠ.1-VP1的雙酶切（BamHⅠ／SalⅠ）鑒定Fig.5 Restriction map of recombinant expression plasmid pGEX-GⅠ.1-VP1（BamHⅠ／SalⅠ）

2.6 表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定 12%SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)的重組GST-VP1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約86 000，純化后約60 000（切除GST 標(biāo)簽），經(jīng)薄層掃描分析，純化蛋白與重組蛋白約占總蛋白的70%和35%；而誘導(dǎo)的空質(zhì)粒pGEX-6P-1 可見相對(duì)分子質(zhì)量約26 000的GST條帶。見圖6。

圖6 表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expressed and purified products

2.7 兔血清效價(jià) ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的抗HuSaV VP1 蛋白多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶12 800 以上，見圖7。

圖7 2只兔的抗血清效價(jià)測(cè)定Fig.7 Determination of antiserum titers of two rabbits

3 討論

SaV被分為5個(gè)基因群（GⅠ～GⅤ），其中GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤSaV 是引起人群急性胃腸炎散發(fā)和暴發(fā)的主要原因之一，常在托兒所、護(hù)理中心、學(xué)校、軍事機(jī)構(gòu)、醫(yī)院等人口密集場(chǎng)所暴發(fā)群體性或散發(fā)感染，給人類帶來一定的疾病負(fù)擔(dān)［1，17-19］。SaV 與諾如病毒一樣，進(jìn)化速率較快，基因重組和氨基酸位點(diǎn)突變的積累均可擴(kuò)大病毒的多樣性，并進(jìn)化出新的變異毒株。在世界范圍內(nèi)，GⅠ和GⅡ是主要的流行毒株，但近年來從患有嚴(yán)重胃腸炎兒童體內(nèi)分離出另一種新的重組GⅡ.NA 型HuSaV［6，8，20］。目前全球尚無特異性藥物或疫苗用于治療和預(yù)防HuSaV感染。

HuSaV 的體外分離培養(yǎng)是研究其感染及致病機(jī)制的前提。研究者一直嘗試用多種原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞培養(yǎng)HuSaV，但均未獲得成功。近年，HuSaV的體外培養(yǎng)取得了突破性進(jìn)展，研究顯示，HuSaV 可在添加膽酸鹽（GCA 或GCDCA）的HuTu-80 細(xì)胞中復(fù)制及增殖［16］。因此，本研究以GⅠ.1 型HuSaV 為研究對(duì)象，將其接種添加GCDCA 或GCA 的HuTu-80細(xì)胞，結(jié)果顯示，GCA 能夠有效促進(jìn)HuSaV 對(duì)HuTu-80細(xì)胞的感染及增殖，但GCDCA 未如上述文獻(xiàn)報(bào)道促進(jìn)HuSaV 的感染，分析原因可能國內(nèi)GⅠ.1 型HuSaV 與國外毒株對(duì)膽酸鹽的敏感性存在一定差異。相關(guān)研究顯示，膽汁或膽酸鹽的淤積能引起免疫功能障礙，并干擾內(nèi)源性干擾素活性［21-22］。干擾素自1956 年發(fā)現(xiàn)以來，一直被認(rèn)為是抵抗病毒天然免疫的關(guān)鍵成分［23-24］。推測(cè)這可能是GCA促使HuSaV在HuTu-80 細(xì)胞中增殖的原因。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著病毒感染代次增加，其增殖能力有衰減趨勢(shì)，分析可能該毒株對(duì)HuTu-80 細(xì)胞感染適應(yīng)性并不十分理想，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步重復(fù)連續(xù)傳代觀察，以確證該毒株在體外是否具有穩(wěn)定傳代能力，為研究其感染及暴發(fā)流行機(jī)制等提供數(shù)據(jù)支持。近年來，實(shí)驗(yàn)室對(duì)SaV 的診斷及流行檢測(cè)除電鏡觀察其形態(tài)外，最常用的方法是ELISA 和RT-PCR［25-26］。而SaV VP1 蛋白屬于衣殼蛋白，是完整病毒的主要組成部分［4］。因此，本研究用VP1 蛋白免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體也將為HuSaV的鑒定提供新方法。