豬外周血淋巴細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白的拓?fù)鋵W(xué)分析及其在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染后轉(zhuǎn)錄水平的變化

蒙小剛，宋揚，2，3，魯會軍，霍曉偉，呂香玉，劉鍇，溫樹波，2，3

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)布魯氏菌病防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)人畜共患病創(chuàng)新研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130012

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的主要病原，可引起妊娠母豬流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎及仔豬呼吸困難等臨床癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［1］。PRRSV 是一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為15 000 bp，主要分為基因1型（歐洲型）和基因2型（美洲型），含有包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3 ～ORF7以及ORF5a 在內(nèi)的10 個開放閱讀框［2］。PRRSV 目前在我國廣泛流行，由于其具有較強的突變能力，出現(xiàn)了多種新毒株，且易與其他病原發(fā)生混合感染，為其防控帶來了很大困難［3］。

PRRSV 是一種具有嚴(yán)格細(xì)胞噬性的病毒，目前用來研究PRRSV 體外感染使用最多的傳代細(xì)胞系是Marc145（非洲綠猴腎細(xì)胞），但因該細(xì)胞并非豬源細(xì)胞，不適用于作為研究與自然宿主相關(guān)實驗的體外模型。豬外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lymphocytes，PBMCs）是豬血液中的主要免疫細(xì)胞，包括T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞等，在病毒入侵血液循環(huán)系統(tǒng)后發(fā)揮重要的抗病毒天然免疫反應(yīng)［4］，也是病毒入侵血液的主要靶細(xì)胞。另外，相較于豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM），PBMCs還具有取材方便、易制備等優(yōu)勢，因此，PBMCs 作為體外實驗?zāi)Ｐ?，在研究PRRSV 與宿主相互作用方面具有一定的潛力。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白（IFN-induced transmembrane，IFITM）是在哺乳動物細(xì)胞中高度保守且廣泛表達(dá)的一類跨膜蛋白。其中，IFITM1、IFITM2 和IFITM3 可發(fā)揮抗病毒作用。自首次報道其抗病毒作用以來［5］，已發(fā)現(xiàn)其可對包括流感病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒等多科病毒具有抑制作用［6-8］。目前關(guān)于IFITM分子在PBMCs應(yīng)對外源病毒入侵過程中發(fā)揮的作用尚不明確，研究PRRSV 與PBMCs 來源的IFITM 分子的相互作用對闡明PRRSV 免疫逃逸和抗PRRSV 天然免疫應(yīng)答機制具有重要意義。

本實驗旨在分離原代豬PBMCs，并以其為感染模型，分析PRRSV 體外感染PBMCs 后宿主IFITM 分子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化，為研究機體抗PRRSV 天然免疫應(yīng)答機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體及細(xì)胞 PRRSV GXBB16-1株由軍事獸醫(yī)研究所病毒感染與免疫全軍基因工程重點實驗室分離并鑒定，在Marc145 細(xì)胞穩(wěn)定傳代10 代后收獲的細(xì)胞毒，病毒滴度為10-4.5TCID50／mL；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實驗動物 4 周齡仔豬為合作豬場飼養(yǎng)的普通長白豬。

1.3 主要試劑及儀器 Primer 9、ExTaq DNA 聚合酶、dNTP 和DNA marker DL2000 均購自寶生物工程（大連）有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液和RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；UNIQ-10柱式Trizol 總RNA 提取試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑和SYBR GreenⅠ熒光染料購自美國Promega 公司；50×TAE 溶液購自北京索萊寶科技有限公司；豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自天津灝洋生物制品有限責(zé)任公司；溫度梯度PCR 儀和Fast7500 熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI 登錄的豬β-actin（DQ452569）、IFITM1（JQ315414）、IFITM2（JQ315-415）、IFITM3（JQ315416）基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性qRT-PCR引物，并參考文獻(xiàn)［9］合成豬IFITM全長擴增引物，引物序列和擴增目的條帶大小見表1，引物由吉林庫美生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 豬原代PBMCs 的分離培養(yǎng) 經(jīng)前腔靜脈采集4周齡仔豬抗凝血5 mL，經(jīng)ELISA 法檢測PRRSV、豬圓環(huán)病毒2（porcine circovirus 2，PCV2）和乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）血清抗體均為陰性。按照豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒說明書分離豬PBMCs，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸后計數(shù)，按照1 × 106個／孔接種至12 孔板中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，按照0.1 MOI 接種PRRSV，對照組接種RPMI1640 培養(yǎng)液。分別于病毒接種后第12、24、36、48 h 收集細(xì)胞樣品。

1.6 PBMCs總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 使用UNIQ-10柱式Trizol 總RNA 提取試劑盒提取收集到的PBMCs樣品的中RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用酶標(biāo)儀檢測其A260與A280比值，將比值在1.8 ～2.0 的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置-20 ℃冰箱中保存。

1.7 豬IFITM編碼區(qū)全長克隆 以PBMCs cDNA 為模板，用全長擴增引物擴增豬IFITMCDS 區(qū)全長序列。反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，用去離子水將總體系補至25 μL。同時設(shè)置ddH2O 為空白對照。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，吸取100 μL 菌液，涂布于含50 μg／mL Amp 的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃正置培養(yǎng)1 h，倒置培養(yǎng)12 ～16 h；挑取陽性克隆菌落進(jìn)行PCR 鑒定，鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.8 豬IFITM 拓?fù)鋵W(xué)分析及氨基酸序列比對 將測序獲得的序列通過ClustalX 軟件比對后，分別利用TMHMM 2.0 和SOSUI 在線跨膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)分析工具對豬IFITM 蛋白進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。從NCBI 下載不同物種來源的IFITM 氨基酸序列，通過DNA star軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析。

1.9 PRRSV體外感染PBMCs及qRT-PCR檢測 將PRRSV 按照0.1 MOI 接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的PBMCs 中，分別于感染后第12、24、36 和48 h 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。收集感染組和對照組（未感染病毒）細(xì)胞樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，按照SYBR GreenⅠqPCR檢測試劑盒說明書，使用qRT-PCR 引物，通過qPCR 檢測目的基因IFITMsmRNA轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40個循環(huán)。采用相對定量法，根據(jù)各樣品獲得的Ct值［（目的基因Ct值- 內(nèi)參基因Ct值）試驗組-（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）對照組］，計算2-ΔΔCt值，求出IFITMs基因相對轉(zhuǎn)錄水平的變化。將不同時間點樣本獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，試驗組以對照組的相對倍數(shù)表示，利用GraphPad 軟件作圖。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豬PBMCs的分離培養(yǎng) 經(jīng)水平離心機離心后的豬外周抗凝血樣品可成功分為4 層，從上至下分別為淡黃色的血漿層、乳白色的淋巴細(xì)胞層、透明的分離液層及紅色的紅細(xì)胞層。吸取第2 層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，經(jīng)多次洗滌后用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，即獲得PBMCs 懸液，計數(shù)后凍存或接種細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 豬PBMCs的分離Fig.1 Isolation of porcine PBMCs

2.2 豬PBMCsIFITM基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的鑒定1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，用豬IFITM全長擴增引物進(jìn)行PCR 擴增，成功獲得了豬IFITM1、IFITM2和IFITM3全長片段，大小均與預(yù)期相符，見圖2。測序結(jié)果經(jīng)比對，與NCBI 登錄的豬IFITM基因序列一致。

圖2 豬PBMCs IFITM基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of RT-PCR products of IFITM gene from porcine PBMCs

2.3 豬PBMCs IFITM蛋白拓?fù)鋵W(xué)分析 經(jīng)在線拓?fù)鋵W(xué)預(yù)測工具TMHMM 2.0 和SOSUI 對豬PBMCs IFITM蛋白進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)3 種IFITM 蛋白均存在兩種可能的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)。其中TMHMM 2.0 分析結(jié)果顯示，3 種豬IFITM 蛋白N-端（N'）和C-端（C'）均位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，存在2個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（transmembrane domain，TMD）及1 個保守的胞內(nèi)環(huán)狀loop 結(jié)構(gòu)（conserved intracellular loop，CIL），見圖3A。SOSUI 分析結(jié)果顯示，3 種IFITM 蛋白可能存在另一種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即N-端和C-端分別位于胞質(zhì)內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，且存在2 個胞內(nèi)區(qū)（intermembrane domain，IMD）和1個TMD 以及2個CIL 結(jié)構(gòu)，見圖3B。另外，2個IMD和1個TMD均為α螺旋結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖3 豬IFITM蛋白拓?fù)鋵W(xué)模型圖Fig.3 Diagram of porcine IFITM protein topology model

圖4 SOSUI分析豬IFITM分子IMD1、IMD2和TMD3 α螺旋結(jié)構(gòu)模式圖Fig.4 Analysis of α helix pattern of IMD1，IMD2 and TMD3 of porcine IFITM by SOSUI

表2 TMHMM 2.0和SOSUI拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果Tab.2 Topology analysis of IFITM by TMHMM 2.0 and SOSUI

2.4 不同物種來源IFITM 氨基酸序列比對 不同物種來源的IFITM 氨基酸序列保守程度較高，SOSUI預(yù)測的CIL1、IMD2和CIL2區(qū)高度保守，3種IFITM分子的CD255 區(qū)均位于CIL1、IMD2 和CIL2 區(qū)。N-端和IMD1、TMD3 保守程度次之，C-端保守程度最低。見圖5。

圖5 不同物種來源IFITM分子氨基酸序列比對結(jié)果Fig.5 Comparison of amino acid sequences of IFITM molecules from different species

2.5 PBMCs 在體外對PRRSV 的易感性 顯微鏡下觀察顯示，未感染PRRSV 的PBMCs 大小均一，邊緣光滑，形態(tài)一致，呈單個散在分布生長于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上；感染PRRSV 24 h 后，PBMCs 出現(xiàn)破碎，細(xì)胞變小，邊緣不整，形態(tài)不一，不規(guī)則，且與周圍細(xì)胞聚集呈小團分布于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，表現(xiàn)為明顯的細(xì)胞病變。見圖6。提示體外PBMCs對PRRSV 具有較好的易感性。

圖6 PRRSV感染PBMCs 24 h的顯微鏡觀察（×100）Fig.6 Microscopy of PBMCs infected with PRRSV for 24 h（×100）

2.6 PRRSV 在PBMCs中的復(fù)制 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，PRRSV 感染PBMCs 后12、24、36 和48 h，用PRRSV 特異性引物均可擴增出單一的特異性條帶，見圖7。

圖7 PCR 檢測PRRSV 感染PBMCs 不同時間病毒的復(fù)制水平Fig.7 PCR detection of PRRSV replication levels in PBMCs infected with PRRSV for different time durations

2.7 PBMCs 中IFITMs基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，PRRSV 感染PBMCs 后12、24 和36 h，IFITM1、IFITM2和IFITM3基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，且3 種基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均在病毒感染早期上調(diào)最為顯著，其中IFITM1和IFITM3基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別在病毒感染后第12 和24 h上調(diào)最為顯著（df=4，P均=0.000 7），IFITM2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平在病毒感染后第12和24 h上調(diào)顯著（df=4，P分別為0.003 2 和0.001 3）；3 種IFITM基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在病毒感染后期有逐漸下降的趨勢，至病毒感染后第48 h，IFITM1和IFITM3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)已不顯著。見圖8。

圖8 PRRSV 感染PBMCs 不同時間IFITM1（A）、IFITM2（B）、IFITM3（C）基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcriptional levels of IFITM1（A），IFITM2（B）and IFITM3（C）mRNA in PBMCs infected with PRRSV for different time durations

3 討論

病原在入侵宿主后，其核酸作為主要的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）被位于宿主核內(nèi)體和胞質(zhì)中的特異性模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）所識別［10］，PAMPs與PRRs的特異性結(jié)合可誘導(dǎo)包括Ⅰ型IFN在內(nèi)的病毒應(yīng)答基因和促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而限制病毒復(fù)制或調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中，Ⅰ型IFN通過與其受體結(jié)合激活Janus激酶（Janus kinase，JAK）促進(jìn)下游STAT 蛋白轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物-干擾素刺激基因3（IFN-stimulated gene factor 3，ISGF3）轉(zhuǎn)位入核，并使STAT1 和STAT2 蛋白發(fā)生磷酸化［11］。核內(nèi)的ISGF3誘導(dǎo)上百種干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）的轉(zhuǎn)錄。這些ISGs編碼多種發(fā)揮不同生物學(xué)特性的蛋白，在病毒入侵、復(fù)制、蛋白翻譯、新病毒的包裝和釋放等不同階段發(fā)揮抗病毒作用［12］。有些ISGs編碼的蛋白還可通過募集白細(xì)胞或作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答底物發(fā)揮免疫調(diào)控作用。此外，一些ISGs也可不依賴IFN，在病毒感染后直接通過如IRF3 這樣的PRRs 下游轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄。

IFITM家族主要包括5個成員，其中包括屬于CD225超家族的成員IFITM1、IFITM2 和IFITM3。IFITM 蛋白是最早已知能夠抑制病毒入侵細(xì)胞的ISGs，一直是抗病毒天然免疫研究領(lǐng)域的熱點［8］。有研究報道，豬IFITM 可抑制豬偽狂犬病病毒、甲型流感病毒、JEV、PRRSV 和非洲豬瘟病毒等的復(fù)制［13-18］。IFITM發(fā)揮抗病毒作用可能的主要機制為通過抑制病毒囊膜與內(nèi)體膜融合或誘導(dǎo)膽固醇在晚期內(nèi)體中大量富集抑制包括核酸在內(nèi)的內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制病毒復(fù)制［19-23］。另外，IFITM 還可結(jié)合到病毒粒子表面，降低病毒感染活性，抑制病毒復(fù)制［20］。

目前，PRRSV 與宿主IFITM 蛋白之間的相互作用機制尚不明確，缺少體外豬源細(xì)胞感染模型是制約PRRSV 與宿主抗病毒天然免疫之間相互作用機制研究的重要瓶頸。PBMCs具有取材方便和容易制備等優(yōu)點，作為PRRSV 與宿主相互作用的體外細(xì)胞模型具有一定的潛力。本研究通過RT-PCR法成功擴增獲得了豬PBMCs源IFITMCDS區(qū)全長序列，經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)，與NCBI登錄的豬IFITM基因序列一致。鑒于拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)對跨膜蛋白發(fā)揮功能具有重要意義，本研究利用線上拓?fù)鋵W(xué)預(yù)測工具TMHMM 2.0 和SOSUI對豬IFITM 蛋白進(jìn)行了拓?fù)鋵W(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬IFITM 蛋白可能存在兩種拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)模式。此外，比對分析發(fā)現(xiàn)，不同物種來源的IFITM 分子氨基酸序列在CIL1、IMD2 和CIL2 區(qū)高度保守，推測該區(qū)域?qū)FITM發(fā)揮抗病毒作用具有重要作用。

體外攻毒試驗結(jié)合RT-PCR 檢測表明，PRRSV可在體外感染PBMCs，并可引起顯著的細(xì)胞病變，且PRRSV 還可在PBMCs中復(fù)制，表明PBMCs可作為研究PRRSV 與宿主相互作用的體外模型。與本實驗室前期以PAM 為研究模型的發(fā)現(xiàn)類似［24］，通過qRTPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，PRRSV 體外感染PBMCs 后，在感染早期，F(xiàn)ITMs的基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，推測IFITMs分子也參與PBMCs抗病毒免疫反應(yīng)。

RT-PCR結(jié)合qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在感染后期，病毒在細(xì)胞中的復(fù)制和IFITM基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，表明PBMCs 作為體外模型研究PRRSV與宿主相互作用機制也存在類似于PAM 的缺陷，即作為原代細(xì)胞，PBMCs 不能在體外長期存活。有研究發(fā)現(xiàn)［25］，PAM 永生化后喪失了感染PRRSV 的能力，而PBMCs 永生化后是否更適合作為PRRSV 體外感染模型值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PBMCs作為PRRSV體外感染模型，在研究宿主抗PRRSV 天然免疫應(yīng)答方面具有重要的應(yīng)用價值。