siRNA干擾C-C趨化因子配體5對喉癌細胞生物學(xué)特性的影響

牛麗，韓瑞，賀龍，王瑛，郭慧娜，皇甫輝

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山西 太原 030001；3.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室，山西 太原 030001

喉癌作為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。美國2020 年數(shù)據(jù)顯示，本土新增病例12 370 例，其中3 750 例患者死于喉癌［1］。目前喉癌中鱗狀細胞癌占比最高，約95%以上［2］。由于喉癌具有增殖快、侵襲強、遠處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性［3］，各環(huán)節(jié)易造成喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)。靶向治療作為近年治療熱點，對患者預(yù)后及生存有極大改善［4］。

siRNA主要用于沉默基因表達。與microRNA不同，siRNA是由外源性RNA分子引起的RNA干擾，通過與靶向mRNA 完全互補結(jié)合降解目的RNA［5］。通過siRNA 靶向目的基因，研究敲降該基因?qū)眵[狀細胞癌細胞生物學(xué)特性的影響，是目前相關(guān)研究的成熟方法。

C-C 趨化因子5（C-C chemokine ligand 5，CCL5）是聚集在17號染色體長臂上的幾個趨化因子基因之一。趨化因子參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程［6-8］。根據(jù)成熟肽N-端半胱氨酸殘基的排列，將超家族分為4 個亞家族。趨化因子是CC亞家族的一員，對血液單核細胞、記憶T 輔助細胞和嗜酸性粒細胞起趨化作用，可導(dǎo)致嗜堿性粒細胞釋放組胺，啟動嗜酸性粒細胞［9-11］。CCL5 在腫瘤形成中起到十分重要的作用，可促進肝纖維化導(dǎo)致肝臟惡化，進而促進肝癌形成［12］；CHEN等［13］研究發(fā)現(xiàn)，CCL5 可能促使頰黏膜向鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致癌變；研究還發(fā)現(xiàn)，CCL5 與多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移、耐藥等生物學(xué)特性密切相關(guān)［14-16］。本實驗通過研究CCL5 對喉癌細胞TU177 生物學(xué)特性的影響，進一步探討CCL5成為今后喉癌分子治療靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 在線數(shù)據(jù)檢索 從基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：／／gepia.cancer-pku.cn index.html）中，在線檢索CCL5在頭頸鱗狀細胞癌及正常組織中的表達情況：進入網(wǎng)站后點擊GoPIA!→Expression DIY→Box Plot，Gene 中輸入基因名，選擇頭頸鱗狀細胞癌，其余默認(rèn)，點擊Plot即可。

1.2 細胞 喉癌細胞TU177 由耳鼻咽喉頭頸腫瘤山西省重點實驗室提供。

1.3 主要試劑及儀器 胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)液購自武漢賽諾普生命科技有限公司；青鏈霉素混合液購自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000 購自美國賽默飛世爾公司；CCK8試劑盒購自美國APExBIO 生物科技有限公司；細胞周期試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑購自上海翊盛生物科技有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白梯度預(yù)制膠（4% ～20%）、PCR 試劑購自北京聚合美生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液、兔抗CCL5（PB06-53）、MRP2（BA1667）、Bax（BA0315-2）多克隆抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司；β-actin pAb（AP0060）購自南京巴傲得生物科技有限公司；流式細胞儀購自美國艾森公司（NovaCyte系列）。

1.4 細胞培養(yǎng) 將TU177 細胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 ～2 d 傳代1 次，待進入對數(shù)生長期開始后續(xù)試驗。

1.5 siRNA 轉(zhuǎn)染細胞 轉(zhuǎn)染前1天細胞傳代，當(dāng)細胞密度達70%時，更換為無雙抗培養(yǎng)基，進行轉(zhuǎn)染。設(shè)實驗組（siRNA）和對照組（NC），均參照lipofectamine 3000 說明書工作濃度進行操作：A 管為siRNA 或NC與opti-MEM 孵育5 min，B 管為Lipofectamine 3000 與opti-MEM 孵育5 min；將B 管加入A 管孵育15 min后，加至細胞板中，6 h后更換為完全培養(yǎng)基。siRNA序列正義鏈：5'-GCUGUCAUCCUCAUUGCUATT-3'，反義鏈：5'-UAGCAAUGAGGAUGACAGCTT-3'；NC正義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。由上海吉馬制藥技術(shù)有限公司合成。

1.6 RNA提取 在細胞板內(nèi)加入Trizol，300 μL／孔，混勻，各孔分別吸至1.5 mL 無酶離心管中，靜置5 min；加入氯仿，150 μL／管，劇烈振蕩混勻30 s，室溫靜置3 ～5 min；4 ℃，12 000 ×g離心15 min；將上層水相移至新無酶管中，加入等體積異丙醇，混勻，-20 ℃過夜沉淀；4 ℃，12 000×g離心10 min；收集沉淀，加入150 μL 75%乙醇，12 000×g離心5 min；收集沉淀，重復(fù)上一步，加入10 μL 無酶水，光譜儀檢測濃度。

1.7 RT-PCR法 將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進行RT-PCR 檢測。CCL5上游引物序列：5'-TCGCTGTCATCCTCATTGCTACTG-3'，下游引物序列：5'-GGTTGGAGCACTTGCCACTGG-3'；MRP2上游引物序列：5'-TCTTCAATAGCACCGACTATCC-3'，下游引物序列：5'-TATTTGATGCATGGACGAAACC-3'；Bax上游引物序列：5'-AAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3'，下游引物序列：5'-GTTCTGATCAGTTCCGGCAC-3'；18 s上游引物序列：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，下游引物序列：5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃5 min；42 ℃30 min；85 ℃5min。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸34 s，共40 個循環(huán)；對融解曲線分析。采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。

1.8 CCK8 法 將各組細胞以3× 103個／孔接種至96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，收集0 ～4 d同一時間點細胞，每孔加入10 μL CCK8與100 μL完全培養(yǎng)基混合液，37 ℃孵育1 h；檢測450 nm 處A值，按下式計算增殖率（%），并繪制生長曲線。

1.9 細胞劃痕試驗 6孔板背面每隔1 cm劃線后，按5 × 105個／孔接種細胞，細胞密度達70%時進行轉(zhuǎn)染，融合率達100%時進行劃痕，PBS 洗滌3 次，加入無血清培養(yǎng)基，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0、24 h取樣，拍照。按下式計算遷移率（%）。

1.10 流式細胞術(shù) 取對數(shù)生長期細胞，按5×105個／孔接種6孔板中，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至正常生長階段，進行轉(zhuǎn)染，48 h后，收集細胞上流式細胞儀檢測。

1.11 Western blot法 提取各組細胞總蛋白，40 μg／孔上樣至（4% ～20%）蛋白梯度預(yù)制膠，經(jīng)SDS-PAGE分離后，根據(jù)蛋白分子質(zhì)量切膠，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂牛奶室溫封閉2 h；不同的PVDF 膜分別加入一抗（兔抗CCL5、MRP2、Bax 多克隆抗體均為1∶500 稀釋，β-actin pAb 為1∶1 000 稀釋）；4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，加入二抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶1 000 稀釋），4 ℃搖床孵育2 h；TBST 洗膜3次，化學(xué)發(fā)光檢測，分析結(jié)果。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，圖片由Graphpad Prism 8.0軟件完成，細胞劃痕試驗及Western blot 結(jié)果經(jīng)Image J 軟件進行分析。以上實驗結(jié)果滿足正態(tài)分布均采用兩獨立樣本t檢驗評估兩組間差異，計量數(shù)據(jù)用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，如實驗結(jié)果不滿足正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CCL5在頭頸鱗狀細胞癌中的表達 GEPIA 數(shù)據(jù)庫顯示，CCL5在頭頸鱗狀細胞癌中表達量明顯高于正常組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 CCL5在頭頸鱗狀細胞癌與頭頸正常組織中的表達Fig.1 CCL5 expression in HNSCC and head and neck normal tissues

2.2 siRNA 敲降效率 RT-PCR 結(jié)果顯示，siRNA 具有較高的敲降效率，siRNA 和NC 組細胞相對表達量分別為（0.259 ± 0.020）和（1.003 ± 0.098），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.898，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，siRNA 可敲降CCL5，降低CCL5 表達，與NC 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 22.656，P＜0.001），見圖2。

圖2 siRNA干擾CCL5表達的Western blot檢測Fig.2 Western blotting of CCL5 expression with siRNA interference

2.3 siRNA 干擾CCL5對TU177 細胞增殖活性的影響 CCK8 法結(jié)果顯示，CCL5 可促進喉癌細胞TU177增殖，與NC 組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t1～4d分別為11.667、8.090、9.808、4.794，P分別為＜0.001、＜0.01、＜0.01、＜0.01），見圖3。

圖3 CCL5對TU177細胞增殖活性的影響Fig.3 Effect of CCL5 on proliferation activity of TU177 cells

2.4 siRNA 干擾CCL5對TU177 細胞遷移的影響劃痕試驗結(jié)果顯示，siRNA 和NC 組24 h 遷移率分別為（8.711 ± 6.262）%和（20.290 ± 8.934）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.600，P＜0.05），即siRNA干擾CCL5可抑制TU177 細胞24 h 的遷移能力，見圖4。表明CCL5可能具有促進細胞遷移的功能。

圖4 CCL5對TU177細胞遷移的影響（×100）Fig.4 Effect of CCL5 on migration of TU177 cells（×100）

2.5 siRNA 干擾CCL5對TU177 細胞周期及細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，CCL5 與細胞周期無關(guān)，與NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tG0／G1期=0.499，P＞0.05；tS期= 0.611，P＞0.05；tG2／M期= 0.043，P＞0.05），見圖5。與NC 組相比，siRNA 干擾CCL5可促進細胞晚期凋亡（t= 3.940，P＜0.05），未能明確促進早期凋亡（t=1.030，P＞0.05），見圖6。提示CCL5可抑制喉癌細胞晚期凋亡。

圖5 CCL5對TU177細胞周期的影響Fig.5 Effect of CCL5 on TU177 cell cycle

圖6 CCL5對TU177細胞凋亡影響Fig.6 Effect of CCL5 on apoptosis of TU177 cells

2.6 siRNA 干擾CCL5對多藥耐藥蛋白2（multidrug resistance protein 2，MRP2）、bcl-2相關(guān)x 蛋白（bcl-2-associated x protein，Bax）mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平的影響 RT-PCR 及Western blot 分析顯示，與NC組相比，siRNA 干擾CCL5不僅可促進BaxmRNA 轉(zhuǎn)錄水平（t= 4.376，P＜0.05），也可促進其蛋白表達水平（t= 7.159，P＜0.001）；而siRNA 干預(yù)CCL5未能降低MRP2mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平（t分別為0.756和0.468，P均＞0.05）。見圖7。表明CCL5可抑制凋亡蛋白Bax的表達。

圖7 siRNA 干擾CCL5 對MRP2、Bax mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of siRNA interference with CCL5 on mRNA transcription and protein expression of MRP2 and Bax

3 討論

喉癌已成為常見的頭頸惡性腫瘤之一。吸煙、人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染等為其主要危險因素［17-18］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，喉癌多在中老年發(fā)病，臨床分型以聲門型為主［19］。其中手術(shù)為其主要治療方式［20-21］，必要時輔以放化療。近年來，雖然各種醫(yī)療條件有了極大改進和提高，但喉癌的5 年生存率一直為70%左右［22］，局部晚期病例5 年生存率也僅為30%左右［23］。因此，喉癌的靶向治療成為當(dāng)今的熱點問題。通過靶向治療抑制喉癌細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)特性，達到治療喉癌目的，均對患者的治療及預(yù)后具有深遠意義。

CCL5又稱趨化因子調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌因子（regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES），是趨化因子超家族的一員。研究表明，在結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌等癌細胞試驗中發(fā)現(xiàn)，CCL5 與腫瘤細胞的侵襲、遷移等生物學(xué)特性密切相關(guān)［15，24-25］。MRP2又稱ATP 結(jié)合盒C亞家族成員2（ATP binding cassette subfamily C member 2，ABCC2），屬于ABC 家族一員。MRP2基因編碼的蛋白質(zhì)是ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運體超家族成員，其成員突變后會造成多重耐藥性［26］，該基因可作為檢測多重耐藥的一個指標(biāo)。Bax編碼的蛋白屬于Bcl-2蛋白家族。Bcl-2 家族成員形成異或同型二聚體，并作為抗或促凋亡的調(diào)節(jié)因子，參與多種細胞活動［27］，是經(jīng)典的凋亡蛋白，可作為檢測凋亡的指標(biāo)。

本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，頭頸鱗狀細胞癌的表達量高于正常組織，因此，CCL5 可作為研究喉癌生物學(xué)特性的因子?；谏鲜鰯?shù)據(jù)庫初步結(jié)果，為進一步探索CCL5 對喉癌進展的影響，本研究用siRNA敲降CCL5，CCK8、劃痕試驗結(jié)果顯示，低表達CCL5在各時間點的細胞增殖活性、24 h 遷移率，均低于NC 組；流式細胞術(shù)未能明確CCL5與細胞周期的相關(guān)性，但低表達CCL5晚期凋亡率高于NC組。RT-PCR 及Wes-tern blot結(jié)果顯示，敲降CCL5可促進BaxmRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，但未能明確CCL5與MRP2表達之間的關(guān)系。因此，敲降CCL5可抑制喉癌細胞TU177 增殖、遷移，促進細胞晚期凋亡及凋亡蛋白Bax的表達。

關(guān)于CCL5 在喉鱗狀細胞癌中作用的分子機制尚未明確。CAO等［28］在前列腺癌中的研究表明，Bax上調(diào)可抑制腫瘤細胞增殖及遷移。Bax 為p53 通路經(jīng)典蛋白，LIU 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，p53 通路介導(dǎo)下可抑制宮頸癌細胞遷移，此時Bax 呈高表達，表明Bax 高表達抑制癌細胞遷移。同時，作為經(jīng)典凋亡蛋白，Bax 上調(diào)可促進細胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降CCL5后，在mRNA 及蛋白水平上Bax表達量均升高，細胞增殖率、遷移率均有所下降，細胞晚期凋亡率有所升高。因此，CCL5通過Bax介導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移及凋亡。

綜上所述，siRNA 干擾CCL5通過上調(diào)Bax 表達抑制喉癌細胞TU177 增殖、遷移，促進凋亡，為下一步CCL5靶向治療喉癌的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。