GⅡ.4 Sydney［P31］型諾如病毒GZ19株進(jìn)化及其受體結(jié)合特征分析

王金冬，馬亞林，段招軍

1.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

人類諾如病毒（human norovirus，HuNoV）是一種無(wú)包膜的單正鏈RNA病毒，屬于人類杯狀病毒科（Caliciviridae）諾如病毒屬。NoV 基因組大小為7 500 ～7 700 bp，包括5'和3'端非編碼區(qū)以及3 個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。ORF1 主要編碼一種大的多聚蛋白，由病毒蛋白酶加工產(chǎn)生病毒復(fù)制所需的6 種非結(jié)構(gòu)（non-structural，NS）蛋白，其中包括RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）［1］；ORF2 和ORF3 分別編碼主要衣殼蛋白VP1和次要結(jié)構(gòu)衣殼蛋白VP2，VP1蛋白包含組織血型抗原（histo-blood group antigens，HBGAs）結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵中和表位，其可表達(dá)為獨(dú)立于其他病毒組分的重組蛋白，在真核表達(dá)系統(tǒng)中自行組裝形成病毒樣顆粒（viral-like particle，VLP）［2-3］。ORF2 區(qū)包含S區(qū)和P區(qū)2個(gè)結(jié)構(gòu)域，S區(qū)編碼S蛋白（1 ～225 aa），構(gòu)成病毒內(nèi)殼；P 區(qū)構(gòu)成衣殼外的突起部分，由剩余氨基酸組成，可分為P1 和P2 兩個(gè)亞區(qū)，P1 亞區(qū)相對(duì)保守，P2 亞區(qū)位于衣殼最外層，是NoV 與HBGAs 受體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，包含主要的抗原中和位點(diǎn)，同時(shí)具有高度變異性和高免疫原性［4-5］。當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，24 個(gè)P 區(qū)結(jié)構(gòu)域可自發(fā)組裝成T = 1 的八面體對(duì)稱性的P 顆粒。P 顆?？山?jīng)原核系統(tǒng)大量表達(dá)，與受體的結(jié)合效果強(qiáng)于VLP和P二聚體［6］。

VP1 蛋白是NoV 分類的主要依據(jù)。根據(jù)VP1 氨基酸序列的不同，NoV 可被分為10 個(gè)基因型（GⅠ～GⅩ）［7］，其中，GⅡ.4 NoVs 是過去30 年引起NoV 急性胃腸炎暴發(fā)的最主要流行株。GⅡ.4 毒株具有高度變異性，每2 ～3 年即有新的變異株產(chǎn)生并取代舊的流行株，造成新一輪的暴發(fā)流行［8-9］。自1995 年以來(lái)，GⅡ.4 變異株已造成6 次大規(guī)模NoV 暴發(fā)，包括95／96 US 變異株、Farmington_Hills_2002 變異株和Hunter變異株等。GⅡ.4的變異和進(jìn)化持續(xù)發(fā)生，陸續(xù)出現(xiàn)不同表型，目前我國(guó)的主要流行株為GⅡ.4 Sydney［P31］［10-11］。

VP1 蛋白決定NoV 的抗原性和毒株特異性，是探索NoV與HBGAs受體結(jié)合模式的關(guān)鍵蛋白。HBGAs是一類復(fù)合糖類，具有高度多態(tài)性，廣泛存在于消化道、呼吸道和泌尿生殖道等黏膜上皮細(xì)胞的表面，以及血液、唾液、乳汁等體液中［12］。研究發(fā)現(xiàn)，NoV具有高度特異性，不同型別的NoV可能識(shí)別不同的HBGAs受體。多數(shù)GⅡ.4 NoVs 可與A、B、O 等分泌型HBGA受體結(jié)合［13］。蛋白-受體結(jié)合模式的探索不僅有助于了解NoV 的致病機(jī)理，也可為NoV 疫苗的研究提供支持。

本研究通過對(duì)目前我國(guó)NoV 的代表流行株——GZ19 的VP1 蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)比對(duì)，深入探討GⅡ.4 Sydney［P31］的進(jìn)化規(guī)律，同時(shí)表達(dá)并制備GZ19 株的P 顆粒蛋白，分析其與HBGAs受體的結(jié)合特征，確定該毒株的宿主感染范圍，為后期NoV疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、寡糖及細(xì)胞 攜帶NoV GZ19株（GenBank：OK148516）ORF2 序列的質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，P 區(qū)末端已引入CDCRGDCFC 修飾氨基酸基因序列以促進(jìn)P 顆粒的形成；帶有生物素（Biotin）標(biāo)簽的寡糖：A 雙糖（A-di）、B 雙糖（B-di）、H 雙糖（H-di）、H1、H2、H3、lewis a（Lea）、lewis b（leb）、lewis x（lex）、lewis y（ley）、唾液酸化lea（sLea）、唾液酸化lex（sLex）購(gòu)自美國(guó)GlycoTech公司；表達(dá)載體pGEX-6P-1 由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒性腹瀉室保存；大腸埃希菌Trans5α 和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 唾液樣本 人唾液樣本（項(xiàng)目倫理號(hào)：IVDC2017-NO.023）由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒性腹瀉室保存，HBGAs表型已明確。

1.3 主要試劑及儀器 3C蛋白酶和GST標(biāo)簽蛋白由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒性腹瀉室保存；鼠源Anti-GST單克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔和抗小鼠IgG購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔源Antinorovirus VP1 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTeX 公司；HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；親和層析柱和谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B 填料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 進(jìn)化分析和氨基酸位點(diǎn)比對(duì) 根據(jù)NoV GZ19株的VP1蛋白氨基酸序列，利用Mega 7.0軟件，選取具有代表性的2012—2022年間流行的GⅡ.4 Sydney株構(gòu)建NoV 進(jìn)化樹，采用Clustal W 和最大似然法進(jìn)行比對(duì)和構(gòu)建。同時(shí)對(duì)GⅡ.4 Sydney 株的HBGA 結(jié)合位點(diǎn)（HBGA binding sites，HBSs）和A-H 阻斷表位的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行比對(duì)，探討GZ19 毒株與目前主要流行株以及GⅡ.4 Sydney 2012原型株之間的差異。

1.5 重組P顆粒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GZ19株基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增P 區(qū)的特異性引物，上游引物：5'-ATATggatccAAACCATTCTCTGT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-CGCctcgagTTAGCAAAAGCAATC-3'（下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。膠回收PCR 產(chǎn)物，連接至pGEX-6P-1 載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞。次日，隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆菌落，小量擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 P 顆粒的表達(dá)與純化 將測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)12 ～16 h；挑取單克隆于LB 培養(yǎng)基（含100 μg／mL氨芐青霉素）中，37 ℃，180 r／min培養(yǎng)過夜；將菌液按1∶100轉(zhuǎn)入新鮮LB培養(yǎng)液（含100 μg／mL氨芐青霉素）中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液A600值達(dá)0.5 ～0.7時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol／L的IPTG，22 ℃，150 r／min誘導(dǎo)過夜。收集菌體沉淀，加入PBS 重懸，冰水浴超聲破碎，4 ℃，10 000×g離心后，分離上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

將谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B 填料介質(zhì)與過濾后的上清混合，室溫翻轉(zhuǎn)1 ～2 h，使帶有GST 標(biāo)簽的目的蛋白結(jié)合至介質(zhì)上；將結(jié)合后的混合液倒入GST親和層析柱中，棄濾液，加入PBS 洗滌3 ～5 次，除去未與介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，并重新平衡介質(zhì)；將結(jié)合重組蛋白的介質(zhì)吸出，加入100 μL 3C蛋白酶，4 ℃酶切過夜，去除GST 標(biāo)簽；次日將介質(zhì)吸出，再次加入親和層析柱中，收集重組蛋白洗脫液，加入10 kDa Millipore 超濾管中，2 800 ×g離心30 min，棄去收集管中液體，過濾完成后加入PBS緩沖液，洗滌數(shù)次，最后將蛋白樣品濃縮至2 ～3 mL，取樣進(jìn)行12% SDSPAGE分析，NanoDrop測(cè)定蛋白濃度。

1.7 P顆粒特異性的鑒定 采用間接ELISA法鑒定P顆粒的特異性。用PBS 緩沖液將純化的P 顆粒稀釋為0.25、0.5、1、2、4、8 μg／mL，各取100 μL 加入酶標(biāo)板中，4 ℃包被過夜；分別加入兔源Anti-norovirus VP1 多克隆抗體（1∶1 000、1∶2 000 和1∶4 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；設(shè)GST 標(biāo)簽蛋白為陰性對(duì)照，加入鼠源Anti-GST 單克隆抗體（1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜；0.5‰PBST 洗滌后各加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠IgG（1∶10 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；加入TMB 顯色液，避光顯色10 min；1 mol／L 磷酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。

1.8 P顆粒的糖結(jié)合特征分析

1.8.1 唾液結(jié)合試驗(yàn) 將1∶1 000 稀釋的唾液樣本加入酶標(biāo)板中，100 μL／孔，4 ℃包被過夜；加入5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h；加入用PBS稀釋成10 μg／mL的純化P 顆粒，100 μL／孔，4 ℃結(jié)合過夜；依次加入NoV VP1 多克隆抗體（1∶2 000 稀釋）和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；加入TMB 顯色液，避光顯色10 min；1 mol／L 磷酸溶液中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。

1.8.2 寡糖結(jié)合試驗(yàn) 將純化的P 顆粒加入酶標(biāo)板中，20 μg／孔，4 ℃包被過夜；加入5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h；加入PBS 稀釋的寡糖A-di、B-di、H-di、H1、H2、H3、Lea、Leb、Lex、Ley、sLea、sLex，0.2 μg／孔，4 ℃結(jié)合過夜；加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶2 000稀釋），37 ℃孵育1 h；加入TMB顯色液，避光顯色10 min；1 mol／L磷酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)化分析 根據(jù)NoV GZ19 株VP1 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GⅡ.4 Sydney 自2012年出現(xiàn)至今，隨著時(shí)間的推移不斷發(fā)生變化，目前主要聚集于GⅡ.4 Sydney［P31］和GⅡ.4 Sydney［P16］兩個(gè)譜系中。本研究選擇的疫苗株GZ19來(lái)自于廣州一所小學(xué)暴發(fā)性胃腸炎患者的糞便樣本，經(jīng)測(cè)序和序列分析，該毒株歸類為GⅡ.4 Sydney［P31］譜系，其VP1 蛋白的氨基酸序列與GⅡ.4 Sydney 2012原型株（GenBank：KC175323）的同源性達(dá)98.7%，與2017—2022年其他GⅡ.4 Sydney［P31］主要流行株的VP1氨基酸序列一致性為97.5%～99.8%，與GⅡ.4 Sydney［P16］株的氨基酸序列同源性為94.6%～97.4%。見圖1。

圖1 基于VP1 蛋白氨基酸序列的GⅡ.4 Sydney 變異株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of GⅡ.4 Sydney variant based on amino acid sequences of VP1 protein

2.2 VP1蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 VP1蛋白上包含3個(gè)HBSs，分別為SiteⅠ（338 ～349位氨基酸）、SiteⅡ（370 ～376位氨基酸）和Site Ⅲ（440 ～446位氨基酸），均位于P結(jié)構(gòu)域。對(duì)2012—2022年間GⅡ.4 Sydney株HBSs 的關(guān)鍵氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HBSs 具有高度保守性，與GⅡ.4 Sydney 2012 原型株相比，GZ19 株在SiteⅡ位點(diǎn)有兩位氨基酸（372 和373）發(fā)生了突變，序列同源性為92.3%。自2015年以來(lái)，GⅡ.4 Sydney［P31］流行株的HBSs位點(diǎn)未發(fā)生明顯改變，氨基酸序列同源性為100%。GZ19株與GⅡ.4 Sydney［P16］株（GenBank：LC153121，LC331997，MW661278）氨基酸序列一致性為92.3%，見圖2A。

圖2 GⅡ.4 Sydney株VP1蛋白的關(guān)鍵氨基酸序列分析Fig.2 Analysis of key amino acid sequences of GⅡ.4 Sydney VP1 protein

A-H 為NoV VP1 蛋白上重要的阻斷表位，也是潛在的中和位點(diǎn)。不同型別的GⅡ.4 Sydne 毒株其阻斷表位的氨基酸序列差異較大。與GⅡ.4 Sydney 2012原型株相比，GZ19株在A、B、D表位的氨基酸序列同源性分別為62.5%、50%和80%，其余表位同源性為100%。與2015年以來(lái)的其他GⅡ.4 Sydney［P31］流行株相比，GZ19 株在A、G 表位的氨基酸序列一致性分別為75%和83.3%，其余位點(diǎn)未檢測(cè)到明顯差異。與GⅡ.4 Sydney［P16］相比，GZ19株在A、D、E 和H表位分別顯示出62.5%、80%、80%和50%的氨基酸同源性。見圖2B。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，可見4 984 bp 的pGEX-6P-1 載體條帶和990 bp 的P 區(qū)條帶，大小均與預(yù)期相符，見圖3。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，插入序列與目的基因完全一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant expression plasmids（BamHⅠ／XhoⅠ）

2.4 表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定 12% SDS-PAGE 分析顯示，在誘導(dǎo)后的菌液和破菌上清中可見相對(duì)分子質(zhì)量約62 000 的GST-P 重組蛋白，見圖4。經(jīng)GST 純化、酶切與濃縮，在相對(duì)分子質(zhì)量約36 000處可見明顯P 顆粒蛋白條帶，見圖5，蛋白純度約為90%，濃度約為2 mg／mL。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed product

圖5 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified product

2.5 P 顆粒的特異性 間接ELISA 結(jié)果顯示，隨著抗原包被濃度的增加，各實(shí)驗(yàn)組中NoV VP1 抗體測(cè)得的A450值也不斷增加，平均值在0.2 ～2.0 之間；陰性對(duì)照組中GST蛋白包被孔的A450值均低于0.1。見圖6。表明純化的P 顆粒蛋白與NoV VP1 抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了P顆粒的正確表達(dá)。

圖6 間接ELISA法鑒定GZ19株P(guān)顆粒的特異性Fig.6 Identification of characteristics of P particles of GZ19 strain by indirect ELISA

2.6 P顆粒的糖結(jié)合特征 唾液結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，GZ19 株P(guān) 顆?？山Y(jié)合A、B、O、AB 等分泌型唾液樣品，而與非分泌型樣品不結(jié)合，見圖7。寡糖結(jié)合試驗(yàn)表明，GZ19 株P(guān) 顆粒僅與H-di 寡糖結(jié)合，與其他寡糖未發(fā)生有效結(jié)合，見圖8。

圖7 GZ19株P(guān)顆粒的唾液結(jié)合特異性分析Fig.7 Saliva-binding specificity of GZ19 strain P particles

圖8 GZ19株P(guān)顆粒的寡糖結(jié)合特異性分析Fig.8 Oligosaccharide-binding specificity of GZ19 strain P particles

3 討論

NoV 具有高度多樣性，根據(jù)VP1 氨基酸序列的不同，可分為10個(gè)基因型，其中，GⅡ.4 NoVs在全球范圍內(nèi)一直占據(jù)主導(dǎo)地位。發(fā)生在ORF2 區(qū)的基因突變以及ORF1和ORF2連接處的基因重組導(dǎo)致GⅡ.4 NoVs 不斷進(jìn)化并產(chǎn)生新的變異株，成為GⅡ.4 NoVs逃避群體免疫和大規(guī)模流行的關(guān)鍵［14］。GⅡ.4 Sydney株自2012 年出現(xiàn)以來(lái)一直在全球占據(jù)主導(dǎo)地位，其主要包括GⅡ.4 Sydney［P31］和GⅡ.4 Sydney［P16］兩種類型。GⅡ.4 Sydney［P16］是由于聚合酶區(qū)重組而形成的新的變體，自2016 年出現(xiàn)以來(lái)在一些國(guó)家已取代了GⅡ.4 Sydney［P31］成為新的流行株［15-16］。但目前我國(guó)仍以GⅡ.4 Sydney［P31］株為主，GⅡ.4 Sydney［P16］總體檢出率僅為0.35%［11，17］。作為目前我國(guó)NoVs 的主要流行型別，GⅡ.4 Sydney［P31］的受體結(jié)合特征分析為進(jìn)一步的疫苗評(píng)價(jià)和基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

HBSs 是NoV 與HBGAs 受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。通常情況下，同一型別的HBSs 相對(duì)保守，但在進(jìn)化壓力下，HBSs 某些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變可能會(huì)影響NoV 與HBGA 的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致NoV 受體結(jié)合特征的變化。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，GZ19株與近5年的其他GⅡ.4 Sydney［P31］毒株的HBSs 氨基酸序列完全一致，而與GⅡ.4 Sydney 2012原型株以及近年流行的GⅡ.4 Sydney［P16］株在SiteⅡ位點(diǎn)上存在氨基酸差異，表明以GZ19 株為代表的GⅡ.4 Sydney［P31］NoVs 和GⅡ.4 Sydney原型株，以及GⅡ.4 Sydney［P16］株的受體結(jié)合模式可能存在差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此觀點(diǎn)，本研究表達(dá)了GZ19株的P顆粒蛋白，并進(jìn)行HBGAs 受體結(jié)合特征分析。在唾液結(jié)合試驗(yàn)中，GZ19 株顯示出與其他GⅡ.4 NoVs相似的結(jié)合模式，即與A、B、O、AB型唾液樣本結(jié)合，與非唾液樣本不發(fā)生結(jié)合［18-19］，且GZ19 株與各型別的分泌型唾液均顯示出較強(qiáng)的結(jié)合能力；而寡糖結(jié)合試驗(yàn)中P顆粒僅與H-di 寡糖結(jié)合，與其他H 組寡糖不結(jié)合，這與前期報(bào)道的GⅡ.4 NoVs 可結(jié)合H 抗原（α-1，2 巖藻糖）不符［13］?？紤]可能與人工寡糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)，本研究認(rèn)為，相較于人工合成的低聚糖，唾液樣本才能更好地反應(yīng)不同唾液表型和與NoVs 的結(jié)合模式。因此，從上述結(jié)果可以看出，GZ19株顯示出與其他GⅡ.4 NoVs相似的結(jié)合模式，即對(duì)占比80%的分泌型人群易感，這也是該毒株流行的主要原因之一。

位于VP1 蛋白上A-H 阻斷表位是用人源和動(dòng)物的單克隆抗體繪制的。除表位F 外，其余表位均位于P2 亞區(qū)的環(huán)上或顆粒表面，并與中和抗體、附著因子相互作用，因此也是潛在的中和表位［20-21］。A-H阻斷表位的變化，特別是A、C和G幾個(gè)關(guān)鍵表位的突變是導(dǎo)致GⅡ.4 變異株周期性出現(xiàn)的重要原因［22-23］。這些關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的變化在一定程度上反應(yīng)了病毒進(jìn)化趨勢(shì)。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GZ19 株與近5 年來(lái)的大部分GⅡ.4 Sydney［P31］流行株具有相似的阻斷表位，而與GⅡ.4 Sydney 2012 原型株氨基酸差異較大，表明GⅡ.4 Sydney［P31］在不斷進(jìn)化。GZ19 株與GⅡ.4 Sydney［P16］株的關(guān)鍵氨基酸也存在較大差異，毒株之間是否存在交叉免疫，以及免疫保護(hù)效果的強(qiáng)弱有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

GⅡ.4 Sydney［P31］是目前我國(guó)NoVs 的主要流行型別，本研究通過分析2012年以來(lái)的GⅡ.4 Sydney［P31］毒株序列，以及比對(duì)HBSs 和A-H 阻斷表位上的關(guān)鍵氨基酸，探索NoVs 的進(jìn)化規(guī)律以及未來(lái)可能的進(jìn)化趨勢(shì)。GZ19 株是當(dāng)前GⅡ.4 Sydney［P31］的代表毒株，通過GZ19 株P(guān) 顆粒與唾液及寡糖的結(jié)合試驗(yàn)，明確了當(dāng)前GⅡ.4 Sydney［P31］流行株的糖結(jié)合特征，為進(jìn)一步揭示GⅡ.4 Sydney［P31］的流行機(jī)制及監(jiān)測(cè)該毒株的變異進(jìn)化提供了思路，也為抗病毒藥物和疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。