甲型肝炎病毒衣殼蛋白VP1、VP3的原核表達及其免疫原性

趙丹瑩，周永飛，徐艷玲，陳子楊，唐劍光，常東英，王藝博，關詩宇，常軍亮，曹玉鋒

長春生物制品研究所有限責任公司，吉林 長春 130012

甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）屬于微小核糖核酸病毒科嗜肝病毒屬，HAV 感染可導致甲型肝炎（簡稱甲肝），是一種主要引起肝臟損害的急性傳染病。2008 年，甲肝疫苗納入我國擴大免疫規(guī)劃后，甲肝發(fā)病率呈明顯下降趨勢，由7.34／10 萬（2004 年）下降至1.66／10 萬（2015 年）［1］，表明接種甲肝疫苗是預防甲肝的有效手段。目前，已上市甲肝疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗，減毒活疫苗可能發(fā)生基因突變導致毒力返祖，安全性較低；滅活疫苗可能存在滅活不完全，具有強毒擴散的風險，且成本較高［2］。鑒于HAV 在全球流行及進化方面具有高度保守性，隨著對HAV 結構蛋白及表位分布研究的深入及新型佐劑在基因工程疫苗領域應用的推廣，HAV 重組亞單位疫苗成為重要研究方向。

目前，常用的佐劑包括水包油型佐劑MF59、氫氧化鋁佐劑（AH）、磷酸鋁佐劑（AP）、磷酸鋁-CpG 寡核苷酸佐劑（AP-CpG ODN）等。其中MF59與鋁佐劑的作用方式不同，其不在機體內(nèi)形成抗原庫，不依賴炎性小體發(fā)揮作用，不直接活化樹突狀細胞，而是通過刺激注射部位免疫細胞上調(diào)多種炎性趨化因子的表達，募集單核細胞分化為樹突狀細胞提呈抗原，并運輸至淋巴結。CpG ODN佐劑與鋁佐劑協(xié)同使用可在組織內(nèi)形成CpG 庫，使代謝速度減緩，引起更持久的免疫應答。HAV 具有直徑約30 nm 的無囊膜衣殼，呈二十面體對稱，包裹約7 500 bp的正義RNA 單鏈基因組［3］。HAV 可分為7 個基因型，但僅有1 個血清型［4］，不同基因型毒株間有較好的交叉保護效應。HAV 的結構蛋白包括VP4、VP2、VP3 和VP1pX（即VP1、2A）［5］，其抗原表位位于VP2、VP3和VP1上［6-7］。VP3、VP1蛋白含有主要抗原中和表位，因此，本研究通過E.coli原核表達系統(tǒng)分別表達重組蛋白VP1、VP3，經(jīng)純化復性后與不同佐劑配伍，免疫小鼠，并評價其免疫原性，為HAV 重組亞單位疫苗的進一步研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、載體及菌株 2BS細胞及HAV L-A-1株原液均由本司疫苗二室提供，載體pET-G28a及感受態(tài)E.coliBL21（DE3）由本公司生物技術研究室保存；感受態(tài)E.coliDH5α購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 血清 甲肝滅活疫苗免疫NIH 小鼠血清由本公司疫苗二室提供，兔抗HAV 抗血清及鼠抗HAV-VP3抗血清由本公司生物技術研究室保存。

1.3 主要試劑及儀器 總RNA 提取試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司；反轉錄試劑盒及DNA片段純化試劑盒均購自日本TaKaRa 公司；FastPfu DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NdeⅠ均購自北京全式金生物技術有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自美國Axygen 公司；無縫克隆試劑盒購自美國Clone Smart 公司；FITC 標記的鼠抗HAV 單克隆抗體由本公司生物技術研究室保存；HRP 標記的山羊抗鼠IgG 及山羊抗兔IgG 均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB 顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SP Bestarose FF 購自上海博格隆生物技術有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow 購自美國GE Healthcare 公司；NanoPhotometer N60 超微量分光光度計購自德國IMPLEN公司。

1.4 實驗動物 SPF 級BALB／c 小鼠，雌性，6～8 周齡，體質量18～20 g，由本公司動物室提供，動物許可證號：SCXK（吉）-2017-0005。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照本公司動物倫理相關規(guī)定進行。

1.5 引物的設計及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的HAV L-A-1 株基因序列（AF314208.1），應用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，見表1，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 用于PCR擴增的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

1.6 目的基因的擴增 用總RNA提取試劑盒提取HAV L-A-1株的總RNA，以2B-R為引物，逆轉錄合成cDNA，以其為模板，VP1-F／R和VP3-F／R為引物，分別擴增目的基因VP1和VP3。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，41 ℃（VP1）／49 ℃（VP3）退火20 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并純化回收。

1.7 重組表達質粒的構建 將載體pET-G28a經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，回收載體片段，以無縫克隆試劑盒中的同源重組酶分別與目的片段于50 ℃連接20 min；連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)E.coliDH5α，涂布于含50 μg／mL 卡那霉素LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h；經(jīng)菌落PCR 鑒定，陽性單克隆送吉林省庫美生物科技有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3。

1.8 目的蛋白的誘導表達 將重組表達質粒pET-G28a-VP1及pET-G28a-VP3轉化至感受態(tài)E.coliBL21（DE3），涂布于含50 μg／mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h；挑取單克隆，接種于含50 μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，進行擴大培養(yǎng)，至A600=0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol／L的IPTG，于37 ℃誘導5 h；10 000 ×g離心1 min，收集1.5 mL 菌體，用200 μL注射用水重懸，進行超聲破碎，分別取破碎上清及沉淀，進行12%SDS-PAGE分析。

1.9 目的蛋白的純化 收集VP1和VP3的重組菌，分別 用50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）和50 mmol／L Tris-HCl（pH 6.0）緩沖液按1∶10（W／V）的比例重懸，在800 bar壓力下循環(huán)均質3次；于4 ℃，10 000×g離心30 min，收集沉淀，依次用包涵體洗液A［50 mmol／L Tris-HCl、0.5mmol／LEDTA、0.5%（V／V）TritonX-100，pH 7.0］、洗液B（50 mmol／L Tris-HCl、0.5 mmol／L EDTA、2 mol／L NaCl，pH 7.0）、洗液C（50 mmol／L Tris-HCl、0.5 mmol／L EDTA、2 mol／L 尿素，pH 7.0）進行洗滌。將包涵體分別置于含8 mol／L 尿素的50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）和50 mmol／L Tris-HCl（pH 6.0）中，4 ℃放置過夜；變性后的VP1、VP3包涵體均經(jīng)0.45 μm 濾膜抽濾，分別上樣于陰離子交換層析柱（SP Bestarose FF）和陽離子交換層析柱（DEAE Sepharose Fast Flow）進行純化，流速均為1 mL／min；收集流穿峰，用含1 mol／L NaCl 的洗脫液洗脫目的蛋白，流速均為1 mL／min，收集洗脫峰。流穿峰及洗脫峰樣品經(jīng)12%SDS-PAGE分析。

1.10 目的蛋白的復性及鑒定 VP1和VP3純化蛋白中分別滴加等體積的pH 為8.0 及6.0 的包涵體復性液（50 mmol／L Tris-HCl、1 mmol／L EDTA、0.5 mol／L L-精氨酸、0.2 mmol／L 氧化型谷胱甘肽、2 mmol／L 還原型谷胱甘肽），充分攪拌，收集于透析袋，分別置含有3 mol／L 尿素的復性液（pH 同上）中進行梯度透析，逐步降低外透液（復性液）中的尿素濃度，直至外透液中不含尿素，每次換液間隔48～72 h；將透析袋置PEG20000 中進行濃縮，用NanoPhotometer N60 超微量分光光度計對濃縮后重組蛋白進行定量分析。取復性濃縮的重組蛋白VP1、VP3，經(jīng)12%SDS-PAGE 分離后，轉移至PVDF 膜上，用含20% FBS 的PBS 于室溫封閉1 h；PBST 洗滌3 次，分別加入兔抗HAV 抗血清（1∶1 000 稀釋）及鼠抗HAV-VP3 抗血清（1∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌3 次，分別加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG（均1∶5 000 稀釋），室溫孵育1 h；PBST 洗滌5 次，用DAB 顯色試劑盒室溫避光顯色。

1.11 動物分組及免疫 將小鼠隨機分為VP1-MF59、VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP、VP3-VP1-AP及PBS對照組，每組5只，VP1-MF59 組抗原與佐劑按等體積分數(shù)混合，其他組中AH 及AP 終濃度均為1 mg／mL，10CpG 和50CpG 終濃度分別為20 和100 μg／mL。給藥劑量及途徑見表2。于0、1、2 周各免疫1 次，首次免疫后5 周，經(jīng)小鼠內(nèi)眥靜脈采血，分離血清。

表2 動物分組及免疫信息Tab.2 Animal grouping and immune related information

1.12 小鼠血清IgG抗體效價的測定 采用間接ELISA法。用0.05 mol／L碳酸鹽包被液將抗HAV 單克隆抗體稀釋至6 μg／mL，加入96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被24 h；加入含20%FBS的PBS，200 μL／孔，于4 ℃封閉16 h；加入HAV L-A-1 株原液（用含3% FBS的PBS稀釋至2 μg／mL），120 μL／孔，37 ℃孵育3 h；加入待測血清（從1∶4 起進行2 倍系列稀釋，共10個稀釋度），100 μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3次，加入HRP 標記的山羊抗鼠IgG（1∶6 000 稀釋），100 μL／孔，37 ℃孵育30 min；PBST 洗滌5 次；加入TMB 顯色底物，37 ℃避光孵育15 min，用2 mol／L硫酸終止反應，用酶標儀檢測A450。以陰性孔平均值的2.1倍為Cutoff值，以判為陽性（≥Cutoff值）的血清最大稀釋倍數(shù)為其抗體效價。

1.13 小鼠血清中和抗體效價的測定 采用快速熒光灶免疫抑制試驗。取VP1-AP、VP3-VP1-AP、PBS對照組小鼠血清，于56 ℃滅活30 min，進行2 倍系列稀釋，共7個稀釋度，與200 CCID50／mL HAV 等體積混合，接種至鋪有2BS 細胞的96 孔板（融合度為70%），每個稀釋度均設8 個復孔，同時設病毒對照（100 CCID50／mL HAV L-A-1 株和2BS 細胞）和細胞對照（僅含2BS細胞）。于37 ℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)7 d；棄細胞上清，PBS 洗滌1 次，加入-20 ℃預冷的80%丙酮，室溫固定20 min；棄固定液，揮發(fā)至干，以含10%FBS的PBS室溫封閉20 min；PBS洗滌3次，加入FITC 標記的鼠抗HAV 單克隆抗體（1∶50 稀釋），50 μL／孔，室溫孵育2 h；PBST 洗滌3 次，加入95%甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，采用Reed-Muench法計算血清中和抗體效價。

1.14 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 5.0 和Excel軟件進行統(tǒng)計學分析，組間血清效價的比較采用單因素方差分析（One-way Anova），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 目的基因的鑒定 目的基因VP1和VP3的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見1 035 和735 bp的特異條帶，大小與預期一致，見圖1。

圖1 目的基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of target genes

2.2 重組表達質粒的鑒定 含有pET-G28a-VP1和pETG28a-VP3的重組菌菌落PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分別可見1 035和735 bp的目的基因條帶，大小與預期一致，見圖2。測序結果表明，重組表達質粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3的目的基因序列分別與HAV L-A-1株VP1、VP3基因序列完全一致。

圖2 含有pET-G28a-VP1 和pET-G28a-VP3 的重組菌菌落PCR鑒定Fig. 2 Colony PCR identification of recombinant colonies pET-G28a-VP1 and pET-G28a-VP3

2.3 表達產(chǎn)物的鑒定 含有pET-G28a-VP1及pETG28a-VP3重組菌的破菌上清及沉淀經(jīng)12% SDSPAGE 分析，分別可見相對分子質量約37 000 和26 000 的VP1 和VP3 目的蛋白條帶，且主要以包涵體形式存在，見圖3。重組蛋白VP1和VP3表達量分別為18.6%和32.4%。

圖3 重組蛋白VP1和VP3的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins VP1 and VP3

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定

2.4.1 SDS-PAGE 分析 變性后的VP1、VP3 包涵體的陰離子交換層析柱及陽離子交換層析柱圖譜見圖4。流穿峰及1 mol／L NaCl 洗脫峰樣品經(jīng)12%SDS-PAGE分析，均可見相對分子質量約為37 000和26 000 的重組蛋白VP1 和VP3 目的條帶，見圖5。重組蛋白VP1和VP3純度分別為86.3%和84.7%。

圖5 重組蛋白VP1（A）和VP3（B）純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of purified products of recombinant proteins VP1（A）and VP3（B）

2.4.2 Western blot 鑒定 重組蛋白VP1 和VP3 純化產(chǎn)物復性后的濃度分別達0.80 和1.28 mg／mL，且分別可與兔抗HAV 抗血清及鼠抗HAV-VP3 抗血清發(fā)生特異性反應，于相對分子質量約37 000 和26 000處可見特異性結合條帶，見圖6。

圖6 重組蛋白VP1（A）和VP3（B）純化產(chǎn)物的Western blot分析Fig. 6 Western blot analysis of purified products of recombinant proteins VP1（A）and VP3（B）

2.5 小鼠血清抗體效價 與PBS 對照組比較，VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP 及VP3-VP1-AP 組小鼠血清IgG 抗體效價均明顯升高（q= 4.99～26.65，P均＜0.05），VP1-MF59 組差異無統(tǒng)計學意義（q= 0. 71，P＞0.05）。VP1-AP-50CpG 組小鼠血清的IgG 抗體效價顯著高于VP1-AP組（q=22.05，P＜0.01），表明免疫制劑配伍中添加100 μg／mL 的CpG 有利于增強重組抗原VP1 的免疫原性。VP3-VP1-AP組小鼠血清的IgG抗體效價顯著高于VP1-AP及VP3-AP組（q分別為22.05和24.49，P均＜0.01），表明重組蛋白VP3、VP1 聯(lián)合免疫較單獨免疫能引起更強烈的免疫應答。見圖7。

圖7 重組蛋白VP1和VP3小鼠免疫血清的IgG抗體效價Fig. 7 IgG antibody titer in serum of mice immunized with recombinant proteins VP1 and VP3

2.6 小鼠血清的中和抗體效價 VP1-AP、VP3-VP1-AP 及PBS 對照組小鼠血清中和抗體效價分別為1∶20、1∶40 和1∶11。與PBS 對照組比較，VP1-AP 及VP3-VP1-AP 組小鼠血清的中和抗體效價顯著升高（q分別為7.79和25.11，P＜0.01）。

3 討論

HAV基因組由1個5'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、1個開放閱讀框（open reading frame，ORF）和1個3'UTR組成，ORF編碼的蛋白可裂解為3個多聚蛋白前體P1、P2 和P3，其中P1 編碼結構蛋白VP4、VP2、VP3 和VP1pX［8］。HAV 的主要中和抗原表位存在于VP1 和VP3 上，也存在于VP1 上的某肽段和VP3 上的部分氨基酸共同構成的空間構象上［9］。本研究選取的表位為HAV 中高度保守的VP1及VP3基因序列，確保該疫苗可激發(fā)較強的免疫反應。目前，國內(nèi)外有多家甲肝減毒活疫苗及滅活疫苗上市，暫無重組疫苗上市［10-12］。有研究表明，重組蛋白VP1 在E.coli系統(tǒng)中成功表達，且能夠誘導中和抗體反應，抑制HAV 增殖［13-14］?？瑁?5］研究表明，將HAV 的VP1 與戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）ORF2 結構域嵌合表達后可形成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），其可激發(fā)宿主產(chǎn)生針對于HAV的中和抗體；沈智俊等［16］利用Bac-to-bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)共表達HAV的P1、P3，形成直徑約50 nm的VLPs，證明HAV重組疫苗是一種具有巨大潛在應用前景的疫苗。

佐劑作為非特異性增強疫苗免疫原性的輔助物質，已廣泛應用于多種疫苗的研發(fā)。目前，已上市HAV 疫苗采用氫氧化鋁、明礬、脂質體等多種傳統(tǒng)佐劑［17-18］。本研究對多種佐劑進行了篩選，還比較了不同劑量CpG 的效果，結果表明，與重組蛋白VP1 配伍的佐劑中，AP 佐劑組免疫小鼠血清IgG 抗體效價最高；在AP佐劑的基礎上添加了100 μg／mL的CpG，免疫原性顯著增強，CpG 通過與胞漿內(nèi)Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）結合活化轉錄因子，上調(diào)多種Th1 類細胞因子和趨化因子的表達，從而快速活化B 淋巴細胞，增強免疫應答作用［19-21］。CpG ODN 佐劑較傳統(tǒng)佐劑能更快地誘導機體產(chǎn)生保護性抗體，增強細胞免疫應答，減少抗原免疫劑量及簡化免疫程序［22-24］。CpG ODN 佐劑通過與鋁佐劑協(xié)同使用，在組織內(nèi)形成CpG 庫，使其代謝速度減緩，從而引起更持久的免疫應答［25］。美國Dynavax 公司的CPG-乙肝疫苗產(chǎn)品已獲批上市；我國首個采用雙佐劑（CpG ODN 佐劑、鋁佐劑）的重組乙型肝炎疫苗（云南沃森生物技術股份有限公司）已完成Ⅰ期臨床試驗［26］。

本研究采用E.coli系統(tǒng)分別表達了HAV 衣殼蛋白VP1、VP3，并篩選了不同免疫制劑，發(fā)現(xiàn)重組蛋白VP1 較VP3 具有更好的免疫原性，VP3-VP1 聯(lián)合免疫較重組蛋白VP1 單獨免疫能引起更強的免疫應答，提示VP3-VP1 有望成為重要的候選抗原。本研究為重組甲肝疫苗的研發(fā)提供了新的思路。