電荷修飾流感疫苗脂質體的免疫效果

李漂，劉艷紅，劉曉琳，楊艾，張茜，魯衛(wèi)東

昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500

脂質體（liposome）具有載體裝載量大、可靶向輸送、制劑保護可靠性高、生物相容性好、結構可靈活改變及調控等優(yōu)點，已廣泛應用于多種藥物，以提高治療效果［1］。2，3-二油氧基丙基-三甲基氯化銨［N-1-（2，3-dioleyloxy）propyl-N，N，N-trimethylam-moniumchloride，DOTAP）］是一種常用的陽離子試劑，用于DNA 體外和體內的轉染［2］。1，2-二油?；字Ｄ憠A（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC）是一種中性磷脂，用不同質量比的DOTAP 及DOPC進行電荷修飾，可調節(jié)脂質體的Zeta 電位，使其帶有不同強度的電荷［3］。經DOTAP修飾的陽離子脂質體是一種良好的免疫佐劑，可增強機體免疫應答，同時誘導更強的Th1細胞免疫應答［4］。研究表明，DOTAP修飾的載藥脂質體進入體內，可誘發(fā)更少的炎癥因子反應，且具有更好的靶向性和生物相容性［3，5-6］。帶有不同表面電荷的脂質體可使單核細胞發(fā)生不同程度活化，誘導產生CD86 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［7-8］。

本研究制備不同電荷修飾（不同DOTAP／DOPC質量比）的流感疫苗脂質體，檢測理化性質，觀察其穩(wěn)定性；并用制備的流感疫苗脂質體免疫小鼠，檢測其細胞及體液免疫效果，評價其免疫原性，以期為新型疫苗佐劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 疫苗 H1N1、H3N2、B（V）及B（Y）型流感疫苗原液（批號分別為：201910001、201911001、201911-003、201912005，血凝素含量分別為：299、282、223、147 μg／mL，蛋白含量分別為：692.1、549.0、602.0、371.0 μg／mL）均由江蘇沃森生物技術有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 大豆卵磷脂購自北京美亞斯磷脂技術公司；膽固醇及Folin 酚蛋白定量試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DOTAP及DOPC 均購自美國Avanti 公司；Anti-mouse CD4PE及Anti-mouse CD8a FITC 均購自美國eBiosciencee 公司；MTT 購自北京博奧拓達科技有限公司；激光粒度儀購自美國布魯克海文儀器公司。

1.3 實驗動物 SPF級KM小鼠，231只，雌性，8周齡，體質量18～22 g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK（滇）2015-0002。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且通過昆明醫(yī)科大學實驗倫理審查委員會的審查。

1.4 電荷修飾流感疫苗脂質體的制備 將H1N1 型、H3N2 型、B（V）型、B（Y）型流感疫苗原液用PBS 稀釋至血凝素含量為36 μg／mL，按等體積分數(shù)混合，制備為四價流感疫苗。以大豆卵磷脂、膽固醇、DOTAP和DOPC（DOTAP與DOPC質量比為1∶4、2∶3、3∶2、4∶1）為膜材，溶于無水乙醇，溶解后旋轉蒸發(fā)至成膜狀；加入PBS緩沖液30 mL，50 ℃水化旋轉，間歇超聲，50 ℃水浴孵育，冷卻至常溫，即為4 種陽離子脂質體。將四價流感疫苗與4種陽離子脂質體按1.4∶1.0的體積分數(shù)混合，采用凍融-凍干法將混合液制備為電荷修飾的流感疫苗脂質體凍干粉［9］。

1.5 電荷修飾流感疫苗脂質體理化性質的檢測

1.5.1 粒徑及Zeta電位 用PBS復溶脂質體凍干粉，再用PBS 按1∶30 的體積分數(shù)稀釋，于室溫條件下，采用激光粒度儀測量粒徑及Zeta電位。

1.5.2 脂質體包封率 用PBS 復溶脂質體凍干粉，于4 ℃，42 500 ×g離心1 h，采用Lowry 法測定包封率［10-11］。

1.6 電荷修飾流感疫苗脂質體免疫原性的檢測

1.6.1 細胞免疫效果 將小鼠隨機分為陰性對照組（PBS）、陽性對照組（四價流感疫苗原液）、陽離子脂質體組（4 種電荷修飾的流感疫苗脂質體）和中性脂質體組（未經電荷修飾的流感疫苗脂質體），每組15只。各組小鼠均經腹腔注射，0.2 mL／只，分別于免疫后7、14、28 d 各組分別取5 只小鼠，脫頸處死，無菌取脾臟。

1.6.1.1 MTT 法 將小鼠脾臟研磨制備為脾淋巴細胞懸液，用PBS 將脾淋巴細胞數(shù)調整為3.0 ×106個／mL，通過MTT 法測定細胞增殖情況，并計算刺激指數(shù)（stimulus index，SI），評價細胞增殖情況［9］。

1.6.1.2 T 淋巴細胞表面標記法 將小鼠脾臟研磨制備為脾淋巴細胞懸液，用PBS 將脾淋巴細胞數(shù)調整為3.0×106個／mL，采用流式細胞術檢測脾淋巴細胞中CD4+、CD8+細胞百分比［9］。

1.6.2 體液免疫效果 按1.6.1 項進行動物分組，每組18 只，免疫劑量及途徑同1.6.1 項。免疫后3、7、14、28、42、56 d，各組分別取3 只小鼠，經眼球采血，分離血清。采用血凝抑制（hemagglutinin inhibition，HI）試驗檢測抗體滴度，以免疫組抗體滴度與陰性對照組抗體滴度比（簡稱抗體滴度比）≥4 時判為具有免疫效應，比值越大表明免疫效應越強［10］。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，細胞免疫效果數(shù)據均以均值± 標準差（x ± s）表示，各組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電荷修飾流感疫苗脂質體的理化性質

2.1.1 粒徑及Zeta 電位 隨著DOTAP 與DOPC 質量比的增大，脂質體的粒徑和Zeta 電位呈上升趨勢，變化呈正相關，其中4∶1 組電荷最高，粒徑最大。見表1。

2.1.2 包封率 DOTAP和DOPC質量比為1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的脂質體包封率分別為89.00%、89.15%、56.07%和81.82%

2.2 電荷修飾流感疫苗脂質體的免疫原性

2.2.1 細胞免疫效果

2.2.1.1 MTT法 免疫后7、14、28 d，陽離子脂質體4個質量比組、中性脂質體組及陽性對照組（除14 d外）的SI均明顯高于陰性對照組（F= 4.651～8.898，P均＜0.05），表明不同電荷修飾的陽離子脂質體能顯著刺激脾淋巴細胞增殖，增強細胞免疫。隨著免疫時間的增長，各組SI 均逐漸降低，7～14 d 時下降最快，14～28 d 時下降速度減緩。相同時間點，陽離子脂質體組中的3∶2、2∶3、1∶4 質量比組間SI 差異無統(tǒng)計學意義（F=0.351～1.037，P均＞0.05）；4∶1質量比組的SI始終較高，產生細胞免疫原性較強，且7 d時，SI 明顯高于其他比例組（F= 3.853～8.898，P均＜0.05），表明該組誘導早期細胞免疫的能力強于其他比例組，見表2。

表2 MTT法檢測電荷修飾流感疫苗脂質體的細胞免疫效果（SI，±s，n=5）Tab.2 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by MTT assay（SI，±s，n=5）

表2 MTT法檢測電荷修飾流感疫苗脂質體的細胞免疫效果（SI，±s，n=5）Tab.2 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by MTT assay（SI，±s，n=5）

注：與陰性對照組比較，a表示P ＜0.05，aa表示P ＜0.01；與陽性對照組比較，b表示P ＜0.05，bb表示P ＜0.01。

組別陰性對照陽性對照陽離子脂質體（DOTAP與DOPC質量比）4∶1 3∶2 2∶3 1∶4中性脂質體7 d 1.044±0.029bb 1.135±0.022aa 1.455±0.014aa，bb 1.279±0.032aa，bb 1.224±0.024aa，bb 1.212±0.021aa，bb 1.155±0.042aa 14 d 0.997±0.085 1.038±0.119 1.223±0.142aa，bb 1.196±0.026aa，bb 1.179±0.086aa，b 1.130±0.032a 1.086±0.048 28 d 0.888±0.034bb 0.993±0.036aa 1.201±0.028aa，bb 1.121±0.024aa，bb 1.117±0.033aa，bb 1.110±0.048aa，bb 1.011±0.035aa

2.2.1.2 T淋巴細胞表面標記法 免疫后7、14、28 d，陽離子脂質體組4 個質量比組的CD4+／CD8+值均明顯高于陰性對照組（F=9.882～25.866，P均＜0.05）。免疫后7 d，2∶3 質量比組的CD4+／CD8+值與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（F= 0.837，P均＞0.05），1∶4質量比組高于陽性對照組及中性脂質體組，但差異均無統(tǒng)計學意義（F分別為0.594和0.746，P＞0.05）；免疫后14和28 d，陽離子脂質體4個質量比組的CD4+／CD8+值均明顯高于陽性對照組及中性脂質體組（F=3.230～7.624，P均＜0.05）。免疫后7 d，4∶1 質量比組的CD4+／CD8+值明顯高于其他組（F= 1.341～7.781，P＜0.05）；免疫后14 和28 d，4∶1 質量比組的CD4+／CD8+值高于其他3 個組，差異無統(tǒng)計學意義（F= 0.305～0.675，P均＞0.05），但與陰性對照組、陽性對照組、中性脂質體組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 4.706～7.463，P均＜0.05）。見表3。表明不同質量比陽離子修飾的脂質體能刺激脾淋巴細胞增殖，增強細胞免疫，整個免疫期內，電荷較高的4∶1 質量比組免疫增強作用最強。

表3 T淋巴細胞表面標記法檢測電荷修飾流感疫苗脂質體的細胞免疫效果（CD4+／CD8+，±s，n=5）Tab. 3 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by T lymphatic surface labeling（CD4+／CD8+，±s，n=5）

表3 T淋巴細胞表面標記法檢測電荷修飾流感疫苗脂質體的細胞免疫效果（CD4+／CD8+，±s，n=5）Tab. 3 Detection of cellular immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by T lymphatic surface labeling（CD4+／CD8+，±s，n=5）

注：aa表示與陰性對照組比較，P ＜0.01；bb表示與陽性對照組比較，P ＜0.01。

組別陰性對照陽性對照陽離子脂質體（DOTAP與DOPC質量比）4∶1 3∶2 2∶3 1∶4中性脂質體7 d 1.755±0.040 1.892±0.232aa 2.438±0.115aa，bb 2.331±0.107aa，bb 2.227±0.067aa 2.111±0.040aa 2.085±0.190aa 14 d 1.704±0.032 1.776±0.092aa 2.383±0.088aa，bb 2.234±0.039aa，bb 2.251±0.034aa，bb 2.281±0.091aa，bb 1.997±0.029aa，bb 28 d 1.622±0.122 1.697±0.081aa 2.359±0.051aa，bb 2.203±0.030aa，bb 2.154±0.078aa，bb 2.032±0.060aa，bb 1.878±0.051aa，bb

2.2.2 體液免疫效果 免疫后3 d，陽性對照組及4∶1 陽離子脂質體組的抗體滴度比均＞4；免疫后7 d，陽性對照組、4∶1 及3∶2 陽離子脂質體組、中性脂質體組抗體滴度比均＞4，且4∶1 質量比組高于其他3 組；免疫后14 d，各組抗體滴度比均＞4，且4∶1 質量比組高于其他各組；免疫后28 d，各組抗體滴度比均＞4，4∶1 質量比組高于陽性對照組及中性脂質體組，除4∶1 質量比組外的其他3 個比例組抗體效價達最高；4個陽離子脂質體組均能刺激小鼠產生特異性血凝素抗體，整個免疫周期內均能檢測到較高滴度的特異性抗體，4∶1 質量比組可以產生較快較強的體液免疫效應，見表4。綜上所述，4∶1 質量比組于免疫后3 d即產生了早期體液免疫效果，免疫后42 d抗體滴度達最高，體液免疫效應達最大，且在整個免疫周期內均維持較高水平，表明4∶1 質量比的陽離子流感疫苗脂質體可誘導早期免疫能力更強，且免疫效應持久。

表4 HI 法檢測電荷修飾流感疫苗脂質體的體液免疫效果（抗體滴度比均值，n=3）Tab. 4 Detection of humoral immune effect of electric charge modified influenza vaccine liposomes by HI assay（average antibody titer ratio，n=3）

3 討論

目前，批準使用的佐劑種類較少，鋁佐劑是公認的使用較多的一種佐劑，但其只能誘導體液免疫而不能誘導細胞免疫，且易誘發(fā)超敏反應［12-14］。陽離子脂質體作為一種藥物載體和疫苗佐劑，目前尚處于開發(fā)的初級階段。有研究表明，陽離子脂質體的免疫調節(jié)作用主要是由于其表面電荷密度，而不是陽離子脂質體的濃度，可通過靜電吸附，與細胞更好地結合［15］。

本研究以四價流感疫苗為抗原，評價不同比例陽離子修飾（不同DOTAP 與DOPC 的質量比）脂質體的免疫增強作用，檢測結果表明，4 種陽離子比例修飾的脂質體均表現(xiàn)出較好的佐劑性能，其中4∶1質量比組脂質體的粒徑最大，電荷最強，其免疫增強作用也最佳，由此推斷免疫增強效果與脂質體Zeta 電荷有一定相關性。有研究表明，表面帶有更高正電荷的脂質體／基因復合物更易與細胞產生吸附作用，從而提高細胞攝入率［16-18］。HE 等［19］合成制備了3 種粒徑相同但電荷不同的陽離子脂質體，細胞攝入試驗結果表明，細胞攝入率與表面電荷呈正相關，即隨著脂質體表面電荷的升高，細胞攝入率增加。但陽離子脂質體不僅要考慮結合率，還要考慮釋放效率及安全性，陽離子電荷大小主要由季銨鹽頭部電荷決定，該基團也是產生細胞毒性最強的部位，表明脂質體所帶電荷量越大，脂質體細胞毒性越大［20-22］。穩(wěn)定性、安全性和有效性是陽離子脂質體佐劑應用于藥物制備的重要指標［23-24］，有待進一步深入研究。