miR-196b-5p促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖分化

吳玲玲，張小玉，李曉，靳建軍，楊公社，史新娥

研究報(bào)告

miR-196b-5p促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖分化

吳玲玲，張小玉，李曉，靳建軍，楊公社，史新娥

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712000

MicroRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。大量研究表明，miRNA調(diào)控骨骼肌的發(fā)育，主要表現(xiàn)在肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活及增殖、分化、肌管的形成等生物學(xué)過程。本實(shí)驗(yàn)室前期對大白豬背最長肌(longissimus dorsi，LD)和比目魚肌(soleus muscle，Sol)進(jìn)行miRNA測序，篩選鑒定到一個在不同骨骼肌中差異表達(dá)并且序列高度保守的miR-196b-5p，目前miR-196b-5p在骨骼肌方面的研究尚未見報(bào)道。本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成miR-196b-5p mimics和inhibitor對C2C12細(xì)胞進(jìn)行miR-196b-5p過表達(dá)及干擾表達(dá)，利用蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色等方法探究miR-196b-5p對成肌細(xì)胞增殖分化的影響，并利用生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定了miR-196b-5p的靶基因。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-196b-5p顯著增加細(xì)胞周期基因、和的mRNA和蛋白表達(dá)水平(<0.05)；流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-196b-5p顯著增加S期細(xì)胞比例(<0.05)，表明miR-196b-5p能夠加快細(xì)胞周期進(jìn)程；EdU染色結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-196b-5p顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖能力；相反，抑制miR-196b-5p的表達(dá)可以顯著減弱成肌細(xì)胞增殖能力。進(jìn)一步的功能研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-196b-5p能夠顯著增加成肌標(biāo)志基因、和的表達(dá)水平(<0.05)；MyHC免疫熒光染色結(jié)果顯示miR-196b-5p可以促進(jìn)成肌細(xì)胞肌管形成，表明miR-196b-5p可以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明miR-196b-5p可以靶向基因，抑制該基因的表達(dá)。改變表達(dá)，不能夠挽救miR-196b-5p影響細(xì)胞周期的表型，可以減弱miR-196b-5p對成肌細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，表明miR-196b-5p通過靶向促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

miR-196b-5p；成肌細(xì)胞；增殖；分化；

骨骼肌是機(jī)體最大的蛋白質(zhì)存儲器官，同時(shí)也是最大的產(chǎn)能器官，能夠?yàn)闄C(jī)體提供各種生命活動所需的能量。骨骼肌也是人類最主要的蛋白質(zhì)食物來源，提高肌肉產(chǎn)量及肌肉品質(zhì)一直是畜牧業(yè)生產(chǎn)研究的重點(diǎn)。骨骼肌是一個高度異質(zhì)性組織，具有很好的可塑性，由不同類型的肌纖維組成[1,2]。骨骼肌的生長一般包括成肌細(xì)胞增殖、分化、融合形成肌管，進(jìn)一步形成成熟的肌纖維。肌生成過程是一個高度有序的過程，受一系列因子的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，例如生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)家族，包括、、和，以及生肌增強(qiáng)因子(myocyte enhancer factors，MEFs)家族等[3,4]。研究揭示，表觀遺傳調(diào)節(jié)在肌生成過程中發(fā)揮了重要作用，例如組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA調(diào)控等[5]。因此，研究骨骼肌的發(fā)育及其調(diào)控過程對于家畜育種具有重要意義。

越來越多的研究證明，非編碼RNA在骨骼肌生長過程中發(fā)揮了重要作用，主要包括miRNA、lncRNA和circRNA[6,7]。miRNA是一種在真核生物中廣泛存在的內(nèi)源性無編碼能力的單鏈小RNA，長約21～23個核苷酸，具有高度保守、組織特異和時(shí)序性的特點(diǎn)[8]。在動物體內(nèi)，miRNA與靶基因的結(jié)合存在完全與不完全結(jié)合的情況，完全結(jié)合時(shí)會降解靶基因mRNA，不完全結(jié)合時(shí)則會抑制翻譯[9]。大量研究表明，miRNA調(diào)控骨骼肌細(xì)胞增殖、分化和再生等過程[10]。根據(jù)miRNA在肌肉中的表達(dá)特征，miRNA可分為兩種類型：一種是在肌肉中特異性表達(dá)，稱為myomiRs，包括miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-133b、miR-206、miR-208a和miR-499a-5p等[11～13]。MyomiRs在調(diào)節(jié)肌肉生長、肌再生、肌衛(wèi)星細(xì)胞活化和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要。例如miR-1通過靶向組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)促進(jìn)肌生成[14]，miR-133通過抑制血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)來增強(qiáng)成肌細(xì)胞增殖[15]，miR-1和miR-206通過靶向pax7和HDAC4抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖并促進(jìn)分化[16]；另外一類miRNA在組織中廣泛表達(dá)，它們也通過多種方式調(diào)節(jié)骨骼肌的生長。例如miR-24-3p通過直接靶向并調(diào)節(jié)其下游靶標(biāo)ID3來促進(jìn)肌母細(xì)胞分化和骨骼肌再生[17]，miR-487b-3p降低IRS1的表達(dá)水平顯著抑制C2C12的增殖和分化，間接影響PI3K/AKT和MAPK/Erk信號通路從而調(diào)控骨骼肌發(fā)生[18]。

目前，關(guān)于miR-196b-5p的研究主要聚焦在參與癌癥的調(diào)控和脂肪代謝等方面[19,20]，在骨骼肌生長過程中的功能并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p在豬骨骼肌發(fā)育不同階段中顯著差異表達(dá)[21]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p在豬的背最長肌(longissimus dorsi，LD)和比目魚肌(soleus muscle，Sol)中差異表達(dá)，且在骨骼肌中高表達(dá)。因此，本研究旨在初步探究miR-196b-5p對成肌細(xì)胞增殖分化的作用，為深入研究其在骨骼肌生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇3頭飼養(yǎng)在相同條件下的180日齡的大白豬，肌肉組織采集后迅速放于液氮中冷凍，并在–80℃冰箱長期保存。6只2月齡C57BL/6小鼠分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、脂肪以及肌肉組織，迅速放于液氮中冷凍，后放入–80℃冰箱保存，用于RNA樣品的提取。由于C2C12成肌細(xì)胞系是比較經(jīng)典的研究肌肉發(fā)育過程的細(xì)胞，因此本實(shí)驗(yàn)選擇C2C12成肌細(xì)胞系作為研究對象。C2C12細(xì)胞系購自中國科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2 miRNA測序

按照Trizol說明書方法提取3頭180日齡大白豬背最長肌和比目魚肌組織RNA，由廣州銳博公司進(jìn)行測序。

1.3 miR-196b-5p靶基因GO功能富集分析和Pathway富集分析

miR-196b-5p成熟序列從miRBase (https:// mirbase.org/)上下載獲取。運(yùn)用在線預(yù)測網(wǎng)站TargetScan 7.1 Mouse (http://www.targetscan.org)和miRanda (http://www.mirda.org/miRanda/)進(jìn)行靶基因預(yù)測分析，對靶基因功能進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析。靶基因富集分析在線網(wǎng)站為Metascape (https://metascape.org/gp/index.html)。

1.4 mimics、inhibitor設(shè)計(jì)合成

mmu-miR-196b-5p序列信息：5′-UAGGUA-GU-UUCCUGUUGUUGGG-3′，miR-196-5p (MIMAT0003813)mimics和inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將C2C12細(xì)胞接種至6孔或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪滿皿底 30%～40%(增殖)或70%～80%(分化)左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為過表達(dá)或干擾miR-196b-5p，采用Lipofectamine 2000分別將miR-196b-5p mimics/ mimics NC(negative control)/miR-196b-5p inhibitor/ inhibitor NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置3/6個平行孔，將6/12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(上海?，敼?中。轉(zhuǎn)染6～8 h后換成不含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h(增殖)/4～6天(分化)，收集細(xì)胞。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，設(shè)計(jì)相關(guān)基因的PCR定量引物(表1)，由美國Invitrogen公司合成。miR-196-5p引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR擴(kuò)增按照SYBR Premix ExTM I說明書操作。20 μL擴(kuò)增體系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，加ddH2O補(bǔ)充體系至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。目的基因的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt進(jìn)行相對定量分析。

1.7 蛋白提取和蛋白免疫印跡分析

培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期時(shí)收取細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗3次；6孔板每孔加150 μL裂解液(含有PMSF等蛋白酶抑制劑)，用槍頭將貼壁細(xì)胞刮下來；將刮下來的細(xì)胞和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，冰上靜置裂解 30 min；4℃、12,000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個1.5 mL離心管中；5×蛋白上樣緩沖液，按照上清液∶緩沖液=4∶1的比例添加；煮沸10 min，–80℃分裝保存。配制適宜濃度的SDS-PAGE膠，每孔蛋白上樣量為20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后在5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗3次，一抗搖床過夜孵育(4℃)。一抗孵育結(jié)束后用TBST洗脫3次，每次10 min；二抗37℃孵育2 h，TBST洗脫3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測目的蛋白。利用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行量化。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物信息

F：上游引物；R：下游引物。

1.8 流式細(xì)胞周期檢測

將生長狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行miR-196b-5p轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染至細(xì)胞密度為90%左右時(shí)用胰酶消化細(xì)胞，收集至1.5 mL離心管中，用PBS清洗細(xì)胞3次，1000 r/min離心將PBS吸干凈，在離心管中加入1 mL預(yù)冷的70%無水乙醇，輕輕吹打至細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，避免細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn)，然后放置在4℃冰箱固定過夜。由西安子木生物科技公司進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.9 EdU染色

將生長狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞以每孔4×103個細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%左右時(shí)進(jìn)行miR-196b-5p轉(zhuǎn)染。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000∶1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，每孔加入100 μL EdU培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2 h，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍后將細(xì)胞固定，然后根據(jù)廣州銳博生物科技有限公司EdU試劑盒(C10310-1)說明書進(jìn)行染色。染色完成后，立即進(jìn)行觀測。

1.10 CCK-8檢測

將豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種到96孔板中，每孔接種2×103個細(xì)胞，每組處理設(shè)置3個重復(fù)，并且設(shè)置空白對照組。觀察細(xì)胞狀態(tài)及密度，待細(xì)胞狀態(tài)良好并且密度長到30%～40%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用miR-196-5p mimics、inhibitor以及對應(yīng)的NC處理細(xì)胞，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；在避光條件下，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h。培養(yǎng)2～4 h后，用酶標(biāo)儀檢測并用450 nm吸光度測定吸光值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 細(xì)胞免疫熒光

轉(zhuǎn)染miR-196b-5p的C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化6 d，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞。利用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，用0.5%的Triton-100通透15 min，5%的BSA封閉液封閉細(xì)胞1 h，用5%的BSA封閉液按100∶1的比例稀釋一抗MyHC (R&D Systems，MAB4470)，室溫孵育2 h，用含熒光標(biāo)記的二抗避光孵育1 h，DAPI染細(xì)胞核10 min，用PBS洗脫3次，最后在熒光顯微鏡下觀察拍照統(tǒng)計(jì)。

1.12 分化指數(shù)的測定

分化指數(shù)確定為MyHC陽性細(xì)胞中細(xì)胞核在總細(xì)胞核中的百分比，計(jì)算高倍5～6張圖片的成肌細(xì)胞分化指數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.13 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

以為例，首先需要構(gòu)建psiCHECK-Sirt1- 3′UTR野生型載體和psiCHECK-Sirt1-3′UTR突變型載體，載體構(gòu)建示意圖參考文獻(xiàn)[22](圖1)，均由通用生物安徽股份有限公司構(gòu)建。將構(gòu)建正確的野生型psiCHECK2-3'UTR或突變型psiCHECK2-3′UTR載體分別與miRNAs的模擬物mimics共轉(zhuǎn)染48孔HEK293T細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞，PBS洗兩遍，每孔加100 μL的1×PLB Passive Lysis Buffer，水平搖床裂解20 min，吹打均勻，吸取20 μL細(xì)胞裂解液于酶標(biāo)板，加50 μL Luciferase Assay Buffer I酶標(biāo)儀立刻檢測熒火蟲熒光素酶的熒光活性，隨后加50 μL Stop & Glo Substrate，立即檢測海腎熒光素酶活性。

圖1 載體圖譜

內(nèi)切酶旁的數(shù)字表示酶切位點(diǎn)。

1.14 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行繪圖，結(jié)果以mean ± SEM表示，使用配對檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。*<0.05，**<0.01，***<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-196b-5p的鑒定和表達(dá)分析

本研究通過對3頭180日齡大白豬背最長肌(LD)和比目魚肌(Sol)的miRNA測序，總共篩選出16個差異表達(dá)的miRNAs(Foldchange>1.2，<0.05)，其中12個在比目魚肌中高表達(dá)，4個在背最長肌中高表達(dá)(圖2A)。隨機(jī)選取8個差異表達(dá)的miRNA，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，與測序結(jié)果一致(圖2B)。其中，miR-146b、miR-217-5p、miR-20b、miR-324和miR-122在成肌細(xì)胞增殖、分化以及肌肉再生等過程中發(fā)揮了重要作用[23～27]。Mai等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p在豬骨骼肌發(fā)育不同階段中顯著差異表達(dá)。miR-196b-5p在豬和鼠等不同物種中序列高度保守(表2)，組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)其在豬和小鼠的骨骼肌中高表達(dá)(圖2C)。進(jìn)一步對miR-196b-5p的靶基因功能進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示，miR-196b-5p靶基因的功能與調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈結(jié)合、線粒體DNA復(fù)制等生物過程有關(guān)(圖2D)；KEGG富集分析顯示，miR-196b-5p靶基因的功能富集到胰島素信號通路、鈣離子信號通路等信號通路中(圖2D)。這些結(jié)果暗示miR-196b-5p在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.2 miR-196b-5p對成肌細(xì)胞增殖的影響

為了研究miR-196b-5p對成肌細(xì)胞增殖的影響，本研究分別過表達(dá)和干擾miR-196b-5p，利用流式細(xì)胞周期檢測、EdU染色、qRT-PCR和Western blotting等方法檢測了細(xì)胞增殖能力及基因的表達(dá)。EdU染色結(jié)果表明，超表達(dá)miR-196b-5p可以顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖(圖3A)。流式細(xì)胞周期檢測顯示，超表達(dá)miR-196b-5p可以顯著增加S期細(xì)胞比例(圖3B)。Western blotting和qRT-PCR結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-196b-5p可以促進(jìn)細(xì)胞增殖基因、和的mRNA及蛋白表達(dá)水平(圖3，C和D)。相反，干擾miR-196b-5p可以抑制成肌細(xì)胞增殖能力(圖4，A和B)，減少增殖相關(guān)基因和的mRNA及蛋白表達(dá)水平(圖4，C和D)。

表2 miR-196b-5p保守性分析

圖2 大白豬背最長肌和比目魚肌microRNA測序結(jié)果及驗(yàn)證

A：差異表達(dá)microRNA熱圖。LD：背最長肌(longissimus dorsi)；Sol：比目魚肌(soleus muscle)。B：qRT-PCR 驗(yàn)證LD和Sol中篩選的差異miRNA(內(nèi)參基因?yàn)閁6)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n=3，*<0.05，**<0.01。C：miR-196b-5p在豬和小鼠中的組織表達(dá)譜。D：miR-196b-5p靶基因GO和KEGG分析

2.3 miR-196b-5p對成肌細(xì)胞分化的影響

為了研究miR-196b-5p對成肌細(xì)胞分化的影響，本研究利用miR-196b-5p mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，然后誘導(dǎo)分化6天，利用免疫熒光染色、qRT-PCR和Western blotting檢測成肌細(xì)胞分化能力。MyHC免疫熒光染色結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-196b-5p能顯著增加成肌細(xì)胞分化，促進(jìn)肌管的形成(<0.01)(圖5A)。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-196b-5p可以促進(jìn)成肌分化標(biāo)志基因、和的mRNA及蛋白表達(dá)水平(<0.01)(圖5，B和C)。相反，干擾miR-196b-5p可以顯著抑制成肌細(xì)胞分化(<0.01) (圖5D)。降低成肌分化標(biāo)志基因、和的mRNA表達(dá)水平(<0.01)(圖5，E和F)。以上結(jié)果表明，miR-196b-5p促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

2.4 miRNA-196b-5p靶向Sirt1

miR-196b-5p可以促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化，為了進(jìn)一步探究miR-196b-5p發(fā)揮作用的分子機(jī)制，本研究利用在線預(yù)測軟件TargetScan和miRanda預(yù)測了miR-196b-5p的靶基因。進(jìn)一步對預(yù)測的靶基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)基因mRNA的3′UTR包含miR-196b-5p的靶向序列，另外在這些靶基因中只有已經(jīng)被證明在調(diào)節(jié)骨骼肌分化中發(fā)揮重要作用。有研究表明，通過抑制細(xì)胞周期抑制因子的表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖[28]；通過MEF2的去乙酰化抑制成肌細(xì)胞分化[29]。miR-196b-5p可能通過靶向調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化，因此本研究選擇作為靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 miR-196b-5p過表達(dá)對C2C12成肌細(xì)胞增殖的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后，EdU染色檢測C2C12細(xì)胞的增殖能力及陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)。*< 0.05，**< 0.01，下同；標(biāo)尺為200 μm。B：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。C：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后，Western blotting檢測增殖相關(guān)蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后，qRT-PCR檢測增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)量(內(nèi)參基因?yàn)?。

圖4 miR-196b-5p干擾對C2C12成肌細(xì)胞增殖的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后，EdU染色檢測C2C12細(xì)胞的增殖能力及陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)。*< 0.05，**< 0.01，下同；標(biāo)尺為200 μm。B：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。C：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后，Western blotting檢測Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后，qRT-PCR檢測、、mRNA表達(dá)量(內(nèi)參基因?yàn)?。

圖5 miR-196b-5p過表達(dá)和干擾對C2C12細(xì)胞分化的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后MyHC免疫熒光圖及分化指數(shù)統(tǒng)計(jì)。*< 0.05，**< 0.01，下同；標(biāo)尺為200 μm。B：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后分化相關(guān)蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。C：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p mimics后分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平(內(nèi)參基因?yàn)?。D：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后MyHC免疫熒光圖及分化指數(shù)統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺為200 μm。E：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后分化相關(guān)蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。F：轉(zhuǎn)染miR-196b-5p inhibitor后分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平(內(nèi)參基因?yàn)?。

為了驗(yàn)證miR-196b-5p與靶基因的關(guān)系，本研究分別構(gòu)建了野生型以及miR-196b-5p結(jié)合位點(diǎn)突變型的雙熒光素酶報(bào)告載體(表3)。結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-196b-5p能顯著抑制野生型載體的熒光活性，而對突變型報(bào)告載體的熒光活性沒有顯著影響(圖6A)，表明miR-196b-5p可以靶向基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-196b-5p對的靶向調(diào)節(jié)作用，本研究檢測了超表達(dá)miR-196b-5p對靶基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明過表達(dá)miR-196b-5p能顯著抑制Sirt1蛋白表達(dá)水平，說明miR-196b-5p靶向了(圖6B)。

2.5 miRNA-196b-5p通過靶向Sirt1調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化

為了驗(yàn)證與miR-196b-5p的靶向關(guān)系，將miR-196b-5p mimics和過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，觀察其對增殖和分化的影響。在增殖階段，和miR-196b-5p對增殖相關(guān)基因和在mRNA水平和蛋白水平有相同的促進(jìn)作用(圖7，A和B)，改變表達(dá)，不能夠挽救miR-196b-5p影響細(xì)胞周期的表型。在分化階段，qRT-RCR結(jié)果顯示，能夠顯著減弱miR-196b-5p對MyHC和MyoD的促進(jìn)作用(圖7C)。在蛋白水平上，過表達(dá)后能顯著抑制miR-196b-5p對MyHC和MyoD的促進(jìn)作用(圖7D)。上述結(jié)果證明，可以減弱miR-196b-5p對成肌細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。

表3 雙熒光素酶報(bào)告載體序列

3 討論

miRNAs作為一類微小非編碼RNA(20～22nt)，通過靶向結(jié)合靶基因mRNA的3'UTR序列，導(dǎo)致mRNA的降解或者抑制靶基因mRNA的翻譯[30]。大量的研究揭示miRNA在肌肉的生長、再生和肌肉疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，例如miR-27、miR-206、miR-143、miR-885等[31,32]。本研究分析了不同骨骼肌miRNA的表達(dá)差異，鑒定了16個差異表達(dá)miRNA，分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)miRNA中大部分已有報(bào)道在肌肉生長、再生和肌肉疾病中發(fā)揮了重要作用，暗示本研究篩選的差異表達(dá)miRNA可能參與到肌肉生長過程。在這些差異表達(dá)miRNA中miR-196b-5p序列在豬、人和小鼠等物種中高度保守，盡管miR-196b-5p在腫瘤發(fā)生和脂肪生成等過程中發(fā)揮了重要作用，但是miR-196b-5p在肌肉生長中的作用并不清楚。Liu等[33]對約克夏豬和皖南花豬背最長肌進(jìn)行了miRNA測序，結(jié)果顯示miR-196b-5p在皖南花豬中的表達(dá)量高于約克夏豬。此外，Mai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b-5p在豬骨骼肌發(fā)育不同階段中顯著差異表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p在豬和小鼠的骨骼肌中均高表達(dá)，因此推測其可能與肌肉的生長有關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-196b-5p在肌肉生長中的作用，本研究分別超表達(dá)和干擾了miR-196b-5p，檢測了其對肌生成的影響，結(jié)果顯示miR-196b-5p促進(jìn)肌生成。這就表明miR-196b-5p是一個肌肉生長的正調(diào)控因子。以上研究為探索miR-196b-5p對肌纖維類型轉(zhuǎn)化的作用奠定了基礎(chǔ)，目前我們已有實(shí)驗(yàn)證明miR-196b-5p可以促進(jìn)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中慢肌纖維的形成，但還需在活體水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 miR-196b-5p靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證

A：超表達(dá)miR-196b-5p對Sirt1野生型及突變型雙熒光素酶載體熒光活性的影響；B：Western blotting檢測超表達(dá)miR-196b-5p對Sirt1蛋白表達(dá)水平的影響。*< 0.05，**< 0.01。

圖7 miR-196b-5p過表達(dá)和Sirt1過表達(dá)對C2C12細(xì)胞增殖分化的影響

A：miR-196b-5p mimics和過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染之后，qRT-PCR檢測和的mRNA表達(dá)量(內(nèi)參基因?yàn)?；B：miR-196b-5p mimics和過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染之后，Western blotting檢測Sirt1、Cyclin D和Cyclin E蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：miR-196b-5p mimics和過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染之后，qRT-PCR檢測和的mRNA表達(dá)量(內(nèi)參基因?yàn)?；D：miR-196b-5p mimics和過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染之后，Western blotting檢測Sirt1、MyHC和 MyoD蛋白表達(dá)量及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

為了闡明miR-196b-5p促進(jìn)肌生成的分子機(jī)制，本文利用生物信息學(xué)分析預(yù)測了其靶基因，篩選了關(guān)鍵靶基因。在肝臟、脂肪、肌肉等多種組織中廣譜表達(dá)，參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞衰老、能量代謝、DNA 修復(fù)以及對肌肉、脂肪和肝臟等組織的生理功能的調(diào)控。已有研究表明，在成肌細(xì)胞中表達(dá)，可通過抑制細(xì)胞增殖抑制因子p21和p27，促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)肌生成[28]。通過MSTN信號通路促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖[34]。在成肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞中缺少導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞提早分化，活體水平缺乏導(dǎo)致機(jī)體基因表達(dá)、發(fā)育以及肌再生障礙；過表達(dá)后抑制成肌標(biāo)志基因MyoD等基因的表達(dá)，但并不是直接與MyoD互作，是通過PCAF/GCNS乙酰轉(zhuǎn)移酶使MyoD脫乙?；瑥亩种瞥杉〖?xì)胞分化；的抑制劑煙酰胺處理后發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞分化明顯，一系列實(shí)驗(yàn)表明能夠抑制成肌細(xì)胞的分化[29,35]。本研究證明，改變Sirt1表達(dá)，不能夠挽救miR-196b-5p影響細(xì)胞周期的表型, 可以減弱miR-196b-5p對成肌細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，表明miR-196b-5p通過靶向促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

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miR-196b-5p promotes myoblast proliferation and differentiation

Lingling Wu, Xiaoyu Zhang, Xiao Li, Jianjun Jin, Gongshe Yang, Xin’e Shi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding single-stranded RNA molecules about 22 nucleotides in length and are encoded by endogenous genes, and are involved in the regulation of post-transcriptional gene expression in animals and plants. Many studies have shown that microRNAs regulate the development of skeletal muscle, mainly manifested in the activation of muscle satellite cells and biological processes such as proliferation, differentiation, and formation of muscle tubes. In this study, miRNA sequencing screening of longissimus dorsi (LD, mainly fast-twitch fibers) and soleus muscle (Sol, dominated by slow-twitch fibers) identified the miR-196b-5p as a differentially expressed and highly conserved sequence in different skeletal muscles. Studies of miR-196b-5p in skeletal muscle have not been reported. In this study, miR-196b-5p mimics and inhibitor were used in miR-196b-5p overexpression and interference experiments in C2C12 cells. The effect of miR-196b-5p on myoblast proliferation and differentiation was analyzed by western blotting, real-time quantitative RT-PCR, flow cytometry, immunofluorescence staining, and the target gene of miR-196b-5p was identified by bioinformatics prediction and analyzed by dual luciferase reporter assays. The results showed that overexpression of miR-196b-5pcould significantly increase the mRNA and protein expression of,and(<0.05); Cell cycle analysis showed that overexpression of miR-196b-5p significantly increased the proportion of cells in the S phase (<0.05), indicating that miR-196b-5p could accelerate cell cycle progress. Results of EdU staining showed that overexpression of miR-196b-5p significantly promoted cell proliferation. Conversely, inhibition of miR-196b-5p expression could significantly reduce the proliferation capacity of myoblasts. Further, overexpression ofmiR-196b-5pcould significantly increase the expression levels of myogenic marker genes,and(<0.05), thereby promoting myoblast fusion and accelerating C2C12 cell differentiation. Bioinformatics predictions and dual luciferase experiments demonstrated that miR-196b-5p could target and inhibit the expression of thegene. Altering theexpression could not rescue the effects of miR-196b-5p on the cell cycle, but could weaken the promoting effects of miR-196b-5p on myoblast differentiation, suggesting that miR-196b-5p promoted myoblast differentiation by targeting.

miR-196b-5p; myoblasts; proliferation; differentiation;

2023-02-03;

2023-04-03;

2023-04-28

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(編號：2015CB943102)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號： 31772570)資助[Supported by the National Program on Key Basie Research Project of China (973 Program) (No. 2015CB943102) and the National Natural Science Foundation of China (No. 31772570)]

吳玲玲，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: wulingling9806@nwafu.edu.cn

史新娥，博士，教授，研究方向：動物遺傳育種研究。E-mail: xineshi@nwafu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-025

(責(zé)任編委: 李明洲)