生物鐘作用機制及其對動物年節(jié)律產(chǎn)生的影響

楊陽，儲明星，劉秋月

綜 述

生物鐘作用機制及其對動物年節(jié)律產(chǎn)生的影響

楊陽1，儲明星1，劉秋月2

1. 中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193 2. 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，種子創(chuàng)新研究院，北京 100101

生物鐘幾乎存在于所有生命體，是生物適應外界環(huán)境的每日周期性變化而產(chǎn)生的內部活動。生物鐘在體內受轉錄-翻譯-負反饋環(huán)路調控，能調節(jié)組織、器官的活動，其正常維持對生物的健康、生長、繁殖等具有重要意義。與之相對，由于環(huán)境的四季變化，生物也形成了體內的年周期生理變化，如季節(jié)性發(fā)情、昆蟲滯育等。生物的年節(jié)律在外部主要受光周期為主的環(huán)境因素影響，在體內則與基因表達、激素含量和細胞組織形態(tài)的變化有關。褪黑素是識別外部光周期變化的重要信號，而生物鐘在垂體解析褪黑素信號并調控下游信號變化中扮演著重要角色，對環(huán)境年度變化的識別和機體年節(jié)律的產(chǎn)生具有重要指導作用。本文通過介紹昆蟲和哺乳動物的晝夜節(jié)律和年節(jié)律產(chǎn)生的機制，并結合鳥類的年節(jié)律，綜述了生物鐘對年節(jié)律產(chǎn)生影響的作用機制研究進展，以期為今后研究年節(jié)律的影響機制提供更廣泛的思路。

生物鐘；年節(jié)律；分子機制；昆蟲；哺乳動物

地球存在著按周期變化的外部環(huán)境，如地球自轉造成的晝夜環(huán)境變化、地球公轉造成的年環(huán)境變化以及月球圍繞地球公轉產(chǎn)生的潮汐變化等。為了使身體更好地適應外界環(huán)境的周期性變化，地球上的生物經(jīng)過長時間的進化產(chǎn)生了對應的生物節(jié)律，如近日節(jié)律(circadian rhythm，又稱為晝夜節(jié)律)、月節(jié)律(circamensual rhythm)、年節(jié)律(circannual rhythm)、近潮汐節(jié)律(circatidal rhythm)等。在這些生物節(jié)律中，近日節(jié)律和年節(jié)律研究最廣泛，這兩種節(jié)律的研究對生物的生長發(fā)育、健康以及農業(yè)生產(chǎn)效率等的改善具有重要意義。研究表明，近日節(jié)律和年節(jié)律之間存在著緊密聯(lián)系，近日節(jié)律相關分子機制對年節(jié)律的產(chǎn)生具有重要的指導作用。年節(jié)律的研究不論是在病蟲害防治，還是農產(chǎn)品、畜產(chǎn)品的生產(chǎn)中都具有重要的指導意義。因此，本文介紹了生物鐘主要運行機制，通過昆蟲的滯育、哺乳動物的季節(jié)性發(fā)情和鳥類的季節(jié)性繁殖等年節(jié)律生物學現(xiàn)象，闡述了生物鐘影響年節(jié)律的生物學機制，以期為今后進一步研究兩者之間的關系提供參考和思路。

1 近日節(jié)律及其形成的機制

近日節(jié)律是指生物體行為或生理上出現(xiàn)的接近24小時的周期性振蕩現(xiàn)象，廣泛存在于不同的物種之中[1]。地球存在接近24小時的自轉周期，自轉使地球出現(xiàn)晝夜的交替循環(huán)，這種晝夜交替使環(huán)境產(chǎn)生約為24小時的變化，如光照強度、溫度、濕度等。地球環(huán)境的變化每天都會不斷重復進行，生物會通過外部的環(huán)境變化線索來識別時間。為了適應這種環(huán)境的變化，生物形成了一套周期約為24小時的內部計時機制，這套內部計時機制被稱為生物鐘(circadian clock)[2]。這套內部計時機制，即使在沒有外部環(huán)境線索的情況下，也會自動定義一天的時間，通過轉錄-翻譯-負反饋-降解循環(huán)的調節(jié)，使生物體形成約為24小時的節(jié)律周期[3]。

生物鐘存在于大部分生物體內，不論是植物還是動物都受到生物鐘的調控。如在哺乳動物中，大到器官、小到細胞都存在內在的生物鐘計時系統(tǒng)，且在體內存在多個生物鐘起搏器，其中下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)是哺乳動物的核心生物鐘起搏器[4]。SCN能夠接收視網(wǎng)膜感知到的外部明暗變化信息，產(chǎn)生生理信號，之后將信息傳遞給下丘腦(hypothalamus)和外周起搏器，使機體的外周振蕩器能夠達到跨器官同步[5]。

1.1 昆蟲生物鐘形成的分子機制

2017年，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予Jeffrey C. Hall、Michael Rosbash和Michael W. Young三位科學家，他們以果蠅()為實驗對象，解析了生物鐘的重要基因及相關分子機制[6]。果蠅生物鐘主反饋環(huán)路由()、()、()和()基因構成(圖1)。CLK和CYC蛋白形成異二聚體，與DNA上E-box元件結合激活、等基因轉錄。TIM和PER蛋白積累并形成復合物，轉移到細胞核內負反饋抑制CLK/CYC活性，降低自身轉錄水平[7,8]。之后TIM和PER蛋白逐漸降解，轉錄激活重新開始。光照是晝夜節(jié)律的主要授時因子，能夠抑制TIM蛋白水平、促進TIM降解[9]。在這個過程中，TIM并不能直接識別光照變化，隱花色素(crypto-chrome，)在其中起著連接作用[10]。CRY蛋白是果蠅的主要光感受器，能夠光依賴性的與TIM蛋白互作阻斷TIM/PER復合物的功能[11]。在生物鐘基因的轉錄激活中，E75(Eip75B)和UNF(HR51)還能與的調節(jié)序列結合，與CLK/CYC共同增強轉錄[12]。

圖1 昆蟲生物鐘分子機制

昆蟲生物鐘主要由、、和組成，起著連接外界光照和生物鐘循環(huán)的功能，其他組分則主要通過作用于生物鐘基因影響生物鐘的維持。

蛋白質的翻譯后修飾對于蛋白質生物活性、穩(wěn)定性、調控能力等具有重要影響，包括磷酸化、泛素化和糖基化等修飾方式[13]。生物鐘蛋白的翻譯后修飾對近日節(jié)律的維持具有重要意義。Double-time (DBT)能夠促進PER蛋白的磷酸化和降解，PP1和PP2A則能使PER去磷酸化進而變得穩(wěn)定[8,9,13～15]。同時，PP1還能去磷酸化TIM使其穩(wěn)定[16]。Cullin3(CUL3)能夠促進非磷酸化TIM降解，SLMB、NEMO則與磷酸化TIM反應促進其降解[17]。這些翻譯后修飾抑制了TIM/PER復合物的形成或功能發(fā)揮。與之相反，Shaggy(SGG)能夠促進TIM的磷酸化并加速TIM/PER復合物進入細胞核，有利于二聚體負反饋抑制功能的發(fā)揮[16]。此外，Jetlag(JET)能夠促進昆蟲CRY和TIM通過泛素-蛋白酶體途徑降解[18]。糖基化修飾在生物節(jié)律維持過程中也起到關鍵調節(jié)作用。其中O-GlcNAc糖基化作為重要的翻譯后修飾，能在蛋白質的絲氨酸(serine，Ser)或蘇氨酸(threonine，Thr)殘基上以O-糖苷鍵添加N-乙酰葡萄糖胺修飾，在這個過程中O-GlcNAc轉移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和O-GlcNAc酶(O-GlcNAcase，OGA)分別催化單糖的添加和去除，該修飾方式還與Ser的磷酸化修飾存在競爭[19,20]。如在人類()PER2中，Ser662～Ser674區(qū)域O-GlcNac糖基化修飾會與該區(qū)域的磷酸化產(chǎn)生競爭[20]。在果蠅中，O-GlcNAc轉移酶(OGT)對PER蛋白的O-GlcNAc糖基化能夠穩(wěn)定PER，并延遲其進入細胞核的時間[21]。

在生物鐘的調節(jié)過程中，miRNA發(fā)揮了重要作用。在晝夜節(jié)律的調節(jié)和穩(wěn)健性(robustness)的維持中，miRNA能夠靶向核心生物鐘基因調控其本身mRNA降解或蛋白翻譯，從而影響其對應的基因功能發(fā)揮。在果蠅生物鐘中，miR-375、miR-276a、miR-276b都能夠靶向，通過影響的表達調節(jié)果蠅的晝夜節(jié)律和睡眠[22～24]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124是果蠅在早晨對光的急性反應所必需的，敲除miR-124能夠在不直接靶向作用于核心生物鐘基因的前提下，通過影響B(tài)MP途徑使晝夜節(jié)律周期的峰值相位提前5小時[25,26]。

1.2 哺乳動物生物鐘形成的分子機制

生物鐘控制著哺乳動物50%～80%的轉錄本表達，因此生物鐘的穩(wěn)定對于哺乳動物具有重要意義[27]。生物鐘的外部授時因子主要為光照，而體內維持的主要因素是生物鐘基因的轉錄激活和反饋抑制。哺乳動物的生物鐘分子機制是由主反饋環(huán)和多個輔助反饋環(huán)共同構成，其中主反饋環(huán)由、、(包括/)、(包括//)等基因組成(圖2)。在哺乳動物中，CLOCK和BMAL1蛋白形成異源二聚體，與DNA上的順式作用元件E-box結合，激活含E-box元件的基因轉錄，其中就包含、、和等生物鐘基因[28～30]。、翻譯成蛋白質后經(jīng)過二聚化形成復合物，在細胞核內與CLOCK/BMAL1異源二聚體相互作用抑制它們的活性，從而抑制自身轉錄，之后CRY和PER蛋白被降解，抑制作用減弱，重新開始轉錄激活，、、、組成了生物鐘的主反饋環(huán)路[31～34]。表達受到CLOCK/BMAL1復合物調控，同時Rev-erbα能夠與RORE序列結合抑制的表達，ROR也能結合RORE序列影響相關基因的表達[30,35]。和基因啟動子區(qū)也包含RORE序列，因此也會受到和的調控[36,37]。D-box元件是晝夜節(jié)律調控中的重要順式元件，E4BP4與其結合介導轉錄抑制，DBP、TEF、HLF與D-box結合則會激活轉錄，、等生物鐘基因就包含D-box元件[38～40]。生物鐘主反饋環(huán)和輔助反饋環(huán)之間緊密聯(lián)系，共同維持哺乳動物生物鐘的循環(huán)穩(wěn)定。哺乳動物與昆蟲相比，生物鐘主反饋環(huán)大致相同，但CRY蛋白的作用差異很大。在哺乳動物中，CRY是主反饋環(huán)的重要組成部分，而在昆蟲中CRY蛋白則扮演著光感受器的角色。

圖2 哺乳動物生物鐘分子機制

哺乳動物生物鐘主要由、、和組成，CLOCK/BMAL1二聚體在細胞核內激活含E-box元件的基因轉錄，、轉錄后在細胞質內翻譯，之后二者形成的二聚體在細胞核內抑制CLOCK/BMAL1的功能，之后二者降解，重新開始轉錄激活。?表示對相應的蛋白質翻譯后修飾起抑制作用。

在哺乳動物生物鐘中，泛素化、磷酸化等蛋白質的翻譯后修飾對維持其正常水平也極為重要。泛素-蛋白酶體途徑能夠通過影響關鍵蛋白的降解來控制細胞的基本生命活動[41]。FBXL3、β-TrCP和UBE3A分別是CRY、PER和BMAL1蛋白泛素化降解途徑中的重要組成部分，F(xiàn)BXL21則與FBXL3功能拮抗，能通過參與泛素化途徑使CRY蛋白穩(wěn)定并積累，USP7則能去泛素化CRY使其穩(wěn)定[35,36,38,40,42]。蛋白質的磷酸化參與多種細胞過程，同樣對生物鐘蛋白的功能也具有重要意義。如AMPK能夠使CRY磷酸化，CK1δ和CK1ε促進PER蛋白磷酸化，這種修飾有利于兩種蛋白的泛素化降解[37,39]。此外，CDK5和AKT能夠影響CLOCK的磷酸化并影響其亞細胞定位，CK2能夠促進BMAL1和PER的磷酸化，PPP4則能夠抵消BMAL1的磷酸化作用[43～47]。哺乳動物中O-GlcNAc糖基化修飾主要是通過有節(jié)律的修飾BMAL1和CLOCK蛋白影響生物鐘，抑制二者的泛素化從而穩(wěn)定它們，這樣能夠保證BMAL1/CLOCK復合物靶基因的穩(wěn)定表達[19]。PER、CRY的O-GlcNAc糖基化修飾，則在穩(wěn)定生物鐘中起著輔助作用[20]。輔助反饋環(huán)中的Rev-erbα還能夠與OGT形成復合物，調節(jié)O-GlcNAc糖基化水平[20,48]。

在哺乳動物的生物鐘維持中，miRNA同樣發(fā)揮著重要調控作用。DICER是miRNAs加工成熟所需的酶，DICER敲除小鼠的miRNA表達降低超過10倍，晝夜節(jié)律縮短2小時，產(chǎn)生這種現(xiàn)象是由于的翻譯加快導致負反饋抑制提前[49]。另外，miR-24、miR-29、miR-30和miR-96等也都是PER家族的有效抑制劑，能夠干擾的翻譯并抑制蛋白質的合成[49～51]。除了作用于PER家族，miRNA還能通過影響其他生物鐘基因的表達和翻譯，破壞生物節(jié)律的正常維持。如miR-142-3p和miR-211能夠在轉錄后水平調節(jié)的表達，miR-17-5p和miR-455則通過調節(jié)的mRNA和蛋白水平，進而影響蛋白的持續(xù)合成和晝夜節(jié)律的振蕩[52～55]。

2 年節(jié)律產(chǎn)生的機制及生物鐘在其中的調控角色

隨著地球的公轉，地球的中高緯度地區(qū)呈現(xiàn)出四季的變化。相對于低緯度地區(qū)，中高緯度地區(qū)的環(huán)境因素如光照時長、溫度和降雨量等在一年中呈現(xiàn)出急劇的變化。一年四季，春夏秋冬，都有規(guī)律可循。生活在這些地區(qū)的生物經(jīng)過長期的進化，衍生出了一套內在的時間機制來感知季節(jié)性變化，使其生理條件能夠適應即將到來的季節(jié)。

動物季節(jié)性生理機制的產(chǎn)生是由于外部環(huán)境因素和機體自身的各個系統(tǒng)之間協(xié)同作用的結果，其中外部環(huán)境的變化主要包括光照、溫度、濕度的年變化。在這些外部因素中，光照是最重要和直接的影響因素。因為相對于溫度等條件，光照長度的年周期變化更為穩(wěn)定，這種一年一度的穩(wěn)定變化能夠提供關鍵的外部線索[56]。通過光照這個外部線索，機體能夠感知所處的季節(jié)信息，從而調節(jié)自身狀態(tài)以適應環(huán)境變化。如昆蟲的季節(jié)性滯育、哺乳動物的季節(jié)性發(fā)情、魚的季節(jié)性洄游、候鳥的季節(jié)性遷徙等，這些現(xiàn)象均是年節(jié)律的表現(xiàn)。在年節(jié)律現(xiàn)象中，昆蟲的季節(jié)性滯育、哺乳動物的季節(jié)性發(fā)情和鳥類的季節(jié)性繁殖研究較多，前兩者也是與農業(yè)生產(chǎn)聯(lián)系最近的兩種年節(jié)律。

2.1 年節(jié)律產(chǎn)生的機制

2.1.1 昆蟲的季節(jié)性滯育

滯育是指昆蟲在不利的季節(jié)，其發(fā)育和繁殖等活動停止或者變遲緩，代謝率受到抑制，對環(huán)境的耐受性增強，以適應環(huán)境季節(jié)性變化的現(xiàn)象[57,58]。昆蟲的滯育可分為滯育前期、滯育期和滯育后期3個階段，其主要的外部誘導因素是光照和溫度的變化，而在體內則會通過一系列的分子機制展現(xiàn)出來[58,59]。例如果蠅的眼缺失基因(eyes absent，)能夠解釋光周期和溫度的變化觸發(fā)滯育，是果蠅重要的季節(jié)傳感器[60]。對于昆蟲來說，生物鐘不僅對晝夜節(jié)律至關重要，對季節(jié)性滯育的發(fā)生也具有重要意義。昆蟲的滯育多發(fā)生在短光照時，而生物鐘基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)會破壞這種光周期反應。如短光照下的RNAi會誘導點蜂緣蝽()的卵巢發(fā)育，長光照時的RNAi則會誘導滯育發(fā)生[61]。

在昆蟲滯育發(fā)生中，激素起到了重要的調控作用。滯育激素(diapause hormone，DH)是由食道下神經(jīng)節(jié)(subesophageal ganglion，SG)分泌的激素，其在家蠶()的滯育啟動中具有重要意義，同時DH還能夠促進棉鈴蟲()的滯育終止[62,63]。保幼激素(juvenile hormone，JH)是許多昆蟲生長、繁殖等過程的重要調節(jié)因子，JH的分泌抑制與多數(shù)昆蟲的滯育發(fā)生相關，同時還能誘導雌性的生殖成熟[61,64]。JH的分泌會受到生物鐘基因影響，雌性點蜂緣蝽中的RNAi會抑制JH的分泌[61]。Ma等[65]研究發(fā)現(xiàn)，JH可能通過耐烯蟲酯基因依賴途徑(methoprene-tolerant dependent pathway)調節(jié)沙蔥螢葉甲()的生殖滯育。Batz等[66]發(fā)現(xiàn)，白紋伊蚊()胚胎滯育的發(fā)生可能與JH表達降低有關。在柑桔大實蠅()中，蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)會通過cAMP等信號通路促進其滯育終止的發(fā)生[67]。

2.1.2 哺乳動物的季節(jié)性發(fā)情

在哺乳動物中，光照是影響年節(jié)律產(chǎn)生的最重要因素。在季節(jié)性光照變化的識別中，臨界晝長(critical day length，CDL)是一個重要的概念，它是指動物能夠觸發(fā)自身相應的光周期反應(photo-periodic reaction)所需要的光照持續(xù)時間[56]。當達到臨界晝長時，生物體會表現(xiàn)出特定的生理現(xiàn)象，這就是光周期反應。如綿羊()是一種短日照發(fā)情動物，當光照時長低于臨界晝長時就會出現(xiàn)繁殖行為；鵪鶉()作為長日照發(fā)情動物，則在光照時長高于臨界晝長時出現(xiàn)繁殖行為。

光照是影響哺乳動物季節(jié)性發(fā)情最重要的外界因素，但機體無法直接識別光照信息，需要將這種外部信息轉化為能夠識別的生物信號。因此，機體自身的響應機制具有直接指導作用。褪黑素(melatonin，MEL)由松果體(pineal gland)分泌，其合成和分泌受光照抑制。研究表明褪黑素在黑暗后2小時內急劇增加，在光照后2小時內急劇下降[68]。因此，在短日照的冬季褪黑素分泌時間長，夏季則相反。褪黑素是向下丘腦和大腦其他部分傳遞光周期信息的重要信號，在光照長度變化的識別中發(fā)揮著重要作用[69]。在春分前切除西伯利亞倉鼠()的松果體，10周后給予模擬冬季短光照的褪黑素方案，性腺出現(xiàn)退化現(xiàn)象，與正常春季時出現(xiàn)性腺發(fā)育的狀態(tài)相反[70]。Casao等[71]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素和睪酮都有季節(jié)性變化，公羊生育能力的季節(jié)性變化涉及褪黑素和抗氧化防御系統(tǒng)之間的相互作用。因此，在哺乳動物體內，光周期的改變通過褪黑素分泌的變化體現(xiàn)，這對哺乳動物的晝夜節(jié)律和季節(jié)性生理的產(chǎn)生都具有重要意義。同時，光周期信息的傳遞離不開神經(jīng)傳導途徑，該途徑中涉及視網(wǎng)膜、視交叉上核以及室旁核(paraventricular nucleus，PVN)等。而某些特定腦核和神經(jīng)肽(如下丘腦弓狀核的kisspeptin細胞)在調節(jié)哺乳動物季節(jié)性發(fā)情中既發(fā)揮協(xié)同作用，在不同物種中也會存在差異性[72]。

哺乳動物自身繁殖活動的內部決定因素定位在下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)軸，該系統(tǒng)內相關激素的變化受到光照周期的調控。這條生理途徑的主要機制為：視網(wǎng)膜是哺乳動物的感光器官，視網(wǎng)膜接受外界的光照刺激后產(chǎn)生神經(jīng)沖動，神經(jīng)沖動由下視丘傳遞到SCN，SCN在感知到視網(wǎng)膜識別的外部光照信息變化后，使自身與外界周期同步，并編碼光照信息[73]。SCN中不同細胞生成的精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)在將自身的光照反應和內部生物鐘同步方面具有重要意義[74]。同時，神經(jīng)PAS蛋白(neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4，)在識別光照變化并夾帶SCN周期中扮演著重要角色，如敲除小鼠的節(jié)律出現(xiàn)延長并對光的反應能力減弱[74]。SCN作為哺乳動物的核心生物鐘起搏器，其產(chǎn)生的信號通過下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)、脊柱中間外側節(jié)前交感神經(jīng)，最終使頸上神經(jīng)節(jié)分泌去甲腎上腺素與松果體細胞上的受體結合，激活松果體褪黑素合成，完成將光照信息轉化為垂體結節(jié)部(pars tuberalis，PT)能夠識別的生理信號的改變[75～77]。在不同光照周期的情況下，褪黑素分泌的時長會出現(xiàn)對應的變化，褪黑素生理信號因此能準確反映晝夜的時長并更好地被生物體感應，從而驅動機體產(chǎn)生相應的節(jié)律生理學變化[78]。PT表達褪黑素受體(melatonin receptor，MT)，在感知到褪黑素表達的變化后，通過抑制PT中cAMP途徑影響生物鐘基因表達[79,80]。PT區(qū)一系列復雜的光照信號分子變化后分泌促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)，導致下丘腦基底部(medio-basal hypothalamus，MBH)II型脫碘酶(type II thyroid hormone deiodinase，DIO2)與III型脫碘酶(type III thyroid hormone deiodinase，DIO3)表達的變化。DIO2能夠促進四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4，甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)的前體形式)轉化為三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3，TH的活性形式)，DIO3則使T3轉變?yōu)闊o活性的形式，進而會影響下丘腦中促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)分泌的變化[81～83](圖3)。在短日照繁殖動物綿羊中，T3會使下丘腦GnRH的脈沖式釋放關閉，啟動休情生理機制[82,84]。而在長日照繁殖的西伯利亞倉鼠中，T3則會促進其發(fā)情[85]。

在上述生理途徑中，PT分泌的TSH是HPG軸激活的重要元素。TSH由α亞基和β亞基組成，其中(又稱為)表達在長短光照無顯著差異，在長光照下顯著增加，促進了TSH的產(chǎn)生[82]。因此，在長光照生理產(chǎn)生中扮演重要角色。在PT中，眼缺失基因3(eyes absent 3，)是一種強烈的長光照激活基因，在轉入長光照后即被激活轉錄[84]。褪黑素能夠影響PT中的表達，EYA3通過和SIX1協(xié)同激活表達，進而影響后續(xù)下丘腦中TSH參與的T3、T4轉化，因此是影響TSH的重要因子[86](圖3)。除了，針對影響哺乳動物季節(jié)性發(fā)情的其他相關基因，科研人員也進行了深入探索。例如在不同光照時長下，垂體的血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor A，)受到褪黑素影響，兩種重要的可變剪接體的表達出現(xiàn)相反的變化，影響垂體血管生成(增多或減少)，進而影響綿羊的季節(jié)性發(fā)情性狀[87]。另外，、、等基因被證明在哺乳動物季節(jié)性發(fā)情的調控中也具有重要作用[88～91]。

圖3 外界環(huán)境對哺乳動物季節(jié)性發(fā)情性狀的調控

外界環(huán)境的主要影響因素為光照，生物體通過褪黑素分泌的變化體現(xiàn)光照周期的變化，垂體結節(jié)部褪黑素受體感應褪黑素分泌變化，并通過一系列分子機制，影響生物體的下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸中激素分泌的變化。SCN：視交叉上核；MBH：下丘腦基底部；MEL：褪黑素；MT：褪黑素受體；：眼缺失基因3；TSH：促甲狀腺激素；/：促甲狀腺激素α/β亞基；TSHR：促甲狀腺激素受體；DIO2：脫碘酶 2；DIO3：脫碘酶 3；T3：三碘甲狀腺原氨酸；T4：四碘甲狀腺原氨酸，：親吻促動素1；：RF氨酸相關肽；GnRH：促性腺激素釋放激素；LH：促黃體素；FSH：促卵泡素。

2.1.3 鳥類的季節(jié)性繁殖

在脊椎動物中，鳥類的節(jié)律調控與哺乳動物存在很多相似之處。在生物鐘分子調控機制上鳥類與哺乳動物中保守性很高，也是通過BMAL1/CLOCK激活含E-box元件的基因轉錄，PER/CRY復合體負反饋抑制轉錄，但在鳥類中暫未發(fā)現(xiàn)的同源基因[92]。哺乳動物中，視網(wǎng)膜是唯一的光感受器，SCN是生物鐘核心起搏器。而鳥類還存在腦深部光感受器，如下丘腦、松果體等，研究發(fā)現(xiàn)鵪鶉的眼睛和松果體摘除并不會完全影響光照反應，另外視網(wǎng)膜、SCN和松果體相互作用形成的組合單元同時能夠發(fā)揮核心起搏器的功能[93]。

在鳥類中，下丘腦基底部(MBH)被認為是季節(jié)性繁殖產(chǎn)生的重要部位，下丘腦內表達的脊椎動物古視蛋白(vertebrate ancient，VA)、視蛋白5(opsin 5，OPN5)、黑視蛋白(melanopsin，OPN4)是幾個重要的腦深部光感受分子，它們能夠通過腦脊液(cerebros-pinal fluid，CSF)接觸神經(jīng)元直接投射到PT正中隆起的外部區(qū)域，誘導PT內TSH的產(chǎn)生和分泌，TSH誘導第三腦室(the third ventricle，3V)腹外側壁的伸長細胞中的表達，DIO2促進T4轉化為具有生物活性的T3。MBH中長時間誘導的T3會導致GnRH神經(jīng)末梢和膠質細胞過程的形態(tài)學改變，并誘導GnRH分泌，進而通過下丘腦-垂體-性腺軸影響鳥類的發(fā)情狀態(tài)[94～96](圖4)。

圖4 鳥類腦深部光感受器影響季節(jié)性發(fā)情的機制

VA：脊椎動物古視蛋白；OPN5：視蛋白5；OPN4：黑視蛋白；3V：第三腦室。

2.2 生物鐘影響年節(jié)律作用模型的提出

生物鐘能夠為生物體提供準確的計時機制，使生物能夠更準確地進行一系列重要行為和生理進程，對于生物的生長發(fā)育、繁殖和健康等具有重要意義。年節(jié)律能使生物在不利季節(jié)調整自身生理狀態(tài)，使其順利度過物質匱乏季節(jié)，如綿羊的季節(jié)性發(fā)情能夠使后代在適宜的季節(jié)出生，有利于提高后代的存活率[97]。

在季節(jié)性光周期的識別中，生物鐘扮演了重要角色。年度光周期的變化為季節(jié)的識別提供了穩(wěn)定的外部線索，而內源性的光周期計時器則能夠讓生物正確識別外部線索的變化。生物鐘作為生物體的一種計時機制，一直被認為對生物的季節(jié)識別具有重要意義。早在1936年，Bünning就提出了光周期響應的外部重合模型：當在光周期的光敏期(超過臨界晝長的時間段內，日照時長縮短光敏階段會被黑暗覆蓋)施加額外的光照刺激，會誘發(fā)相應的光周期反應[56]。如圖5所示，在鳥類中，如果在特定的光敏期給予光刺激能夠刺激睪丸的發(fā)育[98]。該結果與外部重合模型相符，表明影響生物體產(chǎn)生光周期反應的重要因素是光照刺激作用的時間點而不是暴露于光照下的總時長，暗示內源生物鐘可能參與了光周期的時間測量[56,98]。

同時，還有研究提出生物體識別光周期變化的內部模型：該模型認為機體存在多個內部晝夜節(jié)律振蕩器，其中一個的變化能夠與黎明重合，一個與黃昏重合，光的作用是夾帶兩個振蕩器，兩者的相位關系決定了機體對光周期變化的識別[99]。在哺乳動物PT中，生物鐘基因在白天達到表達高峰，的表達是在夜間早期達到高峰[100]。有研究者推測，和基因在不同光照時長下表達水平的相位遷移及其蛋白與蛋白之間的相互作用，是PT識別光周期變化的一種潛在機制[99～101]。這種分子機制與內部模型相吻合，暗示和可能分別作為黎明和黃昏振蕩器，而PT在連接褪黑素信號和后續(xù)HPG軸中扮演著重要角色，是生物產(chǎn)生年節(jié)律的重要誘導部位，這些結果表明生物體內部的分子計時機制對光周期的識別可能具有指導作用。在兩個作用模型中，都把生物鐘的作用放在了重要位置，認為其在連接外界光周期變化和內部季節(jié)性生理機制轉換中扮演著重要的紐帶作用。

圖5 鳥類光敏期施加光刺激促進睪丸生長

A：短光照處理(光敏期被黑暗覆蓋)；B：長光照處理；C：短光照處理，但在光敏期施加光照刺激。白色部分代表光照，黑色部分代表黑暗。

2.3 生物鐘對年節(jié)律影響的研究進展

2.3.1 昆蟲中生物鐘對年節(jié)律的影響

果蠅存在季節(jié)性滯育現(xiàn)象，其在短光照和低溫下會觸發(fā)這種生理機制[102]。在這種季節(jié)性生理現(xiàn)象中，()基因參與了光周期和溫度變化的識別[60]。在果蠅中EYA蛋白受到()的調節(jié)，TIM能夠在蛋白水平穩(wěn)定EYA；基因的無效突變會導致果蠅冬季滯育發(fā)生率降低，在長光照下過表達則會導致滯育的出現(xiàn)[60]。Pegoraro等[103]發(fā)現(xiàn)果蠅的生物鐘基因突變體per、tim、Clk的晝長(主觀白天的長度)測量會受到影響，per突變體的臨界晝長比野生型短幾個小時，導致對季節(jié)的識別出現(xiàn)變化，這會使per突變體在更短的光照下才能觸發(fā)滯育現(xiàn)象。這些結果表明，在果蠅中生物鐘基因與晝長測量存在著密切聯(lián)系，能夠為季節(jié)識別提供重要信息。在蟋蟀()中，CRY蛋白能夠參與晝長的測量，誘導對應的長光周期和短光周期反應產(chǎn)生[104]。生物鐘基因的變化影響昆蟲滯育除了涉及相應的基因，這一過程可能還會涉及到與滯育相關的激素。Cui等[105]研究發(fā)現(xiàn)，敲除家蠶基因會通過降低蛹期DH的表達水平和作用能力，減少蠶蛹滯育的發(fā)生。

2.3.2 哺乳動物中生物鐘對年節(jié)律的影響

在哺乳動物中，下丘腦視交叉上核是整個機體生物鐘的核心起搏器。同時，視交叉上核在光信息傳遞中也具有重要作用，能夠接收和感知視網(wǎng)膜識別的光照變化并編碼光周期信息，在使自身與外界光照信息同步后，將光照信息以生物信號的形式依次傳遞到松果體、垂體結節(jié)部、下丘腦，影響HPG軸等激素分泌系統(tǒng)，使生物體產(chǎn)生季節(jié)性生理變化，從而調節(jié)哺乳動物的年節(jié)律[106]。研究發(fā)現(xiàn)，SCN切除的動物無法產(chǎn)生光周期反應[107]。而且，不論是長日照繁殖動物還是短日照繁殖動物，如果SCN出現(xiàn)損傷，都會使對應的短光照生理機制無法觸發(fā)[108,109]。

在先前研究中，和基因的表達模式與哺乳動物光周期識別的內部模型相符，暗示了生物鐘在年節(jié)律的調控中具有重要意義。和促甲狀腺激素β亞基(thyrotrophin β subunit，)作為兩個重要的長光照誘導因子：其中轉錄起始位點附近有D-box元件；基因轉錄起始位點前的500 bp存在1個D-box和3個E-box元件(圖6)[77,110]。E-box和D-box是調節(jié)晝夜節(jié)律環(huán)路中的重要順式調控元件，含有這兩種元件的基因表達會出現(xiàn)晝夜節(jié)律性的周期變化[111]。這兩個元件的存在，表明和的表達會受到生物鐘的調控，暗示生物鐘及相關基因對年節(jié)律的產(chǎn)生具有調控作用。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律相關因子在綿羊休情和發(fā)情機制的激活中扮演著重要角色。Wood等[112]發(fā)現(xiàn)在長光照(夏季)時，垂體結節(jié)部(PT)誘導生物鐘基因以依賴于CLOCK/BMAL1二聚體的方式，作用于EYA3和TSH途徑觸發(fā)綿羊夏季休情；在短光照時(冬季)，褪黑素分泌時間延長，這樣會誘導等晝夜節(jié)律抑制因子的表達，抑制上述長光照激發(fā)的通路，使生物體無法觸發(fā)休情，從而產(chǎn)生冬季發(fā)情的生理機制(圖7)。褪黑素對生物識別光照周期變化具有重要意義，在PT中能夠通過抑制cAMP途徑影響生物鐘基因表達，黎明時褪黑素分泌的減少解除了cAMP途徑的抑制，因此對的表達高峰出現(xiàn)至關重要[80]。而和作為生物鐘負反饋抑制的重要元件，在PT中二者表達的相位關系可能在褪黑素和BMAL2/BMAL1/CLOCK復合體影響表達中起著連接作用。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)基因存在錯義突變位點，在常年發(fā)情綿羊中以突變型為主，在季節(jié)性發(fā)情綿羊中以野生型為主，并認為這可能是影響綿羊季節(jié)性發(fā)情觸發(fā)的重要突變[113]。FBXL3蛋白作為泛素連接酶E3的組成部分，能夠促進CRY蛋白的泛素化降解，影響生物鐘反饋環(huán)路，是晝夜節(jié)律維持的重要調控基因[44]。Naval-Sanchez等[114]在分析綿羊的馴化和表型多樣性時，比較了野生摩弗倫羊()和43個現(xiàn)代綿羊品種(野生摩弗倫羊相對家養(yǎng)綿羊品種季節(jié)性性狀表現(xiàn)更明顯)的基因組序列，發(fā)現(xiàn)在中存在的錯義突變位點可能在控制綿羊的季節(jié)性方面發(fā)揮作用。綜上所述，生物鐘環(huán)路內的基因及其調控基因在年節(jié)律的觸發(fā)中扮演了重要角色，其對光周期變化的識別具有重要意義。

圖6 TSHβ和EYA3啟動子區(qū)的D-box和E-box元件

(上)和(下)是垂體結節(jié)部(PT)兩種重要的長光照誘導因子，在觸發(fā)動物的長光照生理(如季節(jié)性發(fā)情綿羊的夏季休情)中扮演了重要角色。兩者的啟動子區(qū)包含E-box和D-box兩種順式作用元件，表明兩者的表達會受到生物鐘的調控。

圖7 綿羊長短光周期下的遺傳調控

因含有E-box元件，表達會受到生物鐘調控。夏季(長光照)時，(生物鐘重要成員)能夠依賴性地觸發(fā)EYA3途徑，使動物產(chǎn)生休情；冬季(短光照)時，該途徑會受到抑制，休情無法觸發(fā)，出現(xiàn)發(fā)情。

3 結語與展望

大部分生物為了適應外部環(huán)境的周期性變化，經(jīng)過長期進化形成內在的節(jié)律系統(tǒng)以調節(jié)自身狀態(tài)，最常見的是由于晝夜變化形成的晝夜節(jié)律和季節(jié)變化形成的年節(jié)律，它們與生命的生長發(fā)育、健康、繁殖等息息相關。如今人們對于晝夜節(jié)律的機制研究已經(jīng)有了很大的進展，動植物的相關分子機制已有較完善的解析。年節(jié)律產(chǎn)生機制的研究也已經(jīng)有了一些進展，如昆蟲中DH、JH等激素，綿羊中T3、T4的轉化和PRL、FSH、LH等激素分泌的變化，以及(昆蟲中為)、等基因都被認為參與了季節(jié)性生理機制的激活。

自光周期識別的外部和內部模型的提出開始，生物鐘對年節(jié)律的產(chǎn)生具有指導作用就是一項不可忽視的方向。如褪黑素作為哺乳動物反應外部光照變化的生理信號，能夠反應外部光照時長的變化，在晝夜節(jié)律和年節(jié)律的指導中都扮演了重要角色。生物鐘相關通路通過順式作用元件影響了體內大部分基因的表達，目前也有研究表明相關基因的變化(如綿羊、果蠅)在不同季節(jié)的生理機制觸發(fā)中起到一定的指導作用，部分突變也會對年節(jié)律的產(chǎn)生造成影響。但是，生物鐘通路內各基因之間關系密切，而其對年節(jié)律影響的研究僅為少數(shù)幾個基因，大多數(shù)生物鐘基因在年節(jié)律產(chǎn)生中是否扮演了一定的角色還尚未報道，或者研究僅在猜測階段，相關詳細的機制尚未有較深入的研究。因此，依據(jù)現(xiàn)有的生物鐘與動物季節(jié)識別關系的研究，進一步研究生物鐘通路內其他基因和相關調控基因對年節(jié)律產(chǎn)生的影響機制及一些重要突變是否在相關性狀(如綿羊季節(jié)性發(fā)情)中起到積極意義，對年節(jié)律進行更細致的解析，進而能夠為在基因層面改善農業(yè)病蟲害和部分家養(yǎng)動物的季節(jié)性發(fā)情性狀等提供新思路。

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The mechanism of circadian clock and its influence on animal circannual rhythm

Yang Yang1, Mingxing Chu1, Qiuyue Liu2

The circadian clock exists in almost all life forms, and is an internal activity generated by organisms adapting to the daily periodic changes of the external environment. The circadian clock is regulated by the transcription-translation-negative feedback loop in the body, which can regulate the activities of tissues and organs. Its normal maintenance is important for the health, growth, and reproduction of organisms. In contrast, due to the season changes of the environment, organisms have also formed annual cycle physiological changes in their bodies, such as seasonal estrus, etc. The annual rhythm of living things is mainly affected by environmental factors such as photoperiod, and is related to gene expression, hormone content, morphological changes of cell and tissues. Melatonin is an important signal to recognize the changes of photoperiod, and the circadian clock plays an important role in the pituitary to interpret the signal of melatonin and regulate the changes of downstream signals, which plays an important guiding role in the recognition of annual changes in the environment and the generation of the body's annual rhythm. In this review, we summarize the progress of research on the mechanism of action of circadian clocks in influencing annual rhythms, by introducing the mechanisms of circadian and annual rhythms generation in insects and mammals, and in the context of annual rhythms in birds, with the aim of providing a broader range of ideas for future research on the mechanism of annual rhythms influence.

circadian clock; circannual rhythm; molecular mechanism; insect; mammals

2023-01-09;

2023-04-14;

2023-04-24

國家自然科學基金項目(編號：32172704)，中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(編號：CAAS-ZDRW202106，ASTIP-IAS13)，財政部和農業(yè)農村部國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(編號：CARS-38)和中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項(A類)(編號：XDA24030205)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 32172704), the Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (Nos. CAAS-ZDRW202106, ASTIP-IAS13), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (No. CARS-38), and the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDA24030205)]

楊陽，碩士，專業(yè)方向：動物繁育原理與技術。E-mail: yy176362@163.com

劉秋月，博士，副研究員，研究方向：羊優(yōu)異繁殖性狀分子機理。E-mail: qyliu@genetics.ac.cn

儲明星，博士，研究員，研究方向：羊優(yōu)異繁殖性狀分子機理。E-mail: mxchu@263.net

10.16288/j.yczz.23-008

(責任編委: 徐瓔)