不同濃度激素配比對防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)及再分化的影響

袁夢瑤　張東向　趙越　李婷

摘要 以防風(fēng)的有活力的種子為材料，通過栽種土培苗，比較不同來源外植體愈傷組織的形成能力，并通過不同激素配比調(diào)整，研究愈傷組織分化生根、生芽的適宜條件，進(jìn)而建立防風(fēng)組培苗再生體系。結(jié)果表明，以幼葉為外植體所誘導(dǎo)出的愈傷組織分化情況最佳，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率達(dá)86.6%；最佳繼代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，增殖倍數(shù)為3.2；最佳誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA，生芽率為100%；最佳誘導(dǎo)不定根最佳培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IAA，生根率為46.8%。

關(guān)鍵詞防風(fēng)；組織培養(yǎng)；愈傷組織；叢生芽；不定根

中圖分類號S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0178-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.041開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Different Concentration Hormone Ratios on Callus Induction and Redifferentiation of Saposhnikovia divaricata

YUAN Mengyao，ZHANG Dongxiang，ZHAO Yue et al（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar，Heilongjiang 161006）

AbstractUsing the active seeds of Saposhnikovia divaricata as materials，the ability of callus formation from explants from different sources was compared by planting soil culture seedlings，and through adjusting the ratio of different hormones，the suitable conditions for callus differentiation，rooting and budding were studied，and then the regeneration system of Saposhnikovia divaricata tissue culture seedlings was established.The results showed that the callus differentiation induced from young leaves was the best，and the optimal induction medium was MS+1.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，with an induction rate of 86.6%.The optimal subculture medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，the proliferation rate was 3.2.The optimal medium for inducing clustered buds was MS+0.3 mg/L 6-BA，and the budding rate was 100%;The optimal medium for inducing adventitious roots was MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/LIAA，and the rooting rate was 46.8%.

Key wordsSaposhnikovia divaricata;Tissue culture;Callus;Clustered buds;Adventitious root

防風(fēng)［Saposhnikovia divaricata（Trucz.） Schischk.］屬傘形科（Umbelliferae）植物［1］，又名山芹菜、川防風(fēng)、屏風(fēng)等［2］，產(chǎn)于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等省區(qū)，以未抽蘗的干燥根入藥；主要成分包括多糖類、揮發(fā)油、蔗糖、原酮類、揮發(fā)油、香豆素類等化合物［3］，具有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、抗凝血的作用，可以提高機(jī)體免疫力。近年來由于隨著國內(nèi)外市場對野生防風(fēng)需求量的不斷增加，野生資源已經(jīng)不能滿足市場需求，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及再分化體系的建立研究，對于防風(fēng)優(yōu)良無性系的快速繁殖具有重要意義。

中藥材是我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)賴以生存和可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，隨著人類醫(yī)藥事業(yè)快速發(fā)展，對藥用植物的需求量逐年上升，導(dǎo)致藥用植物資源日漸匱乏［4］。該試驗(yàn)采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，研究不同激素配比對防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)增殖及再分化形成不定根和叢生芽的影響，以期為防風(fēng)快繁體系的建立和中草藥栽培提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料防風(fēng)種子由齊齊哈爾市中北藥材農(nóng)民專業(yè)合作社提供，經(jīng)專家鑒定為防風(fēng)［Saposhnikovia divaricate （Turcz.） Schisck.］的干燥成熟種子，保存于4 ℃冰箱中。

1.2幼苗的培養(yǎng)

1.2.1實(shí)生苗培養(yǎng)。選取當(dāng)年采收成熟且飽滿干燥的防風(fēng)種子，先在蒸餾水中浸泡24 h后，然后播種于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)事先盛滿土的花盆中，待植株高3～4 cm時(shí)待用。

1.2.2無菌苗培養(yǎng)。取一定量的防風(fēng)種子，先在無菌水中浸泡12 h，注意無菌水始溫50 ℃（時(shí)間5 min）。在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行無菌操作，先用75%乙醇浸泡1～2? min后，進(jìn)行初消毒；然后倒去乙醇，轉(zhuǎn)移至0.1%HgCl溶液中浸泡8? min（其間要不停搖動），進(jìn)行復(fù)消毒；最后倒去HgCl溶液，用無菌水反復(fù)沖洗5～7次，用濾紙吸取多余水分，之后將其轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基，使之進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)，當(dāng)苗 3～4 cm高時(shí)備用。

1.3防風(fēng)愈傷組織的誘導(dǎo) 取防風(fēng)實(shí)生苗植株，經(jīng)表面消毒處理，將幼莖和幼根切成約1 cm長，葉片切成0.5 m2大小，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上。采用MS培養(yǎng)基，添加0.8%瓊脂、3%蔗糖及各種激素，pH 5.8～5.9，在121 ℃高壓滅菌30 min。培養(yǎng)條件分為光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃。每瓶接種5塊，每種處理重復(fù)8次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率=長出愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%

1.4防風(fēng)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將生長良好的愈傷組織切成0.5 g的小塊，轉(zhuǎn)接到含有不同激素配比的繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，研究不同NAA、6-BA和2，4-D配比對愈傷組織增殖狀況的影響，共設(shè)置7組處理。培養(yǎng)條件分為光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每瓶接種3塊，每種處理重復(fù)8次，30 d后記錄愈傷組織長勢、顏色和狀態(tài)，并計(jì)算增殖倍數(shù)。

增殖倍數(shù)=（愈傷組織繼代培養(yǎng)后的鮮重－愈傷組織繼代培養(yǎng)前的鮮重）/愈傷組織繼代培養(yǎng)前的鮮重

1.5防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽將繼代培養(yǎng)中生長旺盛的愈傷組織切成0.5 g的小塊，轉(zhuǎn)接到含有不同激素配比的誘導(dǎo)叢生芽MS培養(yǎng)基上，分析6-BA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）、KT（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）對愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽分化的影響，共設(shè)置10組處理。培養(yǎng)條件分為光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每瓶接種4塊，每種處理重復(fù)8次，30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽生長情況，并計(jì)算叢生芽生芽率。

叢生芽生芽率=生芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%

1.6防風(fēng)愈傷組織誘導(dǎo)不定根將繼代培養(yǎng)中生長旺盛的愈傷組織切成0.5 g的小塊，轉(zhuǎn)接到含有不同激素配比的不定根分化MS培養(yǎng)基上，分別研究不同濃度NAA、6-BA與IAA組合對愈傷組織不定根形成的影響，分別設(shè)置5和15組處理。培養(yǎng)條件分為光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每瓶接種3塊，每種處理重復(fù)8次，30 d后統(tǒng)計(jì)根數(shù)，測量根長，并計(jì)算不定根生根率。

不定根生根率=長出不定根的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%

1.7數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同萌發(fā)途徑對防風(fēng)種子發(fā)芽率的影響分別比較實(shí)生栽培途徑和無菌培養(yǎng)操作下種子的萌發(fā)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），防風(fēng)種子總體萌發(fā)率不高；相比之下實(shí)生苗的萌發(fā)情況較好，發(fā)芽率達(dá)20.80%；而無菌苗僅萌發(fā)1株，發(fā)芽率為0.40%。出現(xiàn)這種情況的原因一方面可能是由于防風(fēng)種子中抑制物質(zhì)的存在［5］，另一方面可能是無菌培養(yǎng)過程中表面消毒處理時(shí)間過長，影響到種子活力，導(dǎo)致種子發(fā)芽率下降。因此在后續(xù)工作中，都是以實(shí)生苗為外植體材料。

2.2不同激素組合對防風(fēng)幼葉、幼莖誘導(dǎo)愈傷組織形成的影響為篩選出最適宜后續(xù)分化培養(yǎng)的愈傷組織，該研究分別采用了防風(fēng)的幼根、幼莖、幼葉作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，幼葉作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，最佳激素組合為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，誘導(dǎo)的愈傷組織生長狀態(tài)良好，呈淡黃色致密松散狀，所得愈傷組織出愈時(shí)間短，數(shù)量多且質(zhì)量好，后續(xù)分化能力強(qiáng)，是比較理想的外植體。其次是幼莖作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，雖愈傷組織生長狀態(tài)致密，顏色呈淡黃色，但誘導(dǎo)率沒有幼葉誘導(dǎo)率高。在試驗(yàn)中幼根未能誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.3不同激素組合對防風(fēng)愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響為促進(jìn)防風(fēng)愈傷組織的增殖，該研究分別用 2，4-D、NAA、6-BA組合，比較愈傷組織長勢和增殖倍數(shù)，結(jié)果見表3。從表3可以看出，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA是誘導(dǎo)愈傷組織增殖最適宜的生長素組合，此時(shí)的愈傷組織呈淡黃色、疏松顆粒狀，整體長勢最好，增殖倍數(shù)高達(dá)3.2，而2，4-D對愈傷組織增殖作用不明顯。但當(dāng)NAA濃度增大時(shí)，愈傷組織的增殖有所降低。

2.4不同濃度6-BA對防風(fēng)愈傷組織叢生芽形成的影響不同濃度的6-BA均可以誘導(dǎo)出叢生芽的生成，經(jīng)方差分析0.3 mg/L 6-BA對叢生芽的誘導(dǎo)影響顯著。從表4可以看出，在光暗交替下，0.3 mg/L 6-BA的生芽率最高，達(dá)100%，多數(shù)愈傷組織生長狀態(tài)良好、能夠誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)量多，且分化的叢生芽強(qiáng)壯、芽長；當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，雖然有不定芽形成，但愈傷組織生長存在褐化現(xiàn)象，誘導(dǎo)的叢生芽瘦弱、矮、數(shù)量少，叢生芽生芽率僅為43.75%。在6-BA濃度為0.1～0.3? mg/L時(shí)，叢生芽生芽率與生長狀態(tài)呈遞增趨勢；當(dāng)6-BA濃度大于0.3? mg/L時(shí)，叢生芽的生芽率逐漸遞減。由于 6-BA 在適宜的濃度具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長、促進(jìn)細(xì)胞分化及物質(zhì)的合成和運(yùn)輸、影響細(xì)胞中各種酶的活性等作用［5］，如果濃度過低，容易形成多核體阻止細(xì)胞分化，加速細(xì)胞衰老，逐漸死亡;而高濃度的6-BA 使細(xì)胞體積因強(qiáng)烈的分裂活動而急劇縮小，已形成的愈傷組織不能正常生長，逐漸變褐［6］。

2.5不同濃度KT對防風(fēng)愈傷組織叢生芽形成的影響從表5可以看出，不同濃度的KT對防風(fēng)愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)效果并不明顯，在光暗交替下，在不同濃度的KT誘導(dǎo)下，生芽率最高為75.0%，最低為65.6%。在MS+0.1 mg/L KT的培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)量多、芽長，隨著KT濃度的增加，芽的誘導(dǎo)率未有明顯的變化，但愈傷組織生長狀態(tài)出現(xiàn)褐化，且叢生芽數(shù)量也在逐漸減少，說明高濃度的KT不適于誘導(dǎo)防風(fēng)叢生芽。

2.6不同激素組合對防風(fēng)愈傷組織不定根形成的影響

2.6.1不同濃度的IAA與NAA組合對防風(fēng)愈傷組織不定根形成的影響。從表6可以看出，不同濃度的 IAA 和NAA對誘導(dǎo)防風(fēng)不定根的形成促進(jìn)效果不明顯。將愈傷組織接種到不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織的不定根生根率和生長差異很大。在光暗交替環(huán)境下，處理②不定根生根率最大，為50.0%，平均根長為4.6 cm；處理①次之，生根率為37.5%，平均根長為3.4cm；處理④生根率最低，為12.5%，平均根長為2.5 cm，此組處理中生根率比較低，多為須根。

2.6.2不同濃度的6-BA和IAA組合對防風(fēng)愈傷組織不定根形成的影響。從表7可以看出，在單獨(dú)添加IAA的處理中，含有低濃度的IAA的培養(yǎng)基上有不定根的生成，而高濃度的IAA沒有誘導(dǎo)出不定根。而以0.2? mg/L 6-BA為基礎(chǔ)，添加不同濃度的IAA時(shí)，愈傷組織的生根率隨著IAA濃度的增加呈現(xiàn)先下降再上升的循環(huán)變化趨勢。

處理⑨愈傷組織的生根率最高，為46.8%，平均根長為2.7 cm，根形多數(shù)粗壯，而生芽率為53.3%；其次是處理，生根率較高，為41.6%，平均根長為3.2 cm，多數(shù)根形較粗壯，生芽率為50.0%；處理④和處理⑤沒有成功誘導(dǎo)出不定根，但有不定芽的形成，生芽率分別為40.6%和40.0%。處理即MS+0.5? mg/L 6-BA +1.0? mg/L IAA，不定芽的誘導(dǎo)率為100.0%，但愈傷組織的生根率僅為16.7%，平均根長為1.8 cm，說明使用不同濃度的生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的結(jié)果也不盡相同。

3討論

利用防風(fēng)的幼莖能誘導(dǎo)出愈傷組織，幼葉的誘導(dǎo)率高且愈傷組織生長情況優(yōu)于幼莖的愈傷組織。愈傷組織從結(jié)構(gòu)、生長速度、生長狀態(tài)都可以分成不同類型，它的生理特性由組成它的細(xì)胞類型決定［6］，根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康?，需要誘導(dǎo)不同的愈傷組織，該試驗(yàn)所需的愈傷組織結(jié)構(gòu)質(zhì)地松散，這類愈傷組織由從里到外相同且分散的多細(xì)胞形成，這類細(xì)胞彼此分開，分裂能力強(qiáng)、細(xì)胞質(zhì)濃度大，適于建立防風(fēng)的再分化體系［7］。

該試驗(yàn)中，運(yùn)用了激素及其不同的組合來誘導(dǎo)防風(fēng)的愈傷組織，其中生長素和細(xì)胞分類素是已知的2種重要的調(diào)控細(xì)胞生長和分化的植物激素［8-9］。張家菁等［10］研究表明不同激素組合對愈傷組織的形成影響很大，生長素2，4- D是愈傷組織形成所必不可少的 ，故在外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過程中，每組合均添加了不同濃度的2，4-D。在誘導(dǎo)防風(fēng)愈傷組織分化的過程中發(fā)現(xiàn)，6-BA對愈傷組織的誘導(dǎo)效果好，尤以0.3? mg/L的6-BA誘導(dǎo)的愈傷組織生長狀態(tài)良好，呈疏松顆粒狀，且再分化的叢生芽數(shù)量多、芽長，對比其他組合及濃度具有明顯優(yōu)勢，但并不是濃度越高誘導(dǎo)效果越好，高濃度的6-BA對愈傷組織分化起抑制作用。

4結(jié)論

（1）就外植體而言，以幼葉為外植體所誘導(dǎo)出的愈傷組織分化情況最佳，最高誘導(dǎo)率為86.6%。

（2）在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA培養(yǎng)基上，防風(fēng)愈傷組織增殖倍數(shù)高，為3.2，愈傷組織生長速度快且質(zhì)地疏松，生長狀態(tài)良好。

（3）在MS+0.3 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，防風(fēng)叢生芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，生芽率達(dá)到100.0%，芽數(shù)多且芽長，分化程度高。

（4）最佳誘導(dǎo)不定根培養(yǎng)基為MS+0.4? mg/L IAA+0.2 mg/L 6-BA，生根條數(shù)多且相對粗壯，生根率為46.8%，平均根長為2.7 cm。

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