基于PI3K/Akt 信號通路探討重樓皂苷Ⅶ對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

侯亞妮，孫中華，劉志勇，褚志杰，白克運(yùn)

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

結(jié)直腸癌（CRC）是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，是最常見的消化道惡性腫瘤，85%以上CRC 由息肉發(fā)展為腺瘤再轉(zhuǎn)為腺癌，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升的趨勢［1-3］。 由于前期發(fā)病癥狀不明顯，CRC 發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)入中晚期，臨床中多采用手術(shù)切除，輔以放療、化療，但是治療周期長，不良反應(yīng)明顯，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

近年來中藥在癌癥治療中發(fā)揮了重要作用。 通過查詢2020 年《中國藥典》得知，重樓的重要組成成分為重樓皂苷（PP），包含重樓皂苷Ⅰ（PPⅠ）、重樓皂苷Ⅱ（PPⅡ）以及重樓皂苷Ⅶ（PPⅦ）。 PP 有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬、抑制新生血管形成、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用［4］。 與經(jīng)典的細(xì)胞毒性藥物相比，現(xiàn)代抗癌藥物更傾向于針對癌癥中作用突出的各種信號通路。磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面起到重要作用，與癌細(xì)胞增殖和凋亡、周期調(diào)控、血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，PI3K/Akt 信號通路是PP 抗CRC 的核心通路，具有重要研究價(jià)值［6］。 然而，關(guān)于PPⅦ是否能夠通過調(diào)控PI3K/Akt 信號通路抑制CRC 發(fā)生發(fā)展，尚未見報(bào)道。 本研究旨在闡明PPⅦ對CRC 細(xì)胞增殖的抑制作用和潛在分子機(jī)制，為PP 類藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院遲莉麗課題組惠贈(zèng)，人結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，PPⅠ（A0386）、PPⅡ（A0387）、PPⅦ（A0390）購自成都曼斯特生物科技有限公司。RPIM-1640 培養(yǎng)基（CM10040）、Ham’s F-12K 培養(yǎng)基（CM10025）、胰蛋白酶（CC017-500）、青霉素-鏈霉素（CC004）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（CC008）均購自中科邁晨科技有限公司，胎牛血清（04-001-1ACS）購自Biological Industries，BeyoClickTM EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（C0088S）、SDS-PAG 凝膠配置試劑盒（P0012A）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA 濃度檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，抗體蛋白激酶B（Akt，＃4685）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，＃4060）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K，＃4257）、磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K，＃4228）均購自賽信通生物試劑有限公司，甘油醛3 磷酸脫氫酶（GAPDH）（60004-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗鼠（ZB-2305）、山羊抗兔（ZB-2301）均購自北京中杉金橋科技生物有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（WBKLS0500）購自默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗，配置成完全培養(yǎng)基，HT29 細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基中，LoVo 細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于Ham’s F-12K培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至細(xì)胞培養(yǎng)皿面積的80%～90%，按照1∶3（HT29）和1∶2（LoVo）的比例胰酶消化傳代。 取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 重樓皂苷配置

取1 mg 藥物溶解到1 mL DMSO 中，獲得終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的藥物母液，存于-20 ℃長期避光保存。 取10 μL 藥物母液用每種細(xì)胞所需培養(yǎng)基定容至1 mL，獲得終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的藥物母液，短期4 ℃避光保存，用前以培養(yǎng)基稀釋。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的HT29 和LoVo 細(xì)胞，PBS 沖洗兩遍，胰酶消化離心后，加入完全培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。 將細(xì)胞接種于96 孔板，調(diào)整每孔細(xì)胞濃度為8×103個(gè)細(xì)胞，定容至100 μL，培養(yǎng)過夜后細(xì)胞生長融合至細(xì)胞培養(yǎng)孔板面積的50%，并加入梯度濃度的PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ和順鉑，每種藥物設(shè)置1 個(gè)主孔與4 個(gè)復(fù)孔，處理48 h，隨后每孔加入0.5%的MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 加入DMSO 150 μL，放入酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度。 分析并計(jì)算藥物的最大半抑制濃度值（IC50值）。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的HT29 和LoVo 細(xì)胞，PBS 沖洗兩遍，胰酶消化離心后，加入完全培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。 將細(xì)胞以500 個(gè)/孔接種到6 孔板，培養(yǎng)24 h 后，設(shè)空白組（0 μg/mL）及PPⅦ給藥組，給藥組加入梯度濃度的PPⅦ（0.375 μg/mL、0.750 μg/mL），置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 更換含藥的完全培養(yǎng)基1 次，10 d 后終止培養(yǎng)，4%甲醇固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 沖洗兩遍，拍照并計(jì)數(shù)。 克隆抑制率（%）=［（空白組克隆形成率- 給藥組克隆形成率）/空白組克隆形成率］×100%。

1.2.5 EdU 細(xì)胞增殖檢測（TMB 法）

取對數(shù)生長期的HT29 和LoVo 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。 將細(xì)胞接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×103個(gè)細(xì)胞每孔，定容至100 μL，培養(yǎng)過夜后細(xì)胞密度達(dá)50%，并加入梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預(yù)48 h 后終止培養(yǎng)，每孔加入2×EdU 工作液100 μL，37 ℃孵育2 h，去除培養(yǎng)基，加入4%甲醇固定15 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，加入100 μL 通透液，孵育15 min，PBS 沖洗2 次，每次5 min，加入內(nèi)源性過氧化物酶100 μL，孵育20 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，制備Click 反應(yīng)液，每孔加入50 μL，避光孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min，制備Streptavidin-HRP 工作液，每孔加入20 μL，孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次2 min，加入100 μL TMB 顯色液，孵育30 min，放入酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（OD）。 細(xì)胞增殖率（%）=（對照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值）/對照組OD 值。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的HT29 和LoVo 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。 將細(xì)胞以8×106個(gè)/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預(yù)48 h 后終止培養(yǎng)，將細(xì)胞刮下收集到EP 管中，離心去上清液，僅保留細(xì)胞團(tuán)，按照裂解液∶蛋白酶抑制劑PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例混勻，配置到EP 管中，冰上裂解30 min。 4 ℃條件下，13 200 r/min 離心15 min，離心半徑為6 cm，取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，根據(jù)結(jié)果使用PBS調(diào)整蛋白濃度，95 ℃加熱5 min 使蛋白變性。 每個(gè)泳道上樣30 μg 蛋白，80 V 恒壓條件下10% SDS-PAGE膠分離蛋白后，260 mA 轉(zhuǎn)膜（PVDF 膜）2 h，用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液封閉1 h（磷酸化指標(biāo)用5%BSA 封閉1 h）。 分別孵育PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 抗體（1∶1000），4 ℃條件下孵育過夜。 TBST 洗膜3 次，每次10 min。 室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 發(fā)光液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重樓皂苷對HT29 和LoVo 細(xì)胞活力的影響

重樓皂苷對細(xì)胞活力的影響，用MTT 法進(jìn)行檢測。 采用梯度濃度的重樓皂苷和順鉑（陽性對照）分別干預(yù)HT29 細(xì)胞和LoVo 細(xì)胞48 h，MTT 法檢測細(xì)胞活力。 結(jié)果表明，PPⅦ能有效降低HT29 和LoVo 細(xì)胞的活力。 見圖1。 通過對IC50值分析發(fā)現(xiàn)，PPⅦ干預(yù)HT29 細(xì)胞的IC50值為（6.94±0.52）μg/mL，干預(yù)LoVo 細(xì)胞的IC50值為（5.75±0.31）μg/mL。低于順鉑干預(yù)的HT29 細(xì)胞（12.18±1.33）μg/mL 和LoVo 細(xì)胞（11.80±1.66）μg/mL，而PPⅠ和PPⅡ?qū)?yīng)數(shù)值均高于順鉑，見表1。 據(jù)此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用PPⅦ進(jìn)行。

圖1 重樓皂苷（PP）Ⅰ、PPⅡ、PPⅦ、順鉑對人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 和LoVo 活力的影響

表1 重樓皂苷與順鉑對應(yīng)的IC50 值比較

2.2 PPⅦ抑制HT29 和LoVo 細(xì)胞的克隆形成能力

由于克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞種植數(shù)量較少，設(shè)定質(zhì)量濃度3 μg/mL、6 μg/mL 均無法產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)，故依次減少藥物質(zhì)量濃度直至0.75 μg/mL 可形成細(xì)胞團(tuán)。結(jié)果顯示，與0 μg/mL 組比較，0.75 μg/mL 組能顯著抑制HT29 的克隆形成數(shù)目（P＜0.01）。 對LoVo 細(xì)胞，0.375 μg/mL、0.750 μg/mL 劑量組的PPⅦ可顯著抑制其克隆形成數(shù)目（P＜0.05）。說明隨著PPⅦ質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少，對克隆形成的抑制率升高。 見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞克隆形成情況影響的比較（）

表2 不同質(zhì)量濃度重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞克隆形成情況影響的比較（）

注：與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與0.375 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 克隆形成數(shù)/個(gè) 克隆抑制率/%HT29 細(xì)胞 LoVo 細(xì)胞 HT29 細(xì)胞 LoVo 細(xì)胞0 μg/mL 組 152.00±16.39 74.00±3.27 - -0.375 μg/mL 組 120.67±16.98 57.00±2.45＊ 20.89±3.97＊ 22.97±0.09＊0.750 μg/mL 組 25.67±11.26＊＃ 27.33±2.05＊＃ 83.62±6.54＊＃ 62.95±3.63＊＃

2.3 PPⅦ抑制HT-29 和LoVo 細(xì)胞的增殖能力

使用BeyoClickTM EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測PPⅦ對細(xì)胞增殖情況的影響，PPⅦ干預(yù)HT29細(xì)胞的IC50值為（6.94±0.52）μg/mL，干預(yù)LoVo 細(xì)胞的IC50值為（5.75±0.31）μg/mL，故選擇梯度濃度PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）干預(yù)細(xì)胞48 h后，檢測450 nm 處吸光度。 發(fā)現(xiàn)與0 μg/mL 組比較，PPⅦ質(zhì)量濃度為3 μg/mL、6 μg/mL 組增殖率均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 與3 μg/mL 組比較，6 μg/mL 組HT29 細(xì)胞增殖率降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），LoVo 細(xì)胞增殖率降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果說明隨著PPⅦ質(zhì)量濃度增加至IC50值，細(xì)胞增殖能力顯著減弱。見表3。

表3 不同質(zhì)量濃度重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞增殖影響比較（）

表3 不同質(zhì)量濃度重樓皂苷Ⅶ對細(xì)胞增殖影響比較（）

注：與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 增殖率/%HT29 細(xì)胞 LoVo 細(xì)胞0 μg/mL 組 - -3 μg/mL 組 -0.35±0.11＊ -0.33±0.10＊6 μg/mL 組 -0.44±0.09＊ -0.60±0.07＊＃

2.4 PPⅦ對HT-29 和LoVo 細(xì)胞中PI3K/Akt 信號通路的影響

用梯度濃度的PPⅦ（0 μg/mL、3 μg/mL、6 μg/mL）處理HT29 和LoVo 細(xì)胞48 h，PPⅦ可以下調(diào)PI3K、Akt 的磷酸化水平。 見表4、表5、圖2。

圖2 重樓皂苷Ⅶ處理人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 和LoVo 細(xì)胞48 h 后PI3K/Akt 信號通路中的蛋白表達(dá)

表4 重樓皂苷Ⅶ對HT29 細(xì)胞PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（）

表4 重樓皂苷Ⅶ對HT29 細(xì)胞PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（）

注：GAPDH 為甘油醛3 磷酸脫氫酶，Akt 為蛋白激酶B，p-Akt 為磷酸化蛋白激酶B，PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05，與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 組 0.97±0.10 1.02±0.14 1.05±0.07 1.04±0.13 1.20±0.13 1.16±0.05 3 μg/mL 組 0.92±0.04 0.70±0.09＊ 0.76±0.06＊ 0.99±0.12 0.80±0.08＊ 0.81±0.02＊6 μg/mL 組 1.03±0.13 0.34±0.06＊＃ 0.34±0.08＊＃ 1.06±0.15 0.51±0.13＊ 0.49±0.14＊＃

表5 重樓皂苷Ⅶ對LoVo 細(xì)胞PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（）

表5 重樓皂苷Ⅶ對LoVo 細(xì)胞PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（）

注：GAPDH 為甘油醛3 磷酸脫氫酶，Akt 為蛋白激酶B，p-Akt 為磷酸化蛋白激酶B，PI3K 為磷脂酰肌醇3 激酶，p-PI3K 為磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶。與0 μg/mL 組比較，＊P＜0.05；與3 μg/mL 組比較，＃P＜0.05。

組別 Akt/GAPDH p-Akt/GAPDH p-Akt/Akt PI3K/GAPDH p-PI3K/GAPDH p-PI3K/PI3K 0 μg/mL 組 1.04±0.02 0.99±0.02 0.96±0.02 0.98±0.00 1.06±0.03 1.08±0.03 3 μg/mL 組 1.01±0.04 0.99±0.02 0.98±0.01 0.76±0.04＊ 0.83±0.03＊ 1.08±0.02 6 μg/mL 組 1.06±0.04 0.25±0.01＊＃ 0.23±0.00＊＃ 1.01±0.04＃ 0.61±0.02＊＃ 0.61±0.01＊＃

3 討論

CRC 是胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著病情的進(jìn)展患者逐漸出現(xiàn)便血、排便習(xí)慣改變、腹瀉、腹瀉與便秘交替、腹痛等表現(xiàn)，進(jìn)展到晚期則會出現(xiàn)貧血、體質(zhì)量減輕等全身癥狀。 根據(jù)臨床表現(xiàn)，可將CRC 歸屬于中醫(yī)學(xué)積聚、腸澼、腸覃等病證范疇［7］。 CRC 的發(fā)生與先天稟賦不足、后天失養(yǎng)有關(guān)，慢性腸道疾病可損傷陽氣，耗傷氣陰，使陰陽失調(diào)，主要病機(jī)為濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀、正氣虧虛等［8］。 但是近年來隨著癌毒理論的提出，對腸息肉病因的認(rèn)識不斷深入，魏小曼等［9］認(rèn)為，脾氣虧虛是大腸癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在基礎(chǔ)，濕熱瘀毒是大腸癌發(fā)生發(fā)展的重要條件，故治療中抗癌解毒是關(guān)鍵點(diǎn)。

研究表明，中藥及其提取物對腫瘤具有抑制作用，具體體現(xiàn)在抗增殖、促凋亡、抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成、調(diào)節(jié)自噬、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面［10］。 重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，藥理作用研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、止血、鎮(zhèn)痛、抑制精子活性、治療淋巴結(jié)結(jié)核潰瘍等作用［11］，重樓軟堅(jiān)湯輔助放化療可以提高肺癌患者近遠(yuǎn)期療效，2 年生存率顯著提高［12］。 近年來，國內(nèi)外研究證明，在治療惡性腫瘤方面，PP 及其提取物可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞侵襲和遷移［13］。張?zhí)氐龋?4］研究發(fā)現(xiàn)，PPⅠ可以通過直接靶向抑制表皮生長因子受體，以阻斷其下游信號通路起到治療乳腺癌的作用。 張亮等［15］研究發(fā)現(xiàn)，PPA 與轉(zhuǎn)錄因子家族-1 相互結(jié)合可以阻斷蛋白磷酸酶2A 癌性抑制因子/蛋白激酶B 信號通路，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。 何昊等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PPⅦ能夠抑制人胰腺癌PANC-1 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且下調(diào)程序性死亡分子配體-1 蛋白表達(dá)，參與免疫調(diào)節(jié)，從而抑制胰腺癌的發(fā)展。

CRC 最主要的惡性生物學(xué)特征為淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，而去分化、失去黏附約束以及運(yùn)動(dòng)性和侵襲性增強(qiáng)，都是腫瘤增加惡性質(zhì)的標(biāo)志［17］。 研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR 通路與CRC 的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、耐藥和干細(xì)胞相關(guān)，該通路是藥物治療的首選靶點(diǎn)［18］。PI3K/Akt 信號通路激活是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的經(jīng)典信號通路之一，該通路與卵巢癌、膀胱癌及CRC 的發(fā)展密切相關(guān)［19-21］。He 等［22］研究報(bào)道，PPⅦ通過下調(diào)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 的表達(dá)阻斷PI3K/Akt通路激活，進(jìn)而抑制人肺癌A549 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 因此，通過抑制PI3K/Akt 信號通路的水平治療癌癥可能會成為未來治療CRC 的發(fā)展方向。在本實(shí)驗(yàn)中，采用MTT 比色法驗(yàn)證了PPⅦ對CRC細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明CRC 細(xì)胞HT29 和LoVo 經(jīng)PPⅦ干預(yù)48 h 后，藥物濃度越高，腫瘤細(xì)胞的活力越差，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸降低，說明PPⅦ可隨著劑量增大有效抑制CRC 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

PI3K/Akt 信號通路由磷酸化磷脂酰肌醇3-羥基的脂類激酶活性PI3K 及下游Akt 組成，PI3K 是由p110 和p85 亞基組成的異源二聚體，可被各種生長因子受體和癌基因啟動(dòng)，通過磷酸化Akt 的Ser473和Thr308 位點(diǎn)從而將其激活［23］。 因此，抑制PI3K/AKT 信號通路是多種藥物對抗CRC 作用的機(jī)制。研究證實(shí)，從紫草中分離的脫氧紫草素可以通過下調(diào)PI3K/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路抑制CRC 的發(fā)展，蓮房原花青素可能是通過抑制Ras相關(guān)C3 肉毒菌毒物底物1（RAC1）/PI3K/AkT 信號通路實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用，紫花前胡素可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路的激活影響CRC 細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移［24-25］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)PPⅦ下調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 和LoVo 中PI3K 和Akt 蛋白磷酸化表達(dá)水平，結(jié)果提示PPⅦ可能通過降低PI3K 和Akt 磷酸化水平抑制PI3K/Akt通路的激活，從而抑制HT29 和LoVo 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PPⅦ對CRC 細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，且隨著藥物濃度的提高抑制作用越發(fā)顯著，其機(jī)制可能與通過下調(diào)PI3K、Akt 的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt 信號通路有關(guān)。 該研究為PPⅦ治療CRC 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路，并且為天然植物成分進(jìn)行CRC 的治療提供了一定的理論依據(jù)，下一步將對PPⅦ治療CRC 的分子機(jī)制進(jìn)行更加深入研究。