基于GC-MS分析刺五加和短梗五加不同器官的代謝差異特性

任艷君 孫 宇 郭曉瑞* 徐明遠(yuǎn) 邵文達(dá) 吳可心

（1.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150025；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；4.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

五加屬（Acanthopanax）植物在全球大約有37種，我國擁有26 個(gè)種18 個(gè)變種。東北地區(qū)比較常見的有刺五加（Acanthopanax senticosus）、短梗五加（A.sessiliflorus）。刺五加作為藥用植物，在史料文獻(xiàn)中有大量記載，其根部、莖部及葉均可入藥［1］，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就將刺五加列為無毒、久服可以輕身、延年益壽無害的上品［2］。短梗五加雖未被列為我國藥典中藥材，但其在2008 年被原國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，刺五加和短梗五加均具有抗腫瘤的藥理作用，對癌細(xì)胞侵襲能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移干預(yù)的作用［3］。但是，二者在藥效上也存在差異，刺五加較多應(yīng)用在免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞上［4-5］，而短梗五加則主要應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化［6-8］。兩種藥用植物作為重要的林下經(jīng)濟(jì)植物資源，開發(fā)利用潛力巨大，但刺五加和短梗五加因在形態(tài)特征上無明顯差異而經(jīng)常被混用。目前，在東北三省刺五加產(chǎn)地及藥材集散地市場上經(jīng)常將短梗五加與刺五加混淆，很多短梗五加產(chǎn)品被當(dāng)作刺五加進(jìn)行功效宣傳和銷售［9］。因此，短梗五加能否替代刺五加作為藥材使用是制約兩種植物藥用研究發(fā)展的一個(gè)重要問題。此外，不同的器官藥用成分種類和含量存在差異［10-11］，選取短梗五加的哪一器官替代刺五加是另一重要問題。

為解決上述問題，國內(nèi)學(xué)者就刺五加和短梗五加的差異做了大量的研究，研究方向主要集中在對2個(gè)物種次生代謝產(chǎn)物及藥理活性的比較上，如王宇［12］利用LC-MS 技術(shù)對二者次生代謝物組分的研究顯示，10 種藥用代謝物在短梗五加與刺五加中的分布具有顯著差異。劉樅等［13-14］對比2 物種根皮和莖皮中有效成分含量發(fā)現(xiàn)，短梗五加根皮樣品中刺五加苷B 和刺五加苷E 的含量顯著低于刺五加根皮，莖皮中異嗪皮啶及刺五加苷E 的含量顯著高于刺五加莖皮。王晶瑤［15］對2 種藥用植物葉及果鎮(zhèn)靜催眠活性的研究表明，短梗五加葉和果提取物的鎮(zhèn)靜催眠作用不如刺五加。芮施等［16］對刺五加和短梗五加根皮乙醇提取物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用的研究顯示，在鎮(zhèn)靜催眠方面，短梗五加根皮可作為刺五加根皮的替代品。

然而目前關(guān)于刺五加和短梗五加初生代謝方面的報(bào)道還較少。植物次生代謝產(chǎn)物以初生代謝產(chǎn)物為前體，利用初生代謝產(chǎn)生的能量，通過不同的代謝途徑生成［17］。劉紫祺等［18］通過適當(dāng)?shù)奶岣邔ξ餮髤ⅲ≒anax quiquefolium）的光照強(qiáng)度，增強(qiáng)了初生代謝強(qiáng)度，有利于植物積累生物量，進(jìn)而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。Chen 等［19］發(fā)現(xiàn)長春花（Catharanthus roseus）和小蔓長春花（Vinca minor）初生代謝物的不同可能是二者生物堿類次生代謝產(chǎn)物的累計(jì)存在差異的原因之一?；贕C-MS的植物代謝組學(xué)技術(shù)是研究種間、種內(nèi)差異性的有效手段之一，Yao 等［20］利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了2 種不同栽培區(qū)域枸杞（Lycium chinense）果實(shí)的代謝差異性；Okba 等［21］利用該技術(shù)分析了3 種鳶尾屬（Iris）植物的初生代謝譜，發(fā)現(xiàn)3種植物地下部分有著顯著的代謝差異。

因此，本研究利用GC-MS 代謝組學(xué)分析技術(shù)構(gòu)建刺五加和短梗五加初生代謝譜，對其初生代謝物進(jìn)行分析。通過多元統(tǒng)計(jì)分析的方法分析刺五加和短梗五加不同器官初生代謝差異特性，為進(jìn)一步揭示2物種的藥效差異機(jī)制提供研究基礎(chǔ)，為明確兩者藥用價(jià)值及資源利用結(jié)構(gòu)提供思路。綜上，對刺五加和短梗五加不同器官代謝差異的研究對揭示兩物種藥理效應(yīng)和次生代謝差異的相關(guān)機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料均來自于森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)）溫室外苗圃，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)穆立薔教授鑒定確定為5年生刺五加、短梗五加。植物樣品于2020 年10 月上旬一次性采集，包括刺五加和短梗五加的根、莖、葉、葉柄4 個(gè)部位，每個(gè)部位隨機(jī)采集3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共24個(gè)樣本。采回后將其洗凈簡單處理后放置于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

甲醇（色譜級，北京百靈威科技有限公司）、L2-氯-苯丙氨酸（阿拉?。?、甲氧胺鹽酸鹽（上海笛柏生物科技有限公司）、BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑（阿拉?。?、正已烷（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、氯仿（濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司）、吡啶（阿拉?。?。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C，美國），電子天平（BSA224S-CW，德國），數(shù)控超聲波清洗機(jī)（KQ500-DB，昆山），高速離心機(jī)（TGL-16，湖南），氣浴恒溫振蕩器（SHZ-82A，常州），電熱恒溫水浴鍋（DK98-ⅡA，天津），高通量組織研磨機(jī)（Xinyi-24，寧波），真空離心濃縮儀（ZLS-2，湖南）。

1.3 樣品的制備

稱取刺五加和短梗五加根、莖、葉、葉柄樣品各0.09 g，分別放入2 mL 的離心管中。依次加入2顆小鋼珠，540 μL的冷甲醇和60 μL的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 g·L-1，甲醇配置）。在冰箱中-80 ℃放置2 min，放入研磨機(jī)中研磨（60 Hz）2 min后取出繼續(xù)超聲提取30 min。取出1顆小鋼珠，加入300 μL 的氯仿，研磨機(jī)中渦旋（20 Hz）2 min，加入600 μL 的水，研磨機(jī)中渦旋（20 Hz）2 min，超聲提取30 min。低溫離心（14 000 r·min-1，4 ℃）10 min，取700 μL 的上清液，裝入玻璃衍生瓶中，快速離心濃縮儀揮干。向玻璃衍生小瓶中加入400 μL 的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 g·L-1），渦旋震蕩2 min 后，于震蕩培養(yǎng)箱中37 ℃肟化反應(yīng)90 min。取出后再加入400 μL 的BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑和60 μL 的正己烷，渦旋震蕩2 min 后，于70 ℃反應(yīng)60 min，取出樣品，室溫放置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理和多元統(tǒng)計(jì)分析

使用Agilent GC-MS 5975 軟件處理數(shù)據(jù)，并采用XCMS 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的特征峰提取和預(yù)處理。將預(yù)處理完畢的數(shù)據(jù)矩陣歸一化后導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件進(jìn)行PCA 分析和PLS-DA 等多元統(tǒng)計(jì)分析，得到各變量對分組貢獻(xiàn)得分（VIP 值）大于1的代謝物。利用IBM SPSS Statistics 22.0 做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，得到組間變化顯著的（P＜0.05）代謝物。利用MetaboAnalyst 網(wǎng)站計(jì)算差異倍數(shù)，得到|log2FoldChange|＞2 的代謝物。將VIP＞1，P＜0.05且|log2FoldChange|＞2的代謝物作為差異代謝物，并將差異代謝物輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝途徑的篩選。使用GraphPad Prism 8.0.2對差異代謝物含量進(jìn)行對比，做出柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA分析

首先利用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）方法來判斷刺五加和短梗五加是否具有初生代謝差異。在PCA分析的二維得分圖（見圖1）中，刺五加和短梗五加并沒有被明顯的區(qū)分開，這是由于PCA 為無監(jiān)督的分析方法，樣本中存在不同物種的差異同時(shí)也存在不同器官的差異，導(dǎo)致影響因素過多而不能明顯區(qū)分。但通過PCA 分析的三維得分圖（見圖2）可知，刺五加各樣本處于下方，短梗五加的各樣本處于上方，可以明顯區(qū)分。

圖2 刺五加和短梗五加初生代謝PCA三維得分圖Fig.2 Three-dimensional score chart of primary metabolism PCA of A.senticosus and A.sessiliflorus

2.2 PLS-DA分析

PCA 分析結(jié)果顯示刺五加和短梗五加同一部位在初生代謝上有明顯的差異，為了更加準(zhǔn)確地顯示2種五加屬植物間的代謝差異、篩選出差異代謝物，使用最小二乘法（PLS-DA）模型進(jìn)行進(jìn)一步分析。從PLS-DA 得分圖（見圖3）可以看出，刺五加與短梗五加同一部位存在差異。如表1 所示，R2X均大于0.7，Q2均大于0.9，說明模型穩(wěn)定。且PLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)（見圖4）顯示，Q2和R2的斜率均為正值，證明模型無過擬合的現(xiàn)象。

圖4 刺五加和短梗五加不同器官初生代謝PLS-DA置換檢驗(yàn)A.根；B.莖；C.葉；D.葉柄Fig.4 PLS-DA substitution test for primary metabolism in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusA.Roots；B.Stems；C.Leaves；D.Petioles

2.3 兩種植物樣品間的差異代謝物確定

基于PLS-DA 分析的結(jié)果得到VIP 值大于1的代謝物，經(jīng)過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)篩選P＜0.05 的代謝物，計(jì)算差異倍數(shù)，得到|log2FoldChange|＞2 的代謝物，最終得到根差異代謝物52個(gè)，莖差異代謝物34個(gè)，葉差異代謝物39個(gè)，葉柄差異代謝物48個(gè)。

2.4 差異代謝物通路分析

通過MetaboAnalyst 做差異代謝物代謝途徑分析，結(jié)果如圖5所示。根中差異代謝物主要富集在氨?；?tRNA 合成途徑、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑、乙醛酸和二羧酸代謝途徑等；莖中差異代謝物主要富集在半乳糖代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑；葉中差異代謝物主要富集在乙醛酸和二羧酸代謝途徑、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑；葉柄中差異代謝物主要富集在半乳糖代謝途徑、精氨酸合成代謝途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑。

圖5 刺五加和短梗五加不同器官初生代謝差異代謝物富集通路氣泡圖A.根；B.莖；C.葉；D.葉柄Fig.5 Bubble diagram of primary metabolism differential metabolite enrichment pathway in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusA.Roots；B.Stems；C.Leaves；D.Petioles

2.5 連接初生代謝與次生代謝的重要中間體相對含量

本研究中發(fā)現(xiàn)4 種初生代謝物，分別是莽草酸、苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸，其在生成次生代謝物的途徑中有著關(guān)鍵性作用，且在2物種中的相對含量存在差異。

圖6 為莽草酸、苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸在刺五加和短梗五加不同器官的峰面積。莽草酸在刺五加中的含量是短梗五加中的3.18 倍，主要分布在根、莖中，在刺五加中的含量遠(yuǎn)高于短梗五加，刺五加根中的含量是短梗五加根中的2.78 倍，刺五加莖中的含量是短梗五加莖中的4.97 倍，其他部位含量差距較小。苯丙氨酸在刺五加中的含量是短梗五加中的0.61 倍，在短梗五加根中含量最高，是刺五加根中含量的6.75 倍，刺五加莖中含量是短梗五加莖的2.81 倍，刺五加葉中含量是短梗五加葉的4.08 倍，短梗五加葉柄中的含量是刺五加中的1.22 倍。苯甲酸在刺五加中的含量是短梗五加的0.39 倍，在短梗五加根和葉柄中遠(yuǎn)高于刺五加，短梗五加根中含量是刺五加根的4.87 倍，短梗五加葉柄中含量是刺五加葉柄中的11.21 倍?？Х人嵩诖涛寮又械暮渴嵌坦Ｎ寮又械?.73倍，在短梗五加葉中含量最高，是刺五加葉中含量的4.24 倍，刺五加根中含量是短梗五加中的3.45倍，刺五加莖中含量是短梗五加中的4.04 倍，刺五加葉柄中的含量是短梗五加中的1.47倍。

圖6 莽草酸（A）、苯丙氨酸（B）、苯甲酸（C）和咖啡酸（D）4種關(guān)鍵化合物在刺五加和短梗五加不同器官峰面積a.刺五加根；b.短梗五加根；c.刺五加莖；d.短梗五加莖；e.刺五加葉；f.短梗五加葉；g.刺五加葉柄；h.短梗五加葉柄Fig.6 Peak areas of four key compounds including shikimic acid（A），phenylalanine（B），benzoic acid（C）and caffeic acid（D）in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusa.A.senticosus roots；b.A.sessiliflorus roots；c.A.senticosus roots；d.A.sessiliflorus stems；e.A.senticosus leaves；f.A.sessiliflorus leaves；g.A.senticosus petioles；h.A.sessiliflorus petioles

3 討論

植物代謝對于植物的生長發(fā)育尤為重要，這是因?yàn)橹参锎x過程中產(chǎn)生的代謝物在植物生長、細(xì)胞補(bǔ)充，以及植物應(yīng)對環(huán)境改變帶來的脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。植物的代謝產(chǎn)物是植物生長、源—庫平衡及適應(yīng)環(huán)境變化的關(guān)鍵因素，更是植物生理、生長狀態(tài)在代謝水平的反映［22］。本研究中，PCA 和PLS-DA 分析結(jié)果顯示刺五加與短梗五加在初生代謝水平存在差異。相同器官分別對比分析，結(jié)果顯示根中差異代謝物52個(gè)，莖中差異代謝物34個(gè)，葉中差異代謝物39個(gè)，葉柄差異代謝物48 個(gè)。利用差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果顯示根和葉涉及的差異代謝通路較莖和葉柄更多。2種植物根和葉中涉及的差異代謝通路大多與氨基酸代謝和糖類能量代謝有關(guān)，還涉及氨?；?tRNA生物合成途徑，莖和葉柄中差異代謝通路主要是糖類能量代謝。因此，差異代謝物的數(shù)量和差異代謝通路的種類表明，2種植物根的差異更大。

氨基酸是人體生存必需的一種營養(yǎng)物質(zhì)，不僅有提高人體免疫力的作用，還有加強(qiáng)腸胃吸收的功效。本研究中，天冬氨酸、甘氨酸、L-蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸等在刺五加中含量均低于短梗五加，推測短梗五加的食用價(jià)值更高一些，這與蔡恩博等［23］對刺五加和短梗五加葉片成分分析結(jié)論一致。五加科植物均以皂苷類化合物為主要活性物質(zhì)，如人參（Panax ginseng）、三七（P.notoginseng）等［24］，刺五加總苷具有明顯的抗疲勞及抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［25］，以往的研究結(jié)果表明刺五加中的皂苷物質(zhì)含量高于短梗五加，刺五加的藥用價(jià)值更高。但多糖類、黃酮類、酚酸類也是具有一定活性的代謝產(chǎn)物［26］。本研究中，檢測到的大多數(shù)的糖類物質(zhì)的含量在刺五加中低于短梗五加，鄭冉等［27］對短梗五加多糖提取分離并進(jìn)行了體外活性研究，結(jié)果表明短梗五加多糖能夠減輕心肌細(xì)胞損傷并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體途徑的凋亡，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)活性。肖鳳艷等［28］研究表明短梗五加果實(shí)中含有酚類物質(zhì)并有抗疲勞作用。酚類化合物主要由苯丙基類生物途徑合成，苯丙氨酸是其途徑的重要前體，莽草酸是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵代謝物，苯丙氨酸可由莽草酸生成，再生成其他酚類物質(zhì)。本研究中，莽草酸在刺五加中的含量遠(yuǎn)高于短梗五加，而短梗五加中苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸的含量高于刺五加?；谝陨戏治?，推測刺五加藥用價(jià)值大于短梗五加，但刺五加和短梗五加不同器官的活性成分類別和含量存在差異，如在多糖類、酚酸類作為藥用主要活性成分時(shí)，短梗五加有替代刺五加的潛力。

4 結(jié)論

本研究基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對刺五加和短梗五加的根、莖、葉、葉柄樣品進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，分析了2 物種不同器官初生代謝的差異特性。篩選出根中差異代謝物52 個(gè)，莖中差異代謝物34個(gè)，葉中差異代謝物39個(gè)，葉柄中差異代謝物48個(gè)，說明相同器官在兩不同種間是有差異的。

本研究的結(jié)果顯示，利用代謝組學(xué)的研究方法并結(jié)合GC-MS技術(shù)來分析刺五加和短梗五加不同器官在初生代謝物水平上的差異性是可行的，能夠?yàn)檠芯績烧咚幮Р町?、藥用價(jià)值及資源利用結(jié)構(gòu)提供技術(shù)方法和基礎(chǔ)思路，刺五加和短梗五加在初生代謝方面顯著不同，這可能是造成2物種藥理效應(yīng)和次生代謝存在差異的原因之一。