擬南芥線粒體蛋白突變體ssr1-2表型的詳細(xì)鑒定與分析

蔡圓圓 夏季奔奔 應(yīng)文涵 王潔瑤 謝 濤邢孔丫 馮宣軍 華學(xué)軍

（1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310018；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，西南作物基因挖掘與利用國家重點實驗室，溫江 611130）

脯氨酸積累是許多高等植物在各種環(huán)境脅迫下體內(nèi)產(chǎn)生的一種代謝適應(yīng)機制［1-2］，被認(rèn)為對脅迫中的植物起保護作用。但在正常生長條件下，無論是轉(zhuǎn)基因?qū)е碌捏w內(nèi)積累還是體外施加的脯氨酸卻對植物生長有抑制作用。過量表達P5CS1的脯氨酸積累的擬南芥（Arabidopsis thaliana）植株的正常生長發(fā)育受到了較為嚴(yán)重的抑制，主要表現(xiàn)為花莖的伸長受到的明顯的抑制，節(jié)間變短，植株明顯矮化，但植株開花提前，花期延長，而且抽薹增多，側(cè)生花莖與主花莖長度相仿，成叢生花狀［3］。這種表型在過表達P5CS1的其他植物中也不同程度地被觀察到。此外，體外施加10 mg脯氨酸就會對擬南芥幼苗的子葉伸展、真葉生長和根的伸長產(chǎn)生抑制作用［4-5］。這種抑制作用可能與脯氨酸本身或其降解產(chǎn)物P5C 有關(guān)，同時伴隨著活性氧水平的上升，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6］。

近年來，通過鑒定和分析脯氨酸超敏感和抗性突變體，對脯氨酸毒性的機理有了一些認(rèn)識。首先，擬南芥中氨基酸通透酶1（AtAAP1）功能缺失能夠?qū)е赂彼峥剐裕?-8］。因為AtAAP1位于細(xì)胞膜，是脯氨酸進入細(xì)胞的重要通道之一，說明脯氨酸對植物生長的抑制作用需要其進入細(xì)胞。其次，脯氨酸毒性也與細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量正相關(guān)，通過反義RNA敲減或者敲除突變體降低脯氨酸脫氫酶基因（PDH）表達，都會導(dǎo)致植株對脯氨酸超敏感，因為植株體內(nèi)脯氨酸含量增加［4-5］。也有報道認(rèn)為，脯氨酸降解的中間產(chǎn)物P5C 可能是脯氨酸毒性的主要原因，因為P5C 脫氫酶基因的突變體p5cdh具有脯氨酸超敏感的表型，在這一突變體中外源脯氨酸處理時體內(nèi)脯氨酸含量沒有顯著變化，而P5C 水平顯著提高。另一方面，過量表達P5CDH能夠降低植株的脯氨酸敏感性［6］。P5C 的毒性也被認(rèn)為是另一個突變體rsr1-1對脯氨酸超敏感的原因［9］。

脯氨酸積累對正常生長的植株的抑制作用，也限制了其在改良植物抗逆性中的應(yīng)用［10］。由于脯氨酸合成被認(rèn)為發(fā)生在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，而脯氨酸降解在線粒體中，因此不論是脯氨酸還是P5C 都有能力在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中穿梭。因此它們有可能對不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能都有一定的抑制作用，但目前對于這種抑制作用的確切機制還不清楚。一種普遍的看法是，外源施加較高濃度的脯氨酸會使得植物細(xì)胞內(nèi)的氨基酸水平失衡，導(dǎo)致生長抑制，但這非脯氨酸特異，其他氨基酸的累積也會產(chǎn)生這類毒害［11-12］。這些毒害作用很可能發(fā)生在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。而脯氨酸在線粒體中所起的抑制作用尚不清楚。

在本實驗室前期研究中，在擬南芥中鑒定了1個編碼1 個具有TPR 結(jié)構(gòu)域的線粒體蛋白基因SSR1。SSR1部分缺失（氮端缺失12 個氨基酸）的突變體ssr1-1對滲透脅迫［13］和外源脯氨酸［14］超敏感。試驗結(jié)果表明脯氨酸處理后，ssr1-1突變體具有比Col 野生型更高的線粒體活性氧（ROS）水平，更低的ATP 水平和更低的線粒體電子傳遞鏈（mETC）復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ酶活性［14］。這些結(jié)果說明，SSR1可能參與維持mETC 正常功能，也暗示正常的mETC能夠緩解脯氨酸的毒性。

為了更加準(zhǔn)確地了解SSR1的功能，及其與脯氨酸毒性的關(guān)系，本研究以SSR1敲除突變體ssr1-2（T-DNA插入在SSR1翻譯的起始密碼子ATG上游-14堿基對處［13］），及其表型抑制子突變體EMS143和EMS145為材料，對其根和地上部分的生長，及其對脯氨酸的敏感性和鐵穩(wěn)態(tài)進行跟蹤分析，并利用擬南芥幼苗嫁接技術(shù)分析ssr1-2短根表型對地上部分生長的影響，以期為揭示脯氨酸毒性與線粒體功能之間的關(guān)系提供一些佐證。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

擬南芥野生型為Wassilewskija（WS）生態(tài)型，突變體ssr1-2（FLAG_356A08，購于Versailles Arabidopsis Stock Center）是WS 背景?；パa株系ssr1-2C是ssr1-2轉(zhuǎn)入了WS 野生型的SSR1基因組片段（包含啟動子與終止子）［13］、ssr1-2的2個抑制子突變體EMS143和EMS145是從甲磺酸乙酯（EMS）誘變ssr1-2所得的突變體庫中篩選到的根長恢復(fù)的突變體，背景均為WS。這些株系均為浙江理工大學(xué)華學(xué)軍實驗室保有。

1.2 植物材料的種植

擬南芥株系種子的表面消毒和萌發(fā)步驟如下：70%乙醇浸泡1 min 后用有效成分0.5%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水洗滌3～5 次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%瓊脂重懸種子，冰箱4 ℃低溫處理72 h。將處理好的種子點于Murashige-Skoog（MS）固體培養(yǎng)基（1%蔗糖+2.5 mmol·L-1嗎啉乙磺酸+1%～2%瓊脂，pH5.8～6.0）上。將培養(yǎng)皿水平（萌發(fā)試驗）或豎直（根伸長試驗）放置在光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件是溫度22 ℃、光照強度設(shè)置為120 μmol·m-2·s-1、光周期為16 h/8 h（光/暗）。

1.3 突變體表型鑒定

觀察并記錄5 個株系幼苗從萌發(fā)開始1 周內(nèi)、2 周和3 周時的根長與葉片面積變化，并對已生長2 周的野生型和突變體進行根系發(fā)育分析。將培養(yǎng)2周的苗移入土中生長直至第45天時，對5個株系的株高和果莢大小進行拍照測量。用Image J進行分析處理，數(shù)據(jù)重復(fù)測量3次。

1.4 微嫁接試驗

微嫁接實驗主要參考Tsutsui 等［15］的方法，并進行了必要的改進。在經(jīng)消毒處理好的種子點于Micrografting chip（購于Bio Medical Science Inc.）并置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂的MS 培養(yǎng)基上，22 ℃暗培養(yǎng)48 h 后轉(zhuǎn)入連續(xù)光培養(yǎng)48 h。第5 天時對幼苗進行切割嫁接，并轉(zhuǎn)入25 ℃連續(xù)光培養(yǎng)。嫁接處理6 d 后得到嫁接苗，將其移入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂的MS 培養(yǎng)基在22 ℃，16 h/8 h（光/暗）周期下培養(yǎng)1 周后移入土中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 周后檢測嫁接苗根長和冠幅。嫁接實驗共有4種組合，地上/地下分別為：WS/ssr1-2，WS/WS，ssr1-2/ssr1-2和ssr1-2/WS，其中WS/WS，ssr1-2/ssr1-2為對照。

1.5 脯氨酸脅迫處理

在含有15 mmol·L-1脯氨酸的MS 培養(yǎng)基上分別點種經(jīng)表面消毒處理的上述5個株系的種子，統(tǒng)計1 周內(nèi)種子萌發(fā)率。用含20 mmol·L-1脯氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周的5 個株系擬南芥幼苗，測量各個株系根長、葉片面積并檢測葉綠素含量，并與在MS培養(yǎng)下的幼苗進行對比。

1.6 不同鐵濃度下的生長檢測

不同濃度鐵鹽處理的試驗參考Giehl 等［16］的方法。將經(jīng)表面消毒的5 個株系的種子點板于不含鐵鹽的1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d 后轉(zhuǎn)入含0、0.05、0.100、0.200、0.500 mmol·L-1FeSO4-EDTA 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d 后，對幼苗進行主側(cè)根長、側(cè)根數(shù)量、葉片面積測量記錄，并分析計算主根凈生長量和側(cè)根密度。同時，收集幼苗檢測葉綠素含量。

1.7 葉綠素含量的測量

將待測擬南芥材料稱量質(zhì)量后浸泡于80%丙酮。4 ℃條件下靜止48～72 h，直至葉片組織完全無色。紫外分光光度計（UV-2600，上海尤尼柯儀器有限公司）測定提取液在663 nm 和645 nm 波長下的吸光度。根據(jù)Han 等［14］方法計算葉綠素a、葉綠素b的總含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ssr1-2表型鑒定

為進一步明確SSR1基因在擬南芥生長中的作用，跟蹤ssr1-2根表型的形成，對不同生長階段 的 野 生 型WS 生 態(tài) 型、ssr1-2、ssr1-2回 補 株 系ssr1-2C、EMS143和EMS145的 表 型 進 行 了 跟 蹤觀察。

如圖1A 所示，在萌發(fā)后第3 天，ssr1-2突變體根長已經(jīng)明顯短于野生型，而回補株系ssr1-2C根長能恢復(fù)至野生型。培養(yǎng)至第7 天時這種差別更加顯著，同時也可以看到2 個抑制子突變體EMS143和EMS145根長略短于野生型，基本恢復(fù)到了野生型水平。各個株系的地上部分的差別并不顯著。

據(jù)每天跟蹤測量結(jié)果表明，根長間的差異從萌發(fā)后第3天就逐漸顯示出來，并隨著生長時間的延長，差異不斷擴大（圖2A）。但地上部葉片面積的變異較為緩慢，在前7 d，野生型與ssr1-2無顯著差異（圖2B）。培養(yǎng)到第7 天，ssr1-2的葉片面積才略小于野生型，為野生型的93%左右。3 周后，這種差異變得更為明顯，但還是遠(yuǎn)小于兩者在根長間的差異。與根長不同，2個抑制子突變體的葉片面積均大于野生型。

為了更好地研究野生型和突變體在根系發(fā)育方面的差異，將兩者播種于含2%瓊脂的MS 培養(yǎng)基上，并豎直培養(yǎng)2周。觀察發(fā)現(xiàn)，ssr1-2突變體根系的結(jié)構(gòu)與野生型存在顯著不同，突變體根基部長出許多類似于須根的側(cè)根，側(cè)根長度與主根長相近，不易區(qū)分主側(cè)根。而在同樣的生長條件下，野生型主根直長且側(cè)根少。統(tǒng)計結(jié)果表明，突變體側(cè)根密度顯著大于野生型，平均值為野生型的10 倍，且ssr1-2側(cè)根長/主根長之比平均值為39.93%，而野生型僅為1.83%，兩者存在極其顯著差異（圖1B，圖2C，D）。

圖1 各株系的生長表型A.WS、ssr1-2、ssr1-2C、EMS143 和EMS145 的5 個株系在MS 培養(yǎng)基上生長3、7 d 的表型；B.WS 與ssr1-2 豎直培養(yǎng)2 周的生長表型；C.各個株系培養(yǎng)45 d后的果莢Fig.1 Phenotype of different linesA.The phenotype of WS，ssr1-2，ssr1-2C，EMS143 and EMS145 grown on MS medium for 3 and 7 d；B.The growth phenotype of WS and ssr1-2 vertically cultured for 2 weeks；C.The siliques of each line grown for 45 d

將幼苗移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)45 d 后，ssr1-2株高明顯矮于野生型，為野生型的60%左右，EMS143完全恢復(fù)至野生型株高，而EMS145略矮于野生型（圖2E）。收集45 d時的果莢并測量長、寬發(fā)現(xiàn)，突變體ssr1-2的果莢長度短于野生型，而寬度卻大于野生型（圖1C，圖2F，G）。EMS143果莢形狀與長寬均與野生型相近，而EMS145果莢長雖略短于野生型，但其寬與突變體相似。

圖2 各株系的生長表型對各個株系培養(yǎng)1～7 d、14 d 和21 d 進行根長（A）、葉片面積（B）統(tǒng)計；對2 周苗齡的WS 和ssr1-2 的側(cè)根進行側(cè)根密度（C）、側(cè)根長/主根長比計算（D）；對各個株系培養(yǎng)45 d 后進行株高（E）、果莢長度（F）、果莢寬度（G）統(tǒng)計分析；圖中所示為來自至少12株幼苗的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差（n≥12）；不同小寫字母代表不同株系間差異顯著（P＜0.05）Fig.2 Phenotypic analysis of different linesThe statistical analysis of the primary root length（A）and leaf area（B）of each line grown for 1-7 d，14 d and 21 d；The lateral root density（C）and lateral root length/main root length ratio（D）of 2-week-old seedlings of WS and ssr1-2；The heigh（tE），silique length（F），and silique width（G）of each line grown for 45 d；All data were means±SD from at least 12 seedlings；Different lowercase letters represented significant differences among line（sP＜0.05）

2.2 ssr1-2微嫁接

從上面的結(jié)果可觀察到ssr1-2突變體的地上部分的生長抑制表型出現(xiàn)得晚于根系，加上之前的結(jié)果表明，SSR1在根中的表達遠(yuǎn)高于其他營養(yǎng)器官［13］，故推測地上部分的生長缺陷可能與根短導(dǎo)致的營養(yǎng)成分吸收受阻有關(guān)，而并非完全歸因于基因敲除。通過對5 d 苗齡的ssr1-2和WS 幼苗進行下胚軸切割并將不同根和地上部分進行嫁接（如圖3A所示）以驗證假設(shè)。

由圖3B～C 所示，培養(yǎng)2 周后，ssr1-2/ssr1-2幼苗的根長和冠幅均顯著小于WS/WS 幼苗，與正常條件下ssr1-2和WS 幼苗的生長差別情況類似，說明嫁接過程本身并沒有改變野生型和突變體幼苗的表型差異。WS/ssr1-2與ssr1-2/ssr1-2幼苗的根都來自ssr1-2，根長無顯著差別，前者的冠幅比后者略大，但遠(yuǎn)小于WS/WS 的冠幅，說明ssr1-2的短根可能限制了WS 野生型地上部分的生長（圖3：B，C）。但是從另一方面來看，將ssr1-2地上部分置換于野生型的長根上并不能使得突變體地上表型得到顯著恢復(fù)（比較ssr1-2/ssr1-2與ssr1-2/WS 的地上部分）。由此推斷，ssr1-2突變體地上部分的生長缺陷出現(xiàn)得比根部慢這一現(xiàn)象可能歸因于2個原因，即根的營養(yǎng)吸收障礙和SSR1基因突變。

與此同時，也可以發(fā)現(xiàn)地上部分對于根的生長有影響。比較ssr1-2/WS 和WS/WS 的根長可以發(fā)現(xiàn)，同樣是WS 的根，當(dāng)?shù)厣喜縼碜詓sr1-2時，根長卻只有地上部來自WS 時的1/3 左右（圖3C）。但是有意思的是，ssr1-2突變體根的生長則幾乎不受地上部分來源的影響，因為ssr1-2/ssr1-2與WS/ssr1-2的根長無明顯差別（圖3C）。

圖3 ssr1-2與WS的微嫁接A.ssr1-2與WS野生型嫁接過程示意圖；對生長2周的ssr1-2與WS各嫁接幼苗，進行表型觀察并測量主根長（B）和冠幅（C）的測量與統(tǒng)計分析；圖中所示為來自至少8株嫁接苗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n≥8）；不同字母代表差異顯著（P＜0.05）Fig.3 The micrografting between ssr1-2 and WSA.The schematic diagram of micrografting process between ssr1-2 and WS wild type；The seedlings grafted with ssr1-2 and WS for 2 weeks were observed and measured the main root length（B）and crown width（C）were measured and statistically analyzed；All data were mean±SD of at least 8 grafted plantlets；Different letters represented significant differences（P＜0.05）

綜上所述，SSR1基因突變對根系和地上部分的功能都有不利影響，根部功能缺陷限制了地上部的生長。而地上部缺陷也在一定程度上影響了根系的生長，但SSR1基因可能在根中的作用更大。

2.3 ssr1-2具有脯氨酸超敏感表型

本實驗室曾經(jīng)報道，SSR1參與維持線粒體功能［14］。SSR1部分缺失突變體ssr1-1具有對脯氨酸超敏感的表型，在含有脯氨酸的培養(yǎng)基上，ssr1-1的根伸長和地上部分生長的受到更加嚴(yán)重的抑制。初步結(jié)果表明，SSR1敲除突變體也具有脯氨酸超敏感性［14］。為了進一步確定ssr1-2的脯氨酸超敏感性，本研究同時引入了ssr1-2的遺傳互補株系（ssr1-2C）和抑制子突變體株系這些遺傳材料。

首先，對各個株系在施加脯氨酸的條件下的相對萌發(fā)率（萌發(fā)率proline/萌發(fā)率MS）進行比較發(fā)現(xiàn)，在15 mmol·L-1脯氨酸處理下第1 天，野生型和回補株系的相對萌發(fā)率分別為74%和79%左右，ssr1-2的萌發(fā)率最低，僅為正常條件下的31%，即萌發(fā)最慢，說明ssr1-2對脯氨酸最敏感。而2 個抑制子突變體均恢復(fù)了對脯氨酸的抗性，尤其是EMS145第1天相對萌發(fā)率為108.50%（表1）。

表1 外源性脯氨酸下各株系種子相對萌發(fā)率Table 1 Effect of exogenous proline on the relative germination rate of different lines

在含20 mmol·L-1脯氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 周后，各個株系生長情況均受到明顯的抑制，表現(xiàn)為根短、葉片萎蔫和黃化（圖4）。其中ssr1-2、EMS143和EMS145根長的相對生長受脯氨酸抑制程度明顯大于野生型和ssr1-2C，其中又以EMS143和EMS145兩者為甚，根長僅為對照的21%（表2）。這一結(jié)果說明，ssr1-2根的伸長對脯氨酸也表現(xiàn)出超敏感，2個抑制子突變體的根長雖然在正常條件下恢復(fù)至野生型水平，但在脯氨酸處理情況下根長并沒有恢復(fù)，反而有所加劇。

圖4 不同濃度脯氨酸下各株系幼苗生長表型WS野生型、ssr1-2、ssr1-2C、EMS143和EMS145株系在含不同濃度脯氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的表型Fig.4 The phenotypes of seedling grown in different exogenous proline conditionThe phenotypes of WS，ssr1-2，ssr1-2C，EMS143 and EMS145 lines which were grown in MS medium containing different concentration of proline for 7 d

從葉片面積來看（表2），20 mmol·L-1脯氨酸處理下，各個株系葉片面積的相對變化差別不大（小于根長的相對變化），但還是可以看出ssr1-2葉片面積的相對生長比較低，在ssr1-2C中又恢復(fù)到了野生型的水平，這也說明ssr1-2對脯氨酸超敏感。有所不同的是，抑制子EMS143葉片生長受脯氨酸影響程度與突變體相近，而在EMS145中，葉片面積的相對生長得到了很好的恢復(fù)，甚至超出了野生型。

表2 外源性脯氨酸對各株系生長的影響Table 2 Effect of exogenous proline on growth of different lines

關(guān)于地上部分的另一個生理指標(biāo)葉綠素含量的檢測結(jié)果表明（表2），在20 mmol·L-1脯氨酸處理下，ssr1-2的相對葉綠素含量明顯低于野生型WS 和回補株系ssr1-2C，再次說明ssr1-2對脯氨酸超敏感。抑制子突變體EMS143和EMS145在正常條件下的葉綠素含量雖略低于野生型，但其葉綠素含量受脯氨酸處理的影響程度卻小于野生型，尤其是EMS145受脯氨酸影響程度遠(yuǎn)小于其他4個株系。這一結(jié)果也說明了ssr1-2葉片失綠的表型在抑制子突變體中得到了恢復(fù)。

綜上所述，ssr1-2對脯氨酸超敏感。而2 個抑制子突變體雖然很大程度上恢復(fù)了ssr1-2在正常生長條件下的根長，但是根伸長對脯氨酸超敏感這一表型卻未得到完全恢復(fù)，暗示SSR1介導(dǎo)根生長和脯氨酸抗性可能是通過不同機制實現(xiàn)的。

2.4 ssr1-2適應(yīng)于缺鐵和過量鐵環(huán)境

通過對ssr1-1的研究，前期結(jié)果表明SSR1能夠影響脅迫下植株內(nèi)鐵代謝相關(guān)基因的表達、鐵含量和線粒體中一些鐵硫蛋白的活性，說明SSR1在細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的維持方面起著一定的作用［14］。

為了獲得更多這方面的證據(jù)，對上述5個株系在不同鐵鹽濃度下培養(yǎng)的生長情況進行觀測。其中在MS 培養(yǎng)基中，鐵鹽的濃度是0.1 mmol·L-1，是大多數(shù)植物的最佳鐵鹽濃度。實驗結(jié)果也顯示大部分根系相關(guān)的指標(biāo)在0.05和0.10 mmol·L-1Fe條件下表現(xiàn)最好（如主、側(cè)根長和主根凈伸長，表3），而葉相關(guān)的指標(biāo)隨不同鐵濃度的變化則不明顯（如葉片面積和葉綠素含量，表3）。在不加Fe 條件下所有株系的大部分生長指標(biāo)，如主側(cè)根長、生長量、葉綠素含量等均受到很大程度的抑制。但隨著鐵濃度的增加，這些指標(biāo)在WS、EMS143、EMS145和ssr1-2C都有不同程度的提高。而有趣的是，ssr1-2中主、側(cè)根長對鐵濃度變化不敏感，始終保持低水平。這一結(jié)果說明SSR1基因能夠介導(dǎo)鐵對根長的促進作用，符合其可能參與鐵硫簇合成的假說。2個抑制子突變體在主、側(cè)根長鐵響應(yīng)方面的恢復(fù)程度有所區(qū)別。就主根長而言，EMS143基本得到恢復(fù)（達到WS 野生型水平），而EMS145則恢復(fù)了約50%。在側(cè)根長方面，兩者均完全恢復(fù)。

表3 外源性鐵鹽對各株系生長的影響Table 3 The effect of iron concentration on growth of different lines

此外，統(tǒng)計上述5 個株系的側(cè)根密度，即單位長度主根上側(cè)根的數(shù)量（表3）發(fā)現(xiàn)，WS 和ssr1-2C中各濃度鐵處理顯著地抑制側(cè)根密度，而ssr1-2中則沒有表現(xiàn)出這種抑制，并且在各個鐵濃度下均顯示出最大的側(cè)根密度。反應(yīng)了其須根特性以及對鐵處理的不敏感。2 個抑制子突變體的側(cè)根密度隨著鐵濃度的增加變化不明顯，均小于ssr1-2。這些結(jié)果說明，SSR1在擬南芥根系正常形態(tài)的維持上起著重要的作用，其突變之后導(dǎo)致側(cè)根密度加大，并對鐵使側(cè)根密度減小的作用不敏感。

與此同時，也對地上部分對鐵的響應(yīng)（葉片面積和葉綠素含量）進行了檢測。如圖5F所示，WS、ssr1-2和ssr1-2C的葉片面積基本不受鐵濃度的影響。在各種鐵濃度下，ssr1-2的葉片面積略小于WS和ssr1-2C，與前面提到的ssr1-2矮小表型一致。EMS143和EMS145葉片面積在不添加Fe時是所有株系中最小的2個，但在加鐵的情況下有所恢復(fù)。

圖5 不同濃度鐵鹽下各株系生表型Fig.5 The phenotypes of seedling growth of iron concentration

各個株系在缺鐵的情況下，葉綠素含量都比較低。在加鐵的條件下，它們?nèi)~綠素含量不出意料地顯著上升，畢竟葉綠素合成需要鐵。也說明SSR1缺失導(dǎo)致鐵響應(yīng)變化不包括葉綠體的合成，可能是因為SSR1 定位于線粒體，更多地影響線粒體相關(guān)的功能。值得一提的是，ssr1-2在缺鐵條件下葉片葉綠素含量顯著高于WS，而EMS143和EMS145則低于WS。

3 討論與結(jié)論

胞內(nèi)積累過量脯氨酸所導(dǎo)致的對植物正常生長的抑制，有時稱為脯氨酸毒性，是脯氨酸積累作為植物抗逆育種手段的主要制約因素［10］。因此，深入了解脯氨酸毒性的靶標(biāo)及其分子機理，有利于更好地利用這一植物脅迫適應(yīng)機制來培育抗逆作物品種。長期以來脯氨酸分解代謝被認(rèn)為與線粒體電子傳遞鏈有關(guān)聯(lián)［17］，并且研究發(fā)現(xiàn)在動物細(xì)胞線粒體內(nèi)NADPH 主要生理功能是去促進脯氨酸的生物合成［18-19］，進一步說明線粒體功能與脯氨酸代謝之間有著重要的聯(lián)系。但在植物中尚無這方面的遺傳學(xué)證據(jù)。

Han 等［14］曾經(jīng)報道植物特有基因SSR1編碼1個線粒體蛋白，可能在維持mETC 活性中發(fā)揮功能，其部分缺失突變體ssr1-1對脯氨酸毒性超敏感。為了更好地探索SSR1在線粒體中的功能，以及脯氨酸毒性與線粒體功能之間的關(guān)系，本研究對SSR1敲除突變體ssr1-2的脯氨酸敏感性和鐵營養(yǎng)的利用等方面進行了詳細(xì)鑒定。

本研究對ssr1-2進行了表型跟蹤鑒定，發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下ssr1-2根長和冠幅均顯著小于野生型，但短根的表型出現(xiàn)早于地上部分的表型。結(jié)合之前的SSR1轉(zhuǎn)錄本在根中遠(yuǎn)高于葉片中的結(jié)果，故推測SSR1在根中的作用大于葉中的。為了區(qū)分ssr1-2地上部分矮小是SSR1缺失直接導(dǎo)致的，還是由于短根所引起的營養(yǎng)不良導(dǎo)致，通過微嫁接技術(shù)對突變體和野生型進行上下部分交換。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ssr1-2的短根使得WS地上部分變小，而WS 的正常根則能部分恢復(fù)ssr1-2的地上部分（圖3：B，C），說明短根確實影響了地上部的生長，可能是短根在吸收營養(yǎng)方面有所欠缺所導(dǎo)致。同時SSR1缺失也的確影響了植株地上部分的生長。此外發(fā)現(xiàn)ssr1-2的地上部分能夠反過來抑制WS的根的伸長，但是WS 的地上部分卻不能增加ssr1-2的根長（圖3C）。這可能是ssr1-2地上部生長素的合成或者運輸減弱了［13］，無法正常輸送生長素到根部。

脯氨酸敏感性分析結(jié)果表明，相比于野生型WS，ssr1-2在種子萌發(fā)、主根生長和葉綠素含量等指標(biāo)上表現(xiàn)出脯氨酸超敏感。而葉片面積上則無顯著差別，也可能是培養(yǎng)時間不夠長，差別尚未顯示出來的緣故。而這一超敏感性在互補株系（ssr1-2C）中得到了恢復(fù)，說明ssr1-2所表現(xiàn)出的脯氨酸超敏感表型的確由SSR1突變引起的，即SSR1具有維持對脯氨酸抗性的功能。抑制子突變體EMS143和EMS145正常條件下的根長基本恢復(fù)到了WS 野生型水平（圖2D，表2），但根長對脯氨酸的敏感性則并未得到恢復(fù)，反而變得更加敏感。這些結(jié)果表明，抑制子突變體并不足以抑制ssr1-2在所有生長條件下的表型，在由脯氨酸處理引起的線粒體脅迫條件下則不能恢復(fù)生長缺陷。且2個抑制子突變體在脯氨酸處理條件下恢復(fù)情況有所不同，這可能是與2個抑制子基因在線粒體鐵硫簇合成過程中發(fā)揮功能的重要性有關(guān)。

鐵是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，例如，它是合成鐵硫簇的原料，也是葉綠素合成所必需的。Han等［14］曾經(jīng)報道，ssr1-1在脯氨酸處理下，胞內(nèi)鐵含量、一些線粒體鐵硫蛋白的活性顯著低于野生型，說明SSR1參與胞內(nèi)鐵平衡和鐵硫蛋白活性的維持。在本研究中進一步研究了ssr1-2對外加鐵營養(yǎng)的響應(yīng)。多項生長指標(biāo)檢測結(jié)果表明，ssr1-2對鐵營養(yǎng)的響應(yīng)大大減弱。這與筆者的抑制子鑒定結(jié)果相吻合，即ssr1-2短根表型能夠被2 個編碼線粒體鐵硫簇合成相關(guān)蛋白的基因所發(fā)生的功能獲得性突變所抑制，而鐵硫簇合成是鐵營養(yǎng)利用的主要途徑。因此，筆者推測ssr1-2的脯氨酸超敏感表型的出現(xiàn)可能是由于線粒體鐵硫簇供應(yīng)不足，致使mETC 中重要的鐵硫蛋白活性下降導(dǎo)致的，脯氨酸降解為mETC 提供電子無法完全消化，最終導(dǎo)致電子溢出引起線粒體內(nèi)活性氧水平上升，從而抑制植物的生長發(fā)育［20］。但具體的分子機理還有待于進一步闡明。

鐵對葉綠素合成是必需的。在缺鐵情況下，各個株系的葉綠素水平都較低，導(dǎo)致植株葉片黃色化。而不同的鐵濃度，都能增加葉綠素含量，有意思的是，ssr1-2的葉綠體含量對鐵還是有響應(yīng)的，雖然響應(yīng)有所降低（表3）。這可能是因為SSR1 為線粒體蛋白，所以特異地在線粒體而不在葉綠體中起作用。

本研究結(jié)果表明，SSR1可能通過影響鐵營養(yǎng)利用參與了對擬南芥根生長的調(diào)控，暗示線粒體鐵利用機制的損傷可能是對脯氨酸毒性敏感性增強的原因之一。這些結(jié)果將為進一步深入闡明SSR1在線粒體中的功能提供了可靠的依據(jù)。