羊草WRKY40的克隆及其轉(zhuǎn)基因煙草抗病性分析

李丹妮 劉佳麗 張繼濤 顧寶祥 朱鳳金 管清杰*

（1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)春 130000）

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物之一，白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae）［1］、紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［2］、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）［3］、惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）［4］對(duì)水稻的侵害已嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)前研究表明化學(xué)藥劑、栽培措施等防治效果不佳，因此挖掘抗病基因以及研究抗性機(jī)制成為選育抗病品種的重要途徑。

盡管目前對(duì)水稻抗病機(jī)制尚不明確，但對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）等模式植物的抗逆反應(yīng)機(jī)制的研究表明，植物中的WRKY 蛋白在調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，例如WRKY基因參與抵御干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫、病害脅迫等非生物脅迫反應(yīng)［5-6］。其中AtWRKY40參與擬南芥干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程［7］、MsWRKY11基因可以提高紫花苜蓿（Campylotropis polyantha）的耐鹽能力［8］、PtrWRKY40能夠提高毛果 楊（Populus trichocarpa）的 抗 旱 能 力［9］、Pm-WRKY40在梅花（Prunus mume）抵御低溫脅迫中發(fā)揮重要作用［10］。

WRKY 家族是整個(gè)綠色譜系高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族［11］，在植物抗病反應(yīng)的信號(hào)途徑調(diào)控中也扮演重要角色［12］。谷子（Setaria italica）WRKY 轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)白發(fā)病菌（Sclerospora graminicola）脅迫［13］、GhWRKY22基因正調(diào)控棉花對(duì)黃萎?。╲erticillium wilt）的抗性［14］。WRKY TFs在抗病脅迫中可以作為不同壓力介導(dǎo)的信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)。CmWRKY15-1 可通過(guò)水楊酸信號(hào)通路，而正向調(diào)控菊花（Dendranthema morifolium）的白色銹?。ˋlbugo portulacae）抗性［15］。在Xa21 介導(dǎo)的抗白葉枯病響應(yīng)中，OsWRKY68 發(fā)揮正調(diào)控作用［16］。WRKY40 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控病害脅迫的信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MdWRKY40 介導(dǎo)提高蘋果（Malus pumila）與擬南芥對(duì)輪紋病菌（Physalospora piricola）的免疫抗性，調(diào)節(jié)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育功能［17］。OsWRKY40 和52 可能參與到Xa21 介導(dǎo)的抗白葉枯病途徑中發(fā)揮作用［18］。

目前羊草（Leymus chinensis）是畜牧業(yè)中優(yōu)質(zhì)飼料資源，是中國(guó)內(nèi)蒙古東部、東北平原等草地的重要優(yōu)勢(shì)建群種，其根系橫豎交織形成的根網(wǎng)，可抵御植物的根入侵［19-20］，同時(shí)羊草自身的抗病基因也會(huì)提高其他作物對(duì)病害的耐受性［21］。

本研究以羊草為材料篩選抗病基因來(lái)提高水稻的抗病害能力，而WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在抗病脅迫中可以作為信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)，因此選擇從羊草中克隆WRKY40 作為研究對(duì)象；以RT-PCR 方法克隆LcWRKY40基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確Lc-WRKY40 蛋白在亞細(xì)胞發(fā)揮功能的場(chǎng)所，以及在羊草不同組織器官中的表達(dá)特異性；通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得異源表達(dá)LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草，并利用注射接菌煙草葉片的試驗(yàn)法驗(yàn)證LcWRKY40基因與抗病性的相關(guān)性，旨在探究羊草LcWRKY40的功能，并為后續(xù)作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

羊草種子（采收于安達(dá)市東北林業(yè)大學(xué)野外試驗(yàn)田）、本氏煙草由東北林業(yè)大學(xué)（東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）保存。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、pCXSN植物表達(dá)載體、pBI121∶∶GFP植物熒光表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。pMD18-Tvector 購(gòu)于TaKaRa公司。水稻白葉枯病菌、水稻惡苗病菌、水稻紋枯病菌和水稻稻瘟病菌由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院王繼春課題組提供。

1.1.3 試劑

2×Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix、2×Ex-TaqDNA 聚合酶、RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司，其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羊草總RNA的提取以及cDNA的合成

運(yùn)用北京康為世紀(jì)公司的RNA提取試劑盒提取羊草葉片的總RNA。運(yùn)用北佳生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒，制備cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物20 μL。

1.2.2LcWRKY40全長(zhǎng)序列克隆

以LcWRKY40（登錄號(hào)：MN187915）的CDS 序列設(shè)計(jì)特異性引物（見(jiàn)表1），以羊草cDNA 為模板，用RT-PCR 擴(kuò)增LcWRKY40的全長(zhǎng)序列，使用OMEGA 膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，連接pMD18-T 載體后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素的抗性篩選培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，選取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，應(yīng)用北京康為世紀(jì)公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后送到庫(kù)美公司測(cè)序。

表1 LcWRKY40基因引物Table 1 Primer sequences of LcWRKY40

1.2.3LcWRKY40生物信息學(xué)和進(jìn)化樹(shù)分析

在NCBI（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線網(wǎng)站上通過(guò)BLAST 對(duì)LcWRKY40基因進(jìn)行同源性分析比對(duì)；NCBI ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析開(kāi)放閱讀框；通過(guò)MEGA 7.0軟件制作LcWRKY40 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用在線網(wǎng)站W(wǎng)ebLogo（http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi）對(duì)LcWRKY40 蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析并作圖；利用在線網(wǎng)站Hum-mPLoc3.0（Hum-mPLoc 3.0 server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Hum-mPLoc3/））預(yù)測(cè)LcWRKY40的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 LcWRKY40蛋白的亞細(xì)胞定位

根據(jù)LcWRKY40基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)特異性引物（見(jiàn)表1），以pMD18-T-LcWRKY40質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，將回收反應(yīng)產(chǎn)物與經(jīng)XbaⅠ和SalⅠ酶切后的pBI121：：GFP載體進(jìn)行連接，獲得重組表達(dá)載體pBI121：：LcWRKY40：：GFP。利用電擊法將重組載體和空載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌注射方法將其注入到煙草背面，暗培養(yǎng)48 h。通過(guò)激光共聚焦熒光顯微鏡（Olympus Imager.Z2，日本）觀測(cè)LcWRKY40蛋白亞細(xì)胞定位。

1.2.5LcWRKY40組織器官的表達(dá)模式分析

對(duì)安達(dá)市東北林業(yè)大學(xué)野外試驗(yàn)田長(zhǎng)勢(shì)基本一致的羊草植株根、莖、葉、葉鞘、稃和花藥組織部位取樣，提取總RNA。將1 μg 總RNA 作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選用羊草LcActin為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR 分析。用MxPro-Mx3000P 系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)操作，每個(gè)試驗(yàn)樣品分別進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)和3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

構(gòu)建植物表達(dá)載體pCXSN：：LcWRKY40，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型本氏煙草植株，將浸泡過(guò)農(nóng)桿菌液的煙草葉片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+As）上暗培養(yǎng)3 d后，再換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至植株。將得到的T0代種子播種于含有25 mg·L-1Hyg 的1/2MS 培養(yǎng)基篩選。觀察在潮霉素篩選下煙草的生長(zhǎng)情況，選取轉(zhuǎn)化株系和對(duì)照株系提取基因組DNA，利用LcWRKY40-F2、LcWRKY40-R2 進(jìn)行過(guò)表達(dá)植株的分子鑒定。

1.2.7LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系相對(duì)表達(dá)量分析

分別取生長(zhǎng)到四葉期的野生型煙草（WT）和LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系（#1，#2，#3，#4），分別提取植株總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，LcActin為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR 試驗(yàn)，檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。用MxPro-Mx3000P 系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)操作，每個(gè)試驗(yàn)樣品分別進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.8LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性分析

將水稻植株病害和健康的交界處表面消毒后，剪切置于PDA 培養(yǎng)基分離純化，得到4 種病菌：水稻白葉枯病菌、水稻惡苗病菌、水稻紋枯病菌和水稻稻瘟病菌。將病菌注射進(jìn)野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草第3 枚葉片后觀察培養(yǎng)，并將第3 枚葉片臨近表型相似的葉片剪下作為處理前對(duì)照。將通過(guò)攝影生物顯微鏡（Olympus-SZX-FOF，日本）測(cè)量的葉片病菌侵蝕面積作為鑒定其抗病能力的依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcWRKY40基因克隆與生物信息學(xué)分析

2.1.1 羊草葉片總RNA 的提取及LcWRKY40基因的克隆

提取羊草葉片的總RNA（見(jiàn)圖1A），將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。對(duì)LcWRKY40目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，目的基因條帶在1 000 bp 偏上的位置（見(jiàn)圖1B）回收DNA 片段連接插入pMD18-T 載體，質(zhì)粒pMD18-T-LcWRKY40送樣測(cè)序正確。

圖1 羊草葉片總RNA的提取及LcWRKY40基因的克隆A.羊草葉片總RNA電泳檢測(cè)；B.PCR 擴(kuò)增目的基因（M.DNA Marker；1.LcWRKY40目的基因）Fig.1 Extraction of Total RNA from Leymus chinensis leaves and cloning of LcWRKY40 GeneA.Electrophoretic detection of total RNA of Leymus chinensis leaves；B.PCR amplification of target genes（M.DNA Marker；1.LcWRKY40 target gene）

2.1.2LcWRKY40基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)運(yùn)用NCBI 在線網(wǎng)站比對(duì)分析，顯示Lc-WRKY40基因全長(zhǎng)1 791 bp，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度是313 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度是425 bp，ORF 區(qū)域長(zhǎng)度為1 053 bp，編碼350個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為38.1 kDa。WebLogo 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示LcWRKY40 蛋白有WRKYGQK 結(jié)構(gòu)域以及鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域（218～250 bp），并含有SRKRKS 核定位序列（見(jiàn)圖2A）。構(gòu)建LcWRKY40 蛋白（登錄號(hào)：QIG37591）進(jìn)化樹(shù)后發(fā)現(xiàn)，LcWRKY40 蛋白和HvWRKY38 親緣關(guān)系接近（見(jiàn)圖2B），并對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析的結(jié)果顯示其鋅指蛋白結(jié)構(gòu)序列為C-X5-C-X23-H-X-H（見(jiàn)圖2A）。利用在線網(wǎng)站Hum-mPLoc3.0 預(yù)測(cè)LcWRKY40 蛋白定位于細(xì)胞核中發(fā)揮特定功能（見(jiàn)圖2C）。

圖2 LcWRKY40基因生物信息學(xué)分析A.不同物種WRKY 轉(zhuǎn)錄因子同源序列比對(duì)（左側(cè)黑色序列部分為WRKY 基序與右側(cè)C2H2 鋅指蛋白保守序列）；B.LcWRKY40 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；C.LcWRKY40蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Fig.2 The bioinformatics analysis of LcWRKY40 geneA.WRKY transcription factor of different species homologous sequence alignmen（tThe left black sequence is WRKY motif and the right C2H2 zinc finger protein conserved sequence）；B.The phylogenetic tree of LcWRKY40 protein；C.The prediction of LcWRKY40 protein subcellular localization

2.2 LcWRKY40蛋白亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)酶切連接構(gòu)建pBI121：：LcWRKY40：：GFP重組表達(dá)載體，在根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，通過(guò)煙草注射法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，顯微鏡檢測(cè)到綠色熒光蛋白發(fā)光信號(hào)，DPAI 細(xì)胞核染色，二者重合（見(jiàn)圖3），結(jié)果說(shuō)明LcWRKY40蛋白在細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。

圖3 煙草細(xì)胞中LcWRKY40蛋白的亞細(xì)胞定位35s：：GFP為對(duì)照組；35s：：LcWRKY40：：GFP為實(shí)驗(yàn)組Fig.3 Subcellular localization of LcWRKY40 protein in tobacco cells35s：：GFP as a control group；35s：：LcWRKY40：：GFP as the experimental group

2.3 LcWRKY40 基因時(shí)間和空間的表達(dá)特性分析

通過(guò)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Lc-WRKY40基因在羊草不同生長(zhǎng)期的組織器官的差異表達(dá)特性。LcWRKY40基因在羊草的根、莖、葉、葉鞘、稃、花藥中均會(huì)表達(dá)，并且表達(dá)量在葉中達(dá)到最高，在稃中最低（見(jiàn)圖4）。

圖4 LcWRKY40基因組織器官表達(dá)特性分析誤差線代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差；下同F(xiàn)ig.4 Analysis on the expression characteristics of LcWRKY40 geneError lines represented standard errors for three biological replicates；the same as below

2.4 pCXSN：：LcWRKY40 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的篩選鑒定

2.4.1 植物表達(dá)載體pCXSN：：LcWRKY40的鑒定

應(yīng)用LcWRKY40-F2 和R2 引物擴(kuò)增獲得的ORF 基因片段與植物表達(dá)載體pCXSN 連接，通過(guò)BamHⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒，經(jīng)1%凝膠電泳后，目的條帶大小與預(yù)期相符，表明pCXSN：：LcWRKY40載體構(gòu)建成功（見(jiàn)圖5A），電擊轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌。

2.4.2 過(guò)表達(dá)LcWRKY40煙草分子鑒定及篩選

載體構(gòu)建成功（見(jiàn)圖5A），以電擊轉(zhuǎn)化將pCXSN：：LcWRKY40導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，侵染本氏煙草，篩選到T0 代抗性轉(zhuǎn)化子，再使用潮霉素篩選Lc-WRKY40轉(zhuǎn)基因煙草種子（圖5B）。以其幼葉中提取的DNA 為模板、LcWRKY40-F2、LcWRKY40-R2 為引物、并以pCXSN：：LcWRKY40質(zhì)粒和野生型煙草DNA 分別做陽(yáng)性、陰性對(duì)照，進(jìn)行過(guò)表達(dá)植株的PCR鑒定（圖5C），結(jié)果獲得轉(zhuǎn)基因株系，移栽花盆中培養(yǎng)。

圖5 LcWRKY40過(guò)表達(dá)煙草的分子鑒定及篩選A.pCXSN：：LcWRKY40 酶切鑒定（M.DNA Marker；1.pCXSN：：LcWRKY40 重組載體酶切片段）；B.過(guò)表達(dá)LcWRKY40 煙草轉(zhuǎn)化苗的潮霉素抗性篩選（WT.野生型；#1～#3.3個(gè)T0代的不同轉(zhuǎn)基因株系）；C.轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定（M.DNA Marker；CK+、CK-分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；#1～#4.4個(gè)T0代的不同轉(zhuǎn)基因株系）Fig.5 Molecular identification and screening of Tobacco with LcWRKY40 overexpressionA.The Enzyme digestion identification pCXSN：：LcWRKY40（M.DNA Marker；1.Enzyme digestion of pCXSN：：LcWRKY40 recombinant vector）；B.Screening of hygromycin resistance of transgenic tobacco seedlings with overexpression of LcWRKY40 gene（WT.Wild type；#1-#3.Three different transgenic lines of T0 generation）；C.PCR identification of transgenic plants（M.DNA Marker；CK+ and CK-were positive control and negative control respectively；#1-#4.Four different transgenic lines of T0 generation）

2.4.3LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系相對(duì)表達(dá)量分析

在經(jīng)過(guò)篩選后的T1 代陽(yáng)性植株中，提取植株RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示：LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系#1、#2、#3、#4表達(dá)量明顯高于野生型（見(jiàn)圖6），可進(jìn)行后期抗性脅迫試驗(yàn)。

圖6 LcWRKY40 轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)表達(dá)量WT.野生型植株；#1～#4.轉(zhuǎn)基因植株Fig.6 Analysis of relative expression of LcWRKY40 in transgenic tobaccoWT.Wild-type plant；#1-#4.Transgenic plant

2.5 LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草抗病性分析

以病菌接種煙草葉片的損傷面積、萎蔫程度及注射前后煙草葉片的生長(zhǎng)狀態(tài)作為評(píng)價(jià)煙草抗病性的依據(jù)（圖7A）。無(wú)論是野生型煙草還是轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)水稻白葉枯病菌均不敏感，陽(yáng)性煙草反而不如野生型煙草對(duì)水稻紋枯病耐受，而注射水稻稻瘟病菌的野生型煙草損傷面積是同樣注射水稻瘟病菌的轉(zhuǎn)基因煙草損傷面積的3.5 倍（圖7B）。注射水稻惡苗病菌的野生型煙草出現(xiàn)萎蔫、黃化甚至腐爛的現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因煙草無(wú)腐爛情況，并對(duì)水稻惡苗病菌的侵害表現(xiàn)出極大的緩解作用。注射水稻惡苗病菌的野生型煙草損傷面積是轉(zhuǎn)基因煙草損傷面積的1.5 倍（圖7B）。以上說(shuō)明LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)水稻稻瘟病菌、水稻惡苗病菌具有極高的抗病性，LcWRKY40可能參與稻瘟病和惡苗病的抗性調(diào)節(jié)。

圖7 LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草抗病性分析A.野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草抗病性表型差異；B.野生型和轉(zhuǎn)基因煙草接種病菌后損傷面積的差異；***.WT 株系與T3 代轉(zhuǎn)基因株系差異顯著（P＜0.001）Fig.7 The extraction of total RNA from Leymus chinensis leaves and cloning of LcWRKY40 geneA.Phenotypic difference of disease resistance between wild-type and transgenic tobacco；B.Difference in damage area between wild-type and transgenic tobacco inoculated with bacteria；***.There were significant differences between WT lines and T3 transgenic line（sP＜0.001）

3 討論與結(jié)論

目前鑒定抗病基因并培育抗病水稻品種是根治水稻病害的最佳方案［22］。據(jù)報(bào)道羊草自身基因可提高作物對(duì)病害的耐受性，而植物種特有的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路來(lái)提高植物抗病性［23］。

本研究在羊草葉片中克隆得到LcWRKY40基因，羊草不同組織器官表達(dá)分析顯示LcWRKY40基因主要在葉片中表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因葉片接菌后，轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)速度快于野生型，推測(cè)該基因可能參與病害脅迫下葉片生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控［24］。LcWRKY40 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 分 析 顯 示 存 在WRKYGQK 結(jié)構(gòu)域和包含C2H2 鋅指蛋白保守序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，推測(cè)與真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫的耐受能力都有著重要關(guān)系［25］。本研究通過(guò)pBI121：：LcWRKY40：：GFP融合表達(dá)載體的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LcWRKY40 蛋白定位于細(xì)胞核，推測(cè)其可能參與細(xì)胞信號(hào)分子的調(diào)控。構(gòu)建LcWRKY40 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，LcWRKY40 蛋白與BdWRKY（二穗短柄草Brachypodium distachyon）具 有 同 源 性，而B(niǎo)dWRKY 對(duì)調(diào)節(jié)小麥抗病害中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［26］。在含pCXSN：：LcWRKY40農(nóng)桿菌介導(dǎo)下侵染獲得異源表達(dá)的LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草植株，為后續(xù)抗病害脅迫奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過(guò)注射法接種水稻白葉枯病菌、水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、水稻惡苗病菌于煙草葉片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：LcWRKY40轉(zhuǎn)基因煙草株系對(duì)水稻稻瘟病菌、水稻惡苗病菌具有極高的抗病性。推測(cè)WRKY40 轉(zhuǎn)錄因子可能作為病菌脅迫介導(dǎo)的信號(hào)通路的節(jié)點(diǎn)，與CaWRKY40 受水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，并協(xié)調(diào)對(duì)青枯菌侵襲的熱激響應(yīng)相類似［27］。

本研究克隆到LcWRKY40基因，并檢測(cè)到抗病性調(diào)節(jié)，為揭示LcWRKY40基因參與植物對(duì)稻瘟病和惡苗病抗性調(diào)節(jié)的作用進(jìn)行初步探索，為將來(lái)水稻抗病性育種提供了基因資源，也為探索異源表達(dá)提高水稻抗逆性奠定了分子基礎(chǔ)。