CUL4相關(guān)因子7、微RNA-589-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

楊洋，王高波，李文清，王佳，楊博偉，馬蓉

作者單位：寶雞市人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，陜西 寶雞721000

據(jù)全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年結(jié)直腸癌的全球發(fā)病率位居第3 位，死亡率位居第2 位［1-2］。結(jié)直腸癌也是我國的第三大常見惡性腫瘤［3］。尋找有效的分子靶標(biāo)對改善結(jié)直腸癌病人預(yù)后有重要作用。相關(guān)研究顯示，微RNA 與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在密切關(guān)系［4-6］。微RNA-589-5p（miR-589-5p）可調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡［7］。He 等［8］研究顯示，miR-589-5p 低表達(dá)促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖遷移。Qian 等［9］通過分析顯示，CUL4 相關(guān)因子7（DCAF7）對轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌具有診斷價(jià)值，且對腎細(xì)胞癌病人預(yù)后具有良好的預(yù)測價(jià)值。筆者通過檢索Target Scan Human 網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，miR-589-5p 與DCAF7 存在結(jié)合位點(diǎn)。本研究選取結(jié)直腸癌病人78例為研究對象，探究miR-589-5p、DCAF7在結(jié)直腸癌中臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2018 年9 月至2019 年9 月于寶雞市人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)的78例病人，年齡范圍32～73 歲，年齡（53.29±11.61）歲，男性46 例，女性32 例。手術(shù)過程中留取癌旁組織及結(jié)直腸癌組織，癌旁組織距離腫瘤組織上緣＞5 cm，組織沖洗后，液氮冷凍。TNM 分期參照第7 版（2010）結(jié)直腸癌美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)［10］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌；②原發(fā)性結(jié)直腸初診者；③年齡大于20 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前接受過腫瘤放、化療；③合并心、肝、腎等嚴(yán)重疾病者；④存在自身免疫缺陷疾病。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 檢測結(jié)直腸癌組織中miR-589-5p、DCAF7 mRNA 表達(dá)水平使用TRIzol 試劑（北京百奧萊博科技有限公司）提取組織總RNA，用NanoDropND-1000 分光光度儀（美國NanoDrop Tech 司）檢測RNA的純度及濃度，依據(jù)Primescript RT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）說明書反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA（cDNA）。采用7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）對miR-589-5p、DCAF7 mRNA及內(nèi)參U6、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。按照試劑盒說明書建立反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。miR-589-5p、U6引物由上海生工合成。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃，30 s；40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct 值進(jìn)行分析，用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-589-5p相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法引物序列

1.3 免疫組化檢測結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白表達(dá)采用免疫組化染色法檢測DCAF7 蛋白表達(dá)。陰性對照采用生理鹽水磷酸鹽緩沖液（PBS）。結(jié)果判定：由2位專業(yè)人員盲法審片，每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。DCAF7陽性表達(dá)為出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒。按染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色（0分），淺黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）。陽性細(xì)胞所占百分比評分：≤10%記0 分，11%～50%計(jì)1 分，51%～75%計(jì)2 分，＞75%計(jì)3 分。兩次評分乘積為最終得分，≤2分為陰性表達(dá)，＞2分為陽性表達(dá)。

1.4 隨訪從結(jié)直腸癌病人入院手術(shù)后開始隨訪，隨訪至2021年9月，最長隨訪時(shí)間3年，以電話或門診方式隨訪。記錄病人總生存時(shí)間，即開始治療到至因任何原因引起死亡的時(shí)間。

1.5 Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索在Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕ualcan.path.uab.edu）中檢索。設(shè)定gene symbol 分別為miR-589-5p、DCAF7，設(shè)定用TCGA 數(shù)據(jù)庫為Colon adenocarcinoma，分析miR-589-5p、DCAF7表達(dá)。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)直腸癌細(xì)胞（SW837）及人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460接種于含有1%雙抗+10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度到70%～80%時(shí)，傳代2～3次。

1.6.2分組及轉(zhuǎn)染 將SW837 細(xì)胞接種到6 孔板（2×105個(gè)∕孔）中在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞分為Control 組、mimic 組、miR mimic 組，miR mimic+pc-NC 組，miR mimic+pc-DCAF7 組，使用Lipofectamine?2000 試劑盒分別將mimic、miR-589-5p mimic、pcDNA3.1、pcDNA3.1 DCAF7 轉(zhuǎn)染至各組SW837 細(xì)胞，48 h 后，收取轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測miR-589-5p、DCAF7表達(dá)。

1.6.3Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測SW837 細(xì)胞侵襲能力取“1.6.2”方法中的各組SW837 細(xì)胞，Transwell 小室上室中Matrigel 膠晾干后，吸取200 μL 細(xì)胞懸液注入Transwell 小室上室內(nèi)，下室添加500 μL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，擦去未過膜的SW837 細(xì)胞，無水乙醇固定（15 min）后進(jìn)行結(jié)晶紫染色（25 min），在鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6.4雙螢光素酶報(bào)告基因檢測miR-589-5p、DCAF7 的靶向關(guān)系 使用TargetScanHuman 網(wǎng)站預(yù)測miR-589-5p 與DCAF7 的結(jié)合位點(diǎn)；擴(kuò)增與miR-589-5p結(jié)合的DCAF7 3’UTR 片段，與pmirGLO 載體連接構(gòu)建pmirGLO-DCAF7-wt 野生型載體；使用定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合片段突變，構(gòu)建pmirGLODCAF7-mut 突變型載體。將SW837 細(xì)胞分為pmir-GLO-DCAF7-wt+miR-589-5p mimic 組、pmirGLODCAF7-wt+mimic NC 組、pmirGLO-DCAF7-mut+miR-589-5p mimic 組、pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC組，將pmirGLO-DCAF7-wt、pmirG LO-DCAF7-mut、mimic NC、miR-589-5p mimic 分別轉(zhuǎn)染至SW837 細(xì)胞中，24 h后檢測海腎及螢火蟲螢光值，計(jì)算相對螢光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用軟件SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料（miR-589-5p 相對表達(dá)量等）以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料（DCAF7 蛋白表達(dá)）用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。Spearman 法分析分析織miR-589-5p 與DCAF7 的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法分析結(jié)直腸癌組織miR-589-5p、DCAF7 表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系，行l(wèi)og-rank 檢驗(yàn)；多因素Cox 回歸分析影響結(jié)直腸癌預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ualcan 數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸腺癌組織和癌旁組織miR-589-5p、DCAF7表達(dá)水平比較Ualcan 數(shù)據(jù)庫中，結(jié)腸腺癌組織中miR-589-5p 表達(dá)水平低于癌旁組織（P＜0.001）；結(jié)腸腺癌組織DCAF7 表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.001）。見圖1，2。

圖1 結(jié)腸腺癌癌旁組織與癌組織中miR-589表達(dá)水平比較

2.2 miR-589-5p、DCAF7 在結(jié)直腸癌組織上的表達(dá)水平與癌旁組織DCAF7 陽性表達(dá)率12.82%（10∕78）相比，結(jié)直腸癌組織中DCAF7 陽性表達(dá)率62.82（49∕78）相對表達(dá)水平較高（χ2=41.46，P＜0.001）。與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中DCAF7 mRNA 相對表達(dá)水平較高（P＜0.05），miR-589-5p 相對表達(dá)水平較低（P＜0.05），見表2。

表2 miR-589-5p在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織表達(dá)水平比較∕

表2 miR-589-5p在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織表達(dá)水平比較∕

注：miR-589-5p為微RNA-589-5p，DCAF7為CUL4相關(guān)因子7。

2.3 結(jié)直腸癌癌組織miR-589-5p 和DCAF7 表達(dá)水平的相關(guān)性根據(jù)miR-589-5p 平均值（0.44）將結(jié)直腸癌組織分為高表達(dá)組36 例（其中DCAF7 陽性表達(dá)12 例，陰性表達(dá)24 例），低表達(dá)組共42 例（其中DCAF7 陽性表達(dá)37 例，陰性表達(dá)5 例），經(jīng)Spearman 相關(guān)分析顯示，組織中miR-589-5p 與DCAF7 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.56，P＜0.05）。

2.4 miR-589-5p、DCAF7 表達(dá)與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系觀察結(jié)果顯示miR-589-5p、DCAF7 均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度相關(guān)（P＜0.05），與病人年齡、性別、TNM分期、腫瘤長徑、組織分化程度無關(guān)（P＞0.05）。詳見表3。

表3 miR-589-5p、DCAF7表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系∕例（%）

2.5 miR-589-5p、DCAF7 表達(dá)與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier 法顯示miR-589-5p 高表達(dá)組生存時(shí)間為（32.06±1.30）個(gè)月，顯著長于miR-589-5p 低表達(dá)結(jié)直腸癌病人（24.25±1.73）個(gè)月，log Rank 檢驗(yàn)，χ2=10.55，P=0.001。DCAF7 陰性表達(dá)生存時(shí)間為（31.51±1.55）個(gè)月，顯著長于DCAF7 陽性（25.52±1.59）個(gè) 月，Log Rank 檢 驗(yàn)，χ2=6.22，P=0.013。見圖3。

圖2 結(jié)腸腺癌癌旁組織與癌組織中CUL4相關(guān)因子7（DCAF7）表達(dá)水平比較

圖3 miR-589-5p、CUL4相關(guān)因子7（DCAF7）表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系：A為miR-589-5p表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系；B為DCAF7表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病人預(yù)后的關(guān)系

2.6 影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素分析單因素分析表明，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-589-5p、DCAF7 均是影響結(jié)直腸癌病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，見表4。多因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無轉(zhuǎn)移∕有轉(zhuǎn)移）HR及 其95%CI為1.80（1.10，2.96）（P=0.020）、miR-589-5p（高表達(dá)∕低表達(dá)）HR及其95%CI為1.92（1.26，2.93）（P=0.003）、DCAF7（陰性∕陽性）HR及其95%CI為1.80（1.20，2.81）（P=0.005）是影響結(jié)直腸癌病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。

表4 影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

2.7 DCAF7 與miR-589-5p 在NCM460 細(xì)胞和SW837 細(xì)胞中表達(dá)水平比較NCM460 細(xì)胞組DCAF7 表達(dá)水平為1.02±0.09，miR-589-5p 表達(dá)水平為1.01±0.11，與NCM460 細(xì)胞比，SW837 細(xì)胞中DCAF7 的表達(dá)2.62±0.29 升高（t=11.78，P＜0.001），miR-589-5p 的表達(dá)0.36±0.06 降低（t=11.60，P＜0.001）。

2.8 各組SW837 中miR-589-5p、DCAF7 表達(dá)水平及細(xì)胞侵襲能力比較與Control 組比，miR mimic組miR-589-5p 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），DCAF7 表達(dá)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與miR mimic 組比，miR mimic+pc-DCAF7組miR-589-5p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DCAF7 表達(dá)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05），見圖4，表5。

表5 結(jié)腸腺癌病人各組SW837細(xì)胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞侵襲能力比較∕

表5 結(jié)腸腺癌病人各組SW837細(xì)胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞侵襲能力比較∕

注：miR-589-5p為微小RNA-589-5p，DCAF7為CUL4相關(guān)因子7。①與Control組比較，P＜0.05。②與miR mimic組比較，P＜0.05。

圖4 結(jié)腸腺癌病人各組SW837細(xì)胞侵襲能力比較（結(jié)晶紫染色×200）

2.9 DCAF7 與miR-589-5p 靶向關(guān)系驗(yàn)證TargetScanHuman 網(wǎng)址 預(yù)測DCAF7 與miR-589-5p 間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。雙螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：與pmirGLO-DCAF7-wt+mimic NC 組相比0.99±0.12，SW837 細(xì)胞螢光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-wt miR-589-5p mimic 組0.31±0.03 顯著降低（t=12.40，P＜0.001），與pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC組相比0.97±0.11，SW837 細(xì)胞螢光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-mut miR-589-5p mimic 組0.99±0.14差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.25，P=0.808）。

圖5 結(jié)腸腺癌病人CUL4相關(guān)因子7（DCAF7）與微RNA（miR）-589-5p結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率一直在增加［11-12］。尤其是中晚期結(jié)直腸癌病人［13-14］。目前，根治性手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的有效方法，但早期病程隱匿及大多數(shù)結(jié)腸癌病人就診時(shí)已處于中晚期是病人預(yù)后差的主要原因［15］。已證實(shí)，一些腫瘤分子與結(jié)直腸癌病理特征及預(yù)后有密不可分的關(guān)系［16-17］。

本研究通過Ualcan 數(shù)據(jù)庫分析表明，結(jié)腸腺癌組織中miR-589 表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，DCAF7 表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中DCAF7 陽性表達(dá)率及DCAF7 mRNA 相對表達(dá)水平較癌旁組織高，miR-589-5p 相對表達(dá)水平較癌旁組織低，表明本研究與Ualcan 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，提示miR-589-5p、DCAF7 可能對結(jié)直腸癌發(fā)生有影響。Wu、Zhang［18］通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，miR-589-5p 在腎細(xì)胞癌中作為LncRNA 賴氨酰氧化酶如1 反義RNA 1（LOXL1-AS1）分子海綿，高表達(dá)miR-589-5p 可抑制腎細(xì)胞癌的增殖和遷移，為腎細(xì)胞癌的治療開辟了新方向。Ji等［19］研究顯示miR-589-5p 在前列腺癌中下調(diào)，低表達(dá)miR-589-5p可通過靶向負(fù)調(diào)節(jié)趨化因子配體5而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲。Misir 等［20］通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析表明，乳腺癌組織中DCAF7 陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中miR-589-5p 與DCAF7 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miR-589-5p、DCAF7 均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度相關(guān)，提示miR-589-5p 可能與DCAF7 共同影響結(jié)直腸癌病情進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)miR-589-5p 高表達(dá)組病人平均生存時(shí)間顯著長于miR-589-5p 低表達(dá)結(jié)直腸癌病人，DCAF7 陰性表達(dá)病人平均生存時(shí)間顯著長于DCAF7陽性表達(dá)病人，miR-589-5p 低表達(dá)、DCAF7 陽性是影響結(jié)直腸癌病人不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-589-5p、DCAF7 可能影響結(jié)直腸癌預(yù)后不良發(fā)生，有作為結(jié)直腸癌預(yù)后新分子標(biāo)志物的潛力。本研究經(jīng)過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SW837 細(xì)胞中miR-589-5p 表達(dá)下調(diào)，DCAF7 表達(dá)上調(diào)，與miR-589-5p、DCAF7 在結(jié)直腸癌組織中研究結(jié)果一致，還證實(shí)miR-589-5p 與DCAF7 存在靶向關(guān)系，miR-589-5p 高表達(dá)抑制SW837 細(xì)胞侵襲，DCAF7 高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-589-5p高表達(dá)對SW837 細(xì)胞侵襲的抑制作用，表明miR-589-5p 高表達(dá)可能通過抑制DCAF7 表達(dá)來抑制SW83細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-589-5p 呈低表達(dá)、DCAF7 呈高表達(dá)，與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度以及預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望成為結(jié)直腸癌治療的新分子標(biāo)志物。但本研究尚未深入探討miR-589-5p、DCAF7 與結(jié)腸癌預(yù)后不良病理機(jī)制的關(guān)系，仍需深入探討。

（本文圖1～4見插圖6-10）