子癇前期中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的形成與血管內(nèi)皮損傷的相關(guān)性研究

藺玉建，徐玉靜，吳振蘭

作者單位：1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042；2濰坊市人民醫(yī)院產(chǎn)二科，山東 濰坊261000

子癇前期（PE）是與妊娠相關(guān)的一種高血壓疾病，我國(guó)產(chǎn)婦PE 發(fā)病率約為10%，且有逐年上升的趨勢(shì)，是臨床中常見(jiàn)的導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒發(fā)病率和病死率升高的原因之一［1-2］。目前為止，PE 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，缺乏有效的預(yù)測(cè)方法和預(yù)防手段，尋找可以準(zhǔn)確評(píng)估病情的標(biāo)志物，對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制的闡明、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中最普遍的白細(xì)胞，在固有免疫中發(fā)揮重要作用，隨著B(niǎo)rinkmann等［3］首次發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）或白細(xì)胞介素-8 的刺激下死亡釋放出一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將之命名為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）后，近年來(lái)關(guān)于NETs 的研究越來(lái)越多，已有研究證實(shí)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺炎鏈球菌肺炎、動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成等均與NETs 密切相關(guān)［4］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在PE 病人的血液及胎盤絨毛間隙內(nèi)存在大量NETs［5］，由此推斷NETs 參與PE 的發(fā)生。廣泛血管內(nèi)皮損傷是PE重要的病理變化，本研究探討PE 病人血清NETs 水平與血管內(nèi)皮損傷的相關(guān)性，旨在發(fā)現(xiàn)新的與PE 病情相關(guān)的標(biāo)志物，為治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020 年9 月至2021 年9 月間在濰坊市人民醫(yī)院產(chǎn)檢并分娩的產(chǎn)婦，在首次被診斷為PE 時(shí)納入PE 組（共30 例），選擇同期20～28 周于該院產(chǎn)檢并結(jié)束分娩的健康產(chǎn)婦30 例作為Nor-P 組，同期于該院進(jìn)行孕前檢查的健康未孕婦女30 例作為對(duì)照組。三組間研究對(duì)象年齡分別為（31.20±3.76）歲、（31.50±3.81）歲、（31.53±4.14）歲，三組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.07，P=0.936），PE 組和Nor-P 組孕周分別為（25.28±2.04）周、（25.76±2.40）周，兩組研究對(duì)象孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.83，P=0.410）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》［6］中對(duì)PE 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg，伴有尿蛋白≥0.3 g∕24 h，或隨機(jī)蛋白尿（+），或無(wú)蛋白尿但合并下列任何一項(xiàng)者：肺水腫、肝功能損害、腎功能損害、血小板減少、新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異?；蛞曈X(jué)障礙。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PE 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②既往無(wú)慢性原發(fā)性高血壓史及PE 病史；③自然妊娠且單胎妊娠；④孕期無(wú)特殊用藥及保胎史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并妊娠期糖尿病、妊娠期心臟病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠期急性脂肪肝；②合并甲狀腺功能亢進(jìn)、慢性腎炎、嗜鉻細(xì)胞瘤等內(nèi)科疾??；③合并感染性疾病或惡性腫瘤。

1.4 檢測(cè)方法PE 組產(chǎn)婦在初次診斷時(shí)留取空腹外周靜脈血標(biāo)本，對(duì)照組及Nor-P 組產(chǎn)婦在入組時(shí)留取空腹外周靜脈血標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)NETs 特異性標(biāo)志物瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3），血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物血管性血友病因子及髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平。人瓜氨酸組蛋白H3 試劑盒、人血管性血友病因子試劑盒、人髓過(guò)氧化物酶試劑盒均由艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司提供。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo)比較三組研究對(duì)象外周血白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、NETs水平、血管性血友病因子（vWF）水平、MPO 水平的差異，利用Pearson 檢驗(yàn)分析PE產(chǎn)婦血清NETs水平與中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮損傷的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)應(yīng)用表示，組間比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間多重比較用LSD 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、血清MPO 含量比較PE組白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量、血清MPO含量明顯高于對(duì)照組和Nor-P 組。三組婦女血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量，血清MPO 含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組婦女外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平比較/

表1 三組婦女外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平比較/

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.001。②與Nor-P組比較，P＜0.001。

2.2 血漿中內(nèi)皮損傷標(biāo)志物含量比較PE 組血清NETs含量高于對(duì)照組和Nor-P 組（P＜0.05），Nor-P 組與對(duì)照組血清NETs 的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PE 組血漿vWF 含量高于對(duì)照組和Nor-P 組，Nor-P 組血漿vWF 含量高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組婦女血漿中內(nèi)皮損傷標(biāo)志物含量比較/

表2 三組婦女血漿中內(nèi)皮損傷標(biāo)志物含量比較/

注：NET為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)，vWF為血管性血友病因子。①與對(duì)照組比較，P=0.706。②與對(duì)照組比較，P＜0.001。③與Nor-P組比較，P＜0.001。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1PE 產(chǎn)婦血清NETs含量與中性粒細(xì)胞的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PE 產(chǎn)婦血清中NETs的含量與白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、血清MPO含量均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 子癇前期產(chǎn)婦血清中NETs與中性粒細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系

2.3.2PE 產(chǎn)婦內(nèi)皮損傷程度與血清NETs含量的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PE 產(chǎn)婦內(nèi)皮損傷標(biāo)志物vWF 含量與血清NETs 含量呈正相關(guān)（r=0.83，P＜0.001）。

3 討論

NETs 是由活化的中性粒細(xì)胞經(jīng)歷一種特殊的死亡形式（NETosis）后釋放的細(xì)胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由DNA 骨架及結(jié)合在上的組蛋白和絲氨酸蛋白酶構(gòu)成［7］。多個(gè)研究證實(shí)，NETs 在某些感染性疾病、免疫性疾病中起到負(fù)面作用，如Tan 等［8］指出血清NETs 可以作為膿毒血癥病人病情嚴(yán)重程度和器官損傷程度的生化指標(biāo)。近期有研究發(fā)現(xiàn)，PE病人胎盤絨毛間隙中檢測(cè)到大量NETs 的存在，而胎盤血管閉塞、功能不全可能與此相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)：未孕婦女和健康產(chǎn)婦血清NETs 水平無(wú)明顯差異，而PE產(chǎn)婦血清NETs水平明顯高于未孕婦女和健康產(chǎn)婦，由此推斷高水平的NETs 參與PE 的發(fā)生。同時(shí)發(fā)現(xiàn)健康產(chǎn)婦血液中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞輕微升高，PE 的產(chǎn)婦升高明顯。Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PE 產(chǎn)婦血清NETs水平與白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，說(shuō)明NETs 的產(chǎn)生與白細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞有關(guān)。MPO 占中性粒細(xì)胞總蛋白的5%，占顆粒蛋白25%［10］，在中性粒細(xì)胞被激活時(shí)釋放到吞噬小體或細(xì)胞外，通過(guò)其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抵御微生物，MPO 在中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)中濃度很高并且承載著重要的殺菌作用，被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞的主要標(biāo)志物［11］。為了進(jìn)一步確定我們的觀點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了三組婦女外周血中MPO 的含量，結(jié)果提示PE 病人血清MPO 水平明顯高于未孕婦女和健康產(chǎn)婦，相關(guān)性分析提示PE 病人血清NETs 水平與MPO水平呈正相關(guān)，由此進(jìn)一步確定PE 產(chǎn)婦血清NETs的升高來(lái)自于中性粒細(xì)胞，但NETs 是否是由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前認(rèn)為子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙，導(dǎo)致母胎界面氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的釋放，引起全身廣泛血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能障礙是PE 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［12-13］。vWF 是由巨核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，具有黏附功能的多聚糖蛋白，主要儲(chǔ)存在血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade 小體中［14］，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后能夠釋放大量vWF，是血漿中vWF 的主要來(lái)源［15］。王聚瑾等［16］指出，vWF 是在血管內(nèi)皮損傷后調(diào)節(jié)血栓形成的重要因子，是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因子，能作為血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物。同樣Philippe 等［17］也指出，vWF 可作為COVID-19 病人血管內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物。Güng?r 等［18］則指出，vWF 在PE 中能較準(zhǔn)確地反應(yīng)血管內(nèi)皮損傷的程度。因此本研究通過(guò)檢測(cè)血漿vWF 含量來(lái)衡量血管內(nèi)皮損傷程度，結(jié)果顯示健康產(chǎn)婦、PE 產(chǎn)婦血漿vWF 含量高于未孕婦女，PE 產(chǎn)婦血漿中vWF 含量明顯增高，可見(jiàn)PE病人體內(nèi)存在廣泛的血管內(nèi)皮損傷。

胎盤在炎癥和氧化應(yīng)激的刺激下，胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞釋放大量微粒，微粒通過(guò)表達(dá)高遷移率族蛋白1 使外周中性粒細(xì)胞在胎盤絨毛間隙募集、活化［19］，而活化的中性粒細(xì)胞經(jīng)NETosis 過(guò)程產(chǎn)生NETs 調(diào)節(jié)胎盤蛋白13 參與子宮螺旋動(dòng)脈重鑄及血管內(nèi)皮損傷［20］。Ma 等［21］研究指出，NETs 的主要蛋白成分可以通過(guò)直接破壞細(xì)胞間的黏附連接并重組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，引起血管屏障功能障礙和血管微滲漏。本研究中發(fā)現(xiàn)PE產(chǎn)婦血清中NETs水平與血漿中vWF 水平都明顯增高，且呈正相關(guān)，證實(shí)NETs 可以引起PE 產(chǎn)婦的血管內(nèi)皮損傷，其含量的高低可以反映病情的嚴(yán)重程度。

綜上所述，PE 病人血清中NETs 的水平升高與母體內(nèi)皮損傷程度密切相關(guān)，可能是導(dǎo)致PE發(fā)生發(fā)展的原因之一。NETs作為治療靶點(diǎn)，可能成為治療PE的新方式，但該論點(diǎn)需后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。