長鏈非編碼RNA MicroRNA155宿主基因和微RNA-128-5p在慢性阻塞性肺疾病病人中的表達(dá)

李慧，趙亞光，陳奇，趙十妹，靳楊，李穎

作者單位：北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100026

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種常見的氣道疾病［1］，其特征是肺部炎癥反應(yīng)過度［2］。如果病情得不到及時(shí)控制，會(huì)出現(xiàn)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，這也是使COPD 成為全球發(fā)病率和死亡率升高的主要原因［3-5］。迄今為止，越來越多的證據(jù)表明微RNA（miR）在COPD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。其中，miR-218-5p 是miR-218 家族的成員，已被研究與各種人類惡性腫瘤有關(guān)。最近有證據(jù)表明miR-218-5p 參與了COPD 的發(fā)病機(jī)制，表明miR-218-5p在COPD 進(jìn)展中具有調(diào)節(jié)作用［6］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，可通過順式或反式調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)［7］。其中，MicroRNA155宿主基因（MIR155HG）是一種新鑒定的LncRNA，已發(fā)現(xiàn)MIR155HG 在多種癌癥（例如胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、喉鱗狀細(xì)胞癌）的進(jìn)展中作為癌基因發(fā)揮作用［8］。最近，Li 等［9］研究發(fā)現(xiàn)MIR155HG 通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10、IL-12 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)來調(diào)節(jié)COPD 的M1∕M2 巨噬細(xì)胞極化，表明MIR155HG可能參與了COPD 的發(fā)展。然而，MIR155HG 與miR-218-5p 在COPD 發(fā)病機(jī)制中的確切功能仍然難以捉摸。因此，本研究通過檢測COPD 病人血清中LncRNA MIR155HG、miR-128-5p的表達(dá)情況和二者相關(guān)性，探討了LncRNA MIR155HG、miR-128-5p 在COPD中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019 年5 月至2021 年5 月北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的COPD病人100例，其中急性加重期COPD 病人為A 組（n=52），穩(wěn)定期COPD病人為B組（n=48），選取同期來本院體檢且與病人一般資料匹配的健康人群50 例為C 組（n=50）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）COPD病人均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）吸入支氣管舒張劑后第一秒用力呼吸容積（FEV1）∕用力肺活量（FVC）＜70%；（3）臨床資料完整；（4）病人或其近親屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有免疫性疾病、糖尿病、腎病以及腦血管疾病的病人；（2）有哮喘、肺部感染、其他呼吸系統(tǒng)疾病、心力衰竭病史病人；（3）有肺結(jié)核、肺部腫瘤以及免疫系統(tǒng)功能缺陷病人；（4）有使用糖皮質(zhì)激素者。本研究經(jīng)北京市第一中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（批號(hào)20190420），參與本研究的所有參與者均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集所有研究對象空腹靜脈血5 mL，病人均在進(jìn)行臨床治療前采血送檢，健康人群于體檢當(dāng)日采集血液送檢。將血液標(biāo)本抗凝處理后，立即檢測血清TNF-α、超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CPR）、降鈣素原水平，并進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集并詳細(xì)記錄所有研究對象姓名、年齡等一般信息。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清中LncRNA MIR155HG、miR-218-5p 水平采用Trizol 試劑提取血清中總RNA。MIR155HG 的表達(dá)水平的檢測：使用PrimeScript RT-聚合酶（Takara，日本）從2 μg總RNA中逆轉(zhuǎn)互補(bǔ)DNA（cDNA）。然后，使用SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（Takara）在PRISM?7300 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行定量PCR。3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和U6 分別用作內(nèi)參基因，并通過2-ΔΔCt方法評估LncRNA MIR155HG、miR-218-5p相對表達(dá)水平。見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.3肺功能檢測 采用肺功能檢測儀（比特勒BTL-08 SPIRO，上海伊沐醫(yī)療器械有限公司）測定肺功能指標(biāo)—第一秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、FEV1∕FVC（FEV1∕FVC）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分方法采用SPSS 21.0 軟件。正態(tài)分布的連續(xù)變量以表示，多組之間采用單因素方差分析的方法，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)的方法；非正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)（第25、第75 百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson 法分析LncRNA MIR155HG 與miR-128-5p表達(dá)的相關(guān)性。利用受試者操作特征（ROC）曲線評價(jià)血清LncRNA MIR155HG 與miR-128-5p 水平對急性加重期COPD 病人的診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對象資料對比三組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；COPD 病人中有吸煙史人數(shù)明顯高于健康人群（P＜0.05）；COPD 病人血清中TNF-α、降鈣素原、hs-CRP 水平、白細(xì)胞均上升，其中A 組水平高于B 組，B 高于C 組（P＜0.05），肺功能指標(biāo)水平FEV1%、FEV1∕FVC均顯著低于健康對照組C組，且A組水平低于B組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組病人一般資料比較

2.2 三組血清中LncRNA MIR155HG 和miR-128-5p 水平比較COPD 病人血清中LncRNA MIR155HG 表達(dá)水平上調(diào)，加重期病人（A 組）高于穩(wěn)定期病人（B 組），穩(wěn)定期病人（B 組）水平高于健康人群（C 組），miR-128-5p 表達(dá)水平下調(diào)，且于A 組低于B組，B組水平低于C組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組病人血清中LncRNA MIR155HG和miR-128-5p水平比較∕

表3 三組病人血清中LncRNA MIR155HG和miR-128-5p水平比較∕

注：LncRNA MIR155HG 為長鏈非編碼RNA MicroRNA155 宿主基因，miR-128-5p為微RNA-128-5p。①與C組比較，P＜0.05。②與B組比較，P＜0.05。

2.3 COPD病人血清LncRNA MIR155HG和miR-128-5p 水平與炎性因子以及肺功能指標(biāo)的相關(guān)性COPD 病人血清中LncRNA MIR155HG 水平與TNFα、降鈣素原、hs-CRP、白細(xì)胞均呈正相關(guān)，與FEV1%、FEV1∕FVC 表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；miR-128-5p 水 平與FEV1%、FEV1∕FVC 均 呈正相關(guān)，與TNF-α、降鈣素原、hs-CRP、白細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 COPD 100例血清LncRNA MIR155HG和miR-128-5p水平與各指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 COPD 病人血清LncRNA MIR155HG、miR-128-5p 表達(dá)的相關(guān)性Pearson 法分析結(jié)果顯示，COPD 病人血清中LncRNA MIR155HG、miR-128-5p表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，（r=-0.49，P=＜0.001），見圖1。

圖1 慢性阻塞性肺疾?。–OPD）100例血清長鏈非編碼RNA MicroRNA155宿主基因（LncRNA MIR155HG）、微RNA（miR）-128-5p表達(dá)相關(guān)性分析

2.5 LncRNA MIR155HG、miR-128-5p 水平對急性加重期COPD 病人的診斷價(jià)值ROC 結(jié)果顯示，血清LncRNA MIR155HG、miR-128-5p 水平診斷急性加重期COPD 病人的曲線下面積（AUC）及其95%CI分別為0.94（0.87，0.98）、0.86（0.72，0.92），對應(yīng)的靈敏度分別為88.46%、82.69%，特異度分別為91.67%、85.42%，血 清LncRNA MIR155HG、miR-128-5p水平聯(lián)合診斷急性加重期COPD 病人的AUC及其95%CI為0.98（0.93，1.00），靈敏度為94.23%，特異度為95.83%。見圖2，表5。

表5 血清LncRNA MIR155HG和miR-128-5p水平判斷急性加重期COPD 52例的ROC曲線分析

圖2 血清LncRNA MIR155HG、miR-128-5p水平診斷急性加重期慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的ROC曲線

3 討論

3.1 COPD 的危害COPD目前是導(dǎo)致死亡的第四大病因，而且它的流行率正在迅速上升，世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2030年，它將成為第三大死因［10-11］。此病的肺部部分特點(diǎn)是氣流受限［12-13］，且不完全可逆，氣流受限通常是漸進(jìn)的，并與肺部對有毒顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)［14-15］。但是，該病的發(fā)生機(jī)制尚不明確，且對病人的身心健康造成嚴(yán)重威脅，將成為未來幾十年的主要健康挑戰(zhàn)之一［16］。因此尋找新的有效的分子標(biāo)志物對COPD 早期發(fā)現(xiàn)、病情進(jìn)展及治療方案的制定具有重要臨床意義。

3.2 結(jié)果分析已確定LncRNA 涉及各種生理和病理過程，并在各種人類疾病中失調(diào)。MIR155HG作為一種新鑒定的LncRNA，可調(diào)節(jié)針對病毒感染的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的多個(gè)信號(hào)通路［17］。李君莉、趙慧姝［18］研究表明肺結(jié)核病人外周血中LncRNA MIR155HG 表達(dá)較高，有助于評估病人病情。本研究發(fā)現(xiàn)COPD 病人血清中LncRNA MIR155HG 上調(diào)，其中加重期病人高于穩(wěn)定期病人，穩(wěn)定期病人水平血清LncRNA MIR155HG 水平高于健康人群，提示血清LncRNA MIR155HG與COPD病人病情進(jìn)展具有相關(guān)性，而COPD 病人血清中TNFα、降鈣素原、hs-CRP、白細(xì)胞均上升，其中加重期病人水平高于穩(wěn)定期病人，穩(wěn)定期病人高于健康人群；病人肺功能指標(biāo)-FEV1%、FEV1∕FVC 水平均顯著低于健康對照組，且加重期病人肺功能指標(biāo)水平低于穩(wěn)定期病人；血清中LncRNA MIR155HG 表達(dá)與TNF-α、降鈣素原、hs-CRP、白細(xì)胞呈正相關(guān)，與FEV1%、FEV1∕FVC 呈負(fù)相關(guān)，提示COPD 病人血清LncRNA MIR155HG 水平越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，肺功能越差，病人病情越嚴(yán)重；ROC 結(jié)果顯示，血清LncRNA MIR155HG 水平診斷急性加重期COPD 病人的AUC 及其95%CI為0.94（0.87，0.98），對應(yīng)的靈敏度為88.46%，特異度為91.67%，提示LncRNA MIR155HG 水平可在一定程度上評估急性加重期COPD 病人病情狀況，對評估病人病情，制定適宜的治療方案具有重要價(jià)值。

miRNAs 由18 到25 個(gè)核苷酸組 成，通 過與3'UTR 中的靶mRNA 結(jié)合來負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，廣泛存在于包括植物、動(dòng)物和病毒在內(nèi)的所有真核細(xì)胞中。最近，miRNA 在呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用得到了研究，包括COPD、特發(fā)性肺纖維化和肺癌［19-20］。其中，miR-218-5p 是miR-218 的一個(gè)亞型，在多種疾病，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、COPD 和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中均有報(bào)道［21］。本研究中加重期COPD 病人血清中miR-128-5p 水平高于穩(wěn)定期COPD 病人，且穩(wěn)定期COPD 病人高于健康人群，提示miR-128-5p 可能參與COPD 病人的病情發(fā)展，另外，COPD 病人血清miR-128-5p 水平與TNF-α、降鈣素原、hs-CRP、白細(xì)胞均呈負(fù)相關(guān)，與FEV1%、FEV1∕FVC 呈正相關(guān)，提示miR-128-5p 可能通過影響病人炎性因子水平和肺功能參與COPD 的發(fā)展進(jìn)程；通過Pearson 法分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR155HG 與miR-128-5p 表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示二者可能通過某種機(jī)制共同參與COPD 的發(fā)生發(fā)展；ROC 結(jié)果顯示，血清miR-128-5p 水平診斷急性加重期COPD 病人的AUC 及其95%CI為0.86（0.72，，0.92），靈敏度為82.69%，特異度為85.42%，血清LncRNA MIR155HG、miR-128-5p 水平聯(lián)合診斷急性加重期COPD 病人的AUC 及其95%CI為0.98（0.93，1.00），靈敏度為94.23%，特異度為95.83%。提示LncRNA MIR155HG和miR-128-5p二者聯(lián)合應(yīng)用于急性加重期COPD 病人病情評估的臨床價(jià)值優(yōu)于單一指標(biāo)。推測LncRNA MIR155HG 可能通過對miR-128-5p 的調(diào)控作用，影響病人的肺功能及炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步影響病人的病情發(fā)展。

綜上所述，LncRNA MIR155HG 在COPD 病人血清中呈高表達(dá)，miR-128-5p 呈低表達(dá)，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，提示二者可能通過某種機(jī)制參與調(diào)控COPD 的發(fā)生、發(fā)展，且可作為急性加重期COPD 診斷及評估的生物學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床意義。但本研究所取病例較少，結(jié)果可能有一定局限性，仍需在后期研究中，進(jìn)行深入探索。

（本文圖2見插圖6-10）