微RNA-125a-5p和維生素D受體微RNA在乙型肝炎病毒相關性肝癌中的表達及與預后的關系

李玉苓，鄒東花，高健

作者單位：1滄州市第三醫(yī)院，a中西醫(yī)結合肝病科，b檢驗科，河北 滄州 061000；2河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊050000

肝癌是全球男性第五大常見癌癥，女性第九大癌癥，同時也是癌癥死亡的第二大常見原因，其中肝細胞癌是最常見的肝癌類型［1-2］。全球約有3.5 億人感染乙型肝炎病毒（HBV），而HBV 感染是引起肝細胞癌的最主要原因；慢性HBV 感染期間機體免疫反應所引起的反復肝臟炎癥可導致肝纖維化和肝硬化，從而加速肝細胞更新，增加肝癌發(fā)生概率［3-5］。近年來，醫(yī)療水平不斷進步，肝癌的診療手段不斷完善，但肝癌病人術后復發(fā)率及死亡率仍較高［6］，探索可能影響病人預后的新靶點，將其轉化并應用于臨床，對改善肝癌病人預后有重大意義。

微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）是一種腫瘤抑制因子，在多種癌癥中下調［7-8］，研究發(fā)現，miR-125a-5p 在肝癌組織和細胞系中表達低于正常肝組織和肝細胞，過表達miR-125a-5p 可抑制肝癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡［9］。維生素D 受體（VDR）水平能夠影響腫瘤細胞的發(fā)展變化及轉歸，可調控腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡［10］，研究發(fā)現，肝癌組織中VDR mRNA 及蛋白水平均高于正常肝組織，VDR 可能參與肝癌疾病進展［11］。本研究致力探索miR-125a-5p及VDR水平對于HBV相關肝癌病人預后的影響，以期能夠找出新分子靶點，提高肝癌病人預后生存質量。

1 資料與方法

1.1 一般資料樣本量計算：利用PASS 15 軟件，雙側檢驗，設α=0.05，OR=2，power=90%，計算得到肝癌組織和癌旁組織各49 例，考慮可能有失訪人數，按20%算，肝癌組織、癌旁組織至少需要61 例。前瞻性隨機選取2014 年2 月至2016 年5 月在滄州市第三醫(yī)院接受手術治療的HBV 相關肝癌病人65例，男43 例，女22 例，年齡范圍29～67 歲，年 齡（46.32±9.47）歲，術中取病人肝癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣3 cm 以上）。本研究對象或其近親屬簽署知情同意書，且經滄州市第三醫(yī)院倫理委員會審核、批準后實施（批號20140105）。

納入標準：①確診肝癌前有HBV 感染史，血清乙型肝炎表面抗原陽性；②均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中相關標準［12］；③術前未接受過化、放療及激素治療等；④臨床資料齊全。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②感染其他型肝炎病毒者；③酒精性肝病、藥物性肝損傷者；④合并心血管疾病、自身免疫疾??；⑤隨訪過程中失訪者。

1.2 方法

1.2.1樣本采集 于術中收集HBV 相關肝癌病人的癌組織及癌旁組織，新鮮的肝組織立即置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）法檢測肝組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平 將肝組織研磨成組織勻漿，采用TRIzol試劑（德國默克公司，貨號MFCD00213058）提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒（德國Qiagen 公司，貨號205110）將RNA 逆轉錄為互補DNA，并以所得互補DNA 為模板，在Taq DNA 聚合酶作用下進行qRT-PCR 反應。miR-125a-5p 反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；VDR mRNA 反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。miR-125a-5p、VDR mRNA 及相應內參U6、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物序列見表1。

表1 miR-125a-5p、VDR mRNA及相應內參U6、GAPDH的引物序列

采 用2-ΔΔCt法計算miR-125a-5p、VDR mRNA水平。

1.2.3靶向關系預測 使用TargetScan 數據庫（http：∕∕www.targetscan.org∕vert_72∕），預測miR-125a-5p與VDR的結合位點。

1.3 隨訪對所有HBV 相關肝癌病人于手術結束當天開始進行隨訪，采取門診、電話或微信等方式，隨訪結束日期為病人死亡日期或至2021 年5 月31日。

1.4 統(tǒng)計學方法數據采用SPSS 21.0 處理。計量資料均服從正態(tài)分布，如miR-125a-5p、VDR mRNA水平等以描述，采用配對樣本或獨立樣本t檢驗；以例（%）描述計數資料，行χ2檢驗；Pearson 法分析肝癌組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相關性；Kaplan-Meier 法繪制HBV 相關肝癌病人生存曲線，行Log-rank 檢 驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同肝組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比較肝癌組織miR-125a-5p 水平低于癌旁組織（P＜0.05），VDR mRNA水平高于癌旁組織（P＜0.05）。見表2。

表2 不同肝組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA水平比較∕

表2 不同肝組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA水平比較∕

2.2 miR-125a-5p、VDR mRNA 水平與HBV 相關肝癌病人臨床病理特征的關系不同年齡、性別、腫瘤長徑的HBV 相關肝癌病人miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；門靜脈侵襲、淋巴結轉移、中高分化及TNM 分期Ⅲ期病人miR-125a-5p水平低于門靜脈無侵襲、淋巴結未轉移、低分化及TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05），VDR mRNA水平高于門靜脈無侵襲、淋巴結未轉移、低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平與HBV相關肝癌病人臨床病理特征的關系∕

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平與HBV相關肝癌病人臨床病理特征的關系∕

注：miR-125a-5p為微RNA-125a-5p，VDR為維生素D受體，HBV為乙型肝炎病毒。

2.3 肝癌組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相關性分析經TargetScan 數據庫預測，miR-125a-5p與VDR存在相應的結合位點，見圖1。

圖1 微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）與維生素D受體（VDR）靶向關系預測

HBV 相關肝癌病人肝癌組織中miR-125a-5p 與VDR mRNA呈負相關（r=-0.44，P＜0.001），見圖2。

圖2 乙型肝炎病毒（HBV）相關肝癌病人肝癌組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）與維生素D受體（VDR）mRNA的相關性分析

2.4 miR-125a-5p、VDR mRNA 表達與HBV 相關肝癌病人生存率的關系分別以miR-125a-5p、VDR mRNA 中位數（0.67、1.71）為界將病人分為miR-125a-5p 高表達組（32 例）、低表達組（33 例），VDR mRNA 高表達組（32 例）、低表達組mRNA（33例）。65例HBV 相關肝癌病人5年生存率為52.31%（34∕65），其中miR-125a-5p 高表達組5 年生存率為65.63%（21∕32），miR-125a-5p 低表達組為39.39%（13∕33），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.39，P=0.036），見圖3。VDR mRNA 高表達組5 年生存率為37.50%（12∕32），VDR mRNA低表達組為66.67%（22∕33），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.48，P=0.011），見圖4，5。

圖3 乙型肝炎病毒相關性肝癌65例中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）高表達組和低表達組的生存曲線

圖4 乙型肝炎病毒相關性肝癌65例中維生素D受體（VDR）mRNA高表達組和低表達組的生存曲線

將miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 低表達定義為A 組，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 高表達定義為B 組，miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 高表達定義為C 組，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 低表達為D 組，A 組、B 組、C 組、D 組5年生存率分別為69.57%、23.81%、63.64%、60.00%，四組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.96，P=0.008），見圖6。

圖5 乙型肝炎病毒相關性肝癌65例中不同時間點miR-125a-5p、VDR mRNA高低表達組人數

圖6 乙型肝炎病毒相關性肝癌65例中不同微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA表達病人的生存曲線

3 討論

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢［13］。盡管肝癌的致病原因不同，但幾乎50% 的肝癌與HBV 感染有關［14-15］。研究表明，HBV X 蛋白是一種多功能調節(jié)蛋白，可通過調節(jié)細胞因子參與轉錄激活、表觀遺傳調控、病毒復制和DNA 修復等過程，從而在肝細胞癌變中發(fā)揮關鍵作用［16-17］。HBV 相關性肝癌發(fā)病機制復雜，臨床上尚無特效藥物［18］，探尋HBV 相關性肝癌的發(fā)病機制，尋找相關生物標志物，對該病的診治有重要意義。

miR-125a-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，其通過調節(jié)細胞增殖、遷移、轉移、侵襲、凋亡參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［19-20］。研究發(fā)現，卵巢癌細胞株中miR-125a-5p 水平低于正常卵巢細胞，過表達miR-125a-5p 可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，miR-125a-5p 可能通過下調ras 癌基因家族成員Rab3D 表達從而抑制卵巢癌的疾病進展［21］。此外，miR-125a-5p在腎癌組織和細胞中表達下降，其可通過靶向信號轉導和轉錄激活因子3 調控細胞凋亡相關蛋白表達，從而促進腎癌細胞株A498 的凋亡［22］。有關miR-125a-5p 在肝癌中的研究逐漸增加，研究表明，在肝細胞癌中，miR-125a-5p 可通過靶向造血底物1 相關蛋白并同時調節(jié)抑癌基因p53、血管內皮生長因子及上皮間質轉化相關標志物的表達來抑制肝癌生長［23］。Li 等［24］研究發(fā)現，miR-125a-5p 在HBV 相關肝細胞癌中明顯下調，miR-125a-5p過表達可顯著抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，并降低乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原的分泌。本研究結果與上述結果一致，miR-125a-5p 在HBV 相關肝癌病人組織中表達水平低于癌旁組織，提示miR-125a-5p 表達受抑制，其調節(jié)的相關腫瘤基因表達升高，從而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。且miR-125a-5p 水平與病人門靜脈侵襲、淋巴結轉移、分化程度及TNM 分期有關，提示miR-125a-5p 水平可能對于預測病人疾病嚴重程度有一定的作用。

近年來研究發(fā)現，維生素D與惡性腫瘤的增殖、分化相關，具有抗腫瘤作用，而維生素D 必須通過VDR 發(fā)揮作用，維生素D 可上調多種細胞、組織中的VDR 蛋白水平，但其對VDR mRNA 水平的調節(jié)較為復雜，存在組織細胞特異性［25-27］。VDR 為類固醇激素∕甲狀腺激素受體超家族的一員，在機體中廣泛分布，VDR 可誘導基因調控和細胞信號傳導，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和自噬、調控免疫系統(tǒng)等，從而參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［28-29］。研究發(fā)現，肝細胞癌病人癌組織VDR mRNA 水平高于癌旁組織，提示VDR 與肝細胞癌密切相關［30］。上述結果與本研究結果基本一致，且本研究還發(fā)現，VDR mRNA 水平與HBV 相關肝癌病人的門靜脈侵襲、淋巴結轉移、分化程度及TNM 分期有關，提示VDR mRNA 表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。此外，有研究表明，miR-125a-5p 與VDR 存在靶向關系，miR-125a-5p 過表達可抑制阿司咪唑誘導的VDR 增加和增強維生素D 的抗腫瘤作用［31］。本研究經TargetScan 數據庫預測，發(fā)現miR-125a-5p 與VDR 存在相應的結合位點，且相關性分析顯示，HBV 相關肝癌病人miR-125a-5p 與VDR mRNA 呈負相關，提示二者可能相互作用，共同影響肝癌的疾病進展。本研究對miR-125a-5p 和VDR mRNA 與肝癌病人生存率的關系進行了探討，結果顯示miR-125a-5p 高表達組5 年生存率高于miR-125a-5p 低表達組，VDR mRNA 高表達組5年生存率低于VDR mRNA 低表達組，miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 低表達病人5年生存率最低，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 高表達病人5 年生存率最高，提示miR-125a-5p 與VDR mRNA 表達變化與HBV 相關肝癌病人預后有一定關系，監(jiān)測miR-125a-5p 與VDR mRNA 水平可能有助于預測肝癌病人預后狀況，從而能夠早期介入治療，改善病人預后。

綜上所述，HBV 相關肝癌病人肝癌組織中miR-125a-5p 表達降低，VDR mRNA 水平增加，二者與病人臨床病理特征有關，監(jiān)測miR-125a-5p 與VDR mRNA水平對于預后評估有一定價值。

（本文圖3～6見插圖6-9）