血清微RNA-429、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6與肝癌肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)靈敏度相關(guān)性及槐耳顆粒干預(yù)作用研究

崔明新，劉曉剛，程大銘，于敬坤，曲鳳智

作者單位：唐山市工人醫(yī)院肝膽外二科，河北 唐山063000

肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）是不能行根治手術(shù)肝癌病人的一種重要療法，但受肝硬化程度、肝功能狀態(tài)、腫瘤負(fù)荷等因素影響，并非所有病人均能達(dá)到理想效果，因此早期預(yù)測(cè)肝癌TACE 靈敏度，采取一定措施增加靈敏度較差病人治療反應(yīng)性，對(duì)促進(jìn)緩解意義重大［1］。微RNA-429（miR-429）與被證實(shí)肝癌、胃癌等多種腫瘤有關(guān)［2］。根據(jù)既往報(bào)道，miR-429能通過(guò)靶向鈣敏感受體∕信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3通路，增強(qiáng)卵巢癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖和化療耐藥性［3-4］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）是TOLL 樣受體4下游物質(zhì)，在肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，沉默TRAF6 可拮抗核因子κB 信號(hào)傳導(dǎo)，減輕化療抗性［5］?？梢?jiàn)miR-429、TRAF6均與化療靈敏度有關(guān)?；倍w粒是肝癌等腫瘤不宜手術(shù)者與化療者輔助用藥，具有扶正固本，活血消癥作用，應(yīng)用于乳腺癌病人，可降低其化療耐藥［6］?；谝陨媳尘埃狙芯繃L試探討血清miR-429、TRAF6 與肝癌TACE 靈敏度相關(guān)性及槐耳顆粒干預(yù)作用，旨在為臨床早期預(yù)測(cè)肝癌TACE 靈敏度、治療肝癌及深入認(rèn)識(shí)其不同治療反應(yīng)性機(jī)制等提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年1 月至2021 年1 月唐山市工人醫(yī)院收治的80 例肝癌病人作為研究對(duì)象進(jìn)行前瞻性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，臨床分期難以手術(shù)治療或因身體原因不能、不愿手術(shù)治療者；②年齡范圍18～80歲；③入組前未接受過(guò)外科手術(shù)或化療、免疫治療、靶向治療等相關(guān)抗癌治療；④巴塞羅那分期（BCLC）分期為A 期、B期或C期，但門(mén)脈主干癌栓的BCLC分期C期病人不入選；⑤Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)或B 級(jí)；⑥美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）體力狀態(tài)評(píng)分≤2 分；⑦預(yù)計(jì)生存期≥12 周；⑧中醫(yī)辨證為正氣虛弱、瘀血阻滯型，癥見(jiàn)神疲乏力、少氣懶言、脘腹疼痛或脹悶、納谷少馨、大便干結(jié)或溏泄，脈澀，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、腎功能?chē)?yán)重不全者；②伴血液系統(tǒng)疾病者；③有相關(guān)藥物過(guò)敏史者；④過(guò)敏體質(zhì)者；⑤無(wú)法進(jìn)行正常溝通交流者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①符合納入標(biāo)準(zhǔn)，入選后退出的；②受試者依從性差，未按規(guī)定診療進(jìn)行者。

采用電腦隨機(jī)數(shù)字表法，按照隨機(jī)、平行、對(duì)照原則分為對(duì)照組和觀察組，各40例。其中觀察組女18 例，男22 例；年齡范圍35～76 歲，年齡（54.25±9.57）歲；體質(zhì)量指數(shù)范圍19～26 kg∕m2，體質(zhì)量指數(shù)（23.76±1.05）kg∕m2；BCLC 分期A 期5 例，B 期14 例，C 期21 例；Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)17 例，B 級(jí)23 例；ECOG 評(píng)分0 分8 例，1 分21 例，2 分11 例；對(duì)照組女21 例，男19 例；年齡范圍34～75 歲，年齡（52.98±9.33）歲；體質(zhì)量指數(shù)范圍19～26 kg∕m2，體質(zhì)量指數(shù)（23.90±0.97）kg∕m2；BCLC 分期A 期7 例，B 期15 例，C 期18 例；Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)20 例，B 級(jí)20 例；ECOG評(píng)分0分10例，1分24例，2分6例。兩組性別（χ2=0.45，P=0.502）、年齡（t=0.60，P=0.550）、體質(zhì)量指 數(shù)（t=0.62，P=0.537）、BCLC 分 期（χ2=0.60，P=0.741）、Child-Pugh 分級(jí)（χ2=0.45，P=0.501）、ECOG評(píng)分（χ2=1.89，P=0.388）均衡可比。本研究獲唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)［批號(hào)2016-（019）］，病人充分知曉，自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1治療方法 兩組均給予TACE 治療。對(duì)照組術(shù)后1 d 起口服甲苯磺酸索拉非尼片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20213311，批次20151026），每次0.4 g，2 次∕日，空腹吞服。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上，于術(shù)前1個(gè)月及術(shù)后3 d開(kāi)始口服槐耳顆粒（啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z20000109，批次20160104），每次20 g，3 次∕日。術(shù)后3個(gè)月評(píng)估療效。

1.2.2療效與治療靈敏度評(píng)估 參考改良實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1［8］，將療效分為完全緩解（所有靶病灶消失）、部分緩解（以基線(xiàn)直徑總和為參照，靶病灶直徑總和降低≥30%）、穩(wěn)定（以研究中直徑總和最小值為參照，縮小程度與部分緩解不符合，增大程度不符合疾病進(jìn)展）、進(jìn)展（以研究中直徑總和的最小值為參照，靶病變直徑總和增加≥20%，直徑總和絕對(duì)增長(zhǎng)≥5 mm 或出現(xiàn)≥1 處新病灶），在治療前后分別行CT 掃描，按照以上標(biāo)準(zhǔn)對(duì)療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，總有效率取完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定之和；治療靈敏度評(píng)估：完全緩解=敏感，部分緩解=一般，穩(wěn)定和進(jìn)展=較差。

1.2.3血清miR-429、TRAF6蛋白檢測(cè) 于治療前、術(shù)后1 個(gè)月、術(shù)后3 個(gè)月，分別采集空腹外周靜脈血5 mL，12 000g離心10 min，分離血清，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)血清miR-429 水平；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRAF6蛋白表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)（1）比較兩組總有效率。（2）比較兩組血清miR-429、TRAF6 蛋白。（3）治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關(guān)系。（4）不同靈敏度病人治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化比較。（5）血清miR-429、TRAF6蛋白術(shù)后1個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感的價(jià)值。（6）分析治療前血清miR-429與TRAF6蛋白關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采取Bartlett方差齊性檢驗(yàn)與Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)性檢驗(yàn)，均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布，以表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以L(fǎng)SD-t檢驗(yàn)，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較行配對(duì)t檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)、組別交互作用下血清miR-429、TRAF6 蛋白，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析；應(yīng)用Spearman 分析治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關(guān)系，采用受試者操作特征（ROC）曲線(xiàn)及曲線(xiàn)下面積（AUC）分析血清miR-429、TRAF6 蛋白治療前后變化預(yù)測(cè)治療敏感的價(jià)值，Pearson 分析血清miR-429 與TRAF6 蛋白關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較觀察組總有效率為95.00%，高于對(duì)照組80.00%（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 肝癌80例療效比較∕例（%）

2.2 兩組血清miR-429、TRAF6 蛋白比較術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后3 個(gè)月兩組血清miR-429 較治療前升高，TRAF6 蛋白較治療前降低（P＜0.05）；且觀察組血清miR-429 高于對(duì)照組，TRAF6 蛋白低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比較∕

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，β-actin為β肌動(dòng)蛋白。

2.3 治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化與靈敏度關(guān)系觀察組血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值、術(shù)后3 個(gè)月與治療前差值大于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3；分析血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關(guān)系，結(jié)果顯示，血清miR-429（r=0.78、0.76，均P＜0.001）、TRAF6 蛋白（r=0.74、0.72，均P＜0.001）術(shù)后1個(gè)月與治療前差值、術(shù)后3 個(gè)月與治療前差值與靈敏度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖1（完全緩解=3，部分緩解=2，穩(wěn)定和進(jìn)展=1）。

圖1 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）蛋白術(shù)后與術(shù)前差值變化與靈敏度關(guān)系：A為血清miR-429術(shù)后1個(gè)月；B為血清miR-429術(shù)后3個(gè)月；C為T(mén)RAF6蛋白術(shù)后1個(gè)月；D為T(mén)RAF6蛋白術(shù)后3個(gè)月

表3 肝癌80例治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

表3 肝癌80例治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，β-actin為β肌動(dòng)蛋白，差值均指絕對(duì)值。

2.4 不同靈敏度病人治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化比較血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值、術(shù)后3 個(gè)月與治療前差值：敏感＞一般＞較差，兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 肝癌80例不同靈敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

表4 肝癌80例不同靈敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，β-actin為β肌動(dòng)蛋白。①與敏感比較，P＜0.05。②與一般比較，P＜0.05

2.5 血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感的ROC以敏感者血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值作為陽(yáng)性樣本，以一般+較差者血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值作為陰性樣本，繪制ROC 顯示，血清miR-429 術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感 的AUC 及 其95%CI為0.78（0.51，1.00）（P=0.023），TRAF6蛋白術(shù)后1個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感的AUC及其95%CI為0.74（0.50，0.98）（P=0.044），見(jiàn)圖2。

圖2 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）蛋白術(shù)后1個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感的ROC曲線(xiàn)：2A為血清miR-429；2B為T(mén)RAF6蛋白圖3 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）蛋白關(guān)系

2.6 治療前血清miR-429 與TRAF6 蛋白關(guān)系治療前血清miR-429 與TRAF6 蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.70，P＜0.001），見(jiàn)圖3。

3 討論

近年來(lái)肝癌中西醫(yī)結(jié)合微創(chuàng)診療模式被提出，其立足于中醫(yī)辨證施治療的整體治療優(yōu)勢(shì)和腫瘤微創(chuàng)介入局部治療特點(diǎn)，使BCLC A 期達(dá)到與開(kāi)放性手術(shù)相同的根治性效果，使以往開(kāi)放性手術(shù)不能治療的BCLC B∕C期肝癌亦獲得滿(mǎn)意效果，將肝癌治療帶入人文診療新模式［9］。但中醫(yī)藥種類(lèi)繁多，選取何種藥物能獲得預(yù)期效果值得探討。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，正氣虛弱，邪氣乘襲，蘊(yùn)結(jié)于肝，氣滯血瘀，形成痞塊，乃至肝癌，因此宜治以扶正固本，活血消癥。本研究對(duì)肝癌病人應(yīng)用具有扶正固本，活血消癥功效的槐耳顆粒，結(jié)果顯示，觀察組總有效率高于對(duì)照組，提示槐耳顆粒能增強(qiáng)肝癌TACE 療效，增加病人獲益。王海瑞、劉兆玉［10］研究發(fā)現(xiàn)，在TACE 基礎(chǔ)上聯(lián)合槐耳顆粒，可提高TACE療效，延長(zhǎng)中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間，本研究觀點(diǎn)與之一致?；倍w粒富含生物堿、蛋白質(zhì)、多糖蛋白等成分，可抑制腫瘤活性，提高免疫力，抑制肝炎病毒，并能改善肝區(qū)疼痛、腹脹、乏力等癥狀，可見(jiàn)槐耳顆粒不僅對(duì)肝癌細(xì)胞具有直接抑制作用，還能通過(guò)抑制肝炎病毒復(fù)制、增強(qiáng)體質(zhì)等途徑，間接發(fā)揮抗腫瘤功效。中醫(yī)扶正祛邪提升機(jī)體免疫功能，重塑不宜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，抑制影像學(xué)不可見(jiàn)的微小腫瘤，將中醫(yī)藥微環(huán)境調(diào)理與肝癌TACE 相結(jié)合作為特色，充分發(fā)揮TACE 局部治療與中醫(yī)藥整體治療優(yōu)勢(shì)，所以能增加治療靈敏度，提高療效。

miR-429 是微小RNA 家族成員之一，敲低miR-429 可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲性，使用模擬物上調(diào)miR-429表達(dá)可加重肝癌進(jìn)展，提示miR-429與肝癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)，呈現(xiàn)出促癌因子作用［11-12］。本研究顯示，血清miR-429 術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值、術(shù)后3個(gè)月與治療前差值與靈敏度呈正相關(guān)，治療后升高幅度越大者，治療靈敏度越高，有助于預(yù)測(cè)病人治療靈敏度。且兩組術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月血清miR-429較治療前升高，且觀察組血清miR-429高于對(duì)照組，提示槐耳顆粒能提高miR-429表達(dá)，有助于改善肝癌TACE 靈敏度。結(jié)合資料［13］分析，miR-429 過(guò)表達(dá)能通過(guò)靶向雙特異性磷酸酶4 抑制JNK信號(hào)通路來(lái)提高癌細(xì)胞對(duì)化療的靈敏度。也有觀點(diǎn)［14］認(rèn)為，miR-429 過(guò)表達(dá)是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移發(fā)揮抑癌作用，從而提高治療反應(yīng)性的。

TRAF6 可調(diào)控免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡等［15］。本研究顯示，不同治療靈敏度病人TRAF6 蛋白表達(dá)不同，治療后降低幅度越大者，治療靈敏度越高，提示TRAF6蛋白與肝癌TACE靈敏度有關(guān)。且兩組術(shù)后1 個(gè)月、術(shù)后3 個(gè)月TRAF6 蛋白較治療前降低，觀察組低于對(duì)照組，提示槐耳顆?？山档蚑RAF6 蛋白水平，有助于增加病人治療靈敏度。謝正元等［16］研究發(fā)現(xiàn)，槐耳顆粒能抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，減少并逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，提高治療靈敏度，本研究觀點(diǎn)與之相似。治療前較高的TRAF6 可通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路，抑制肝癌細(xì)胞凋亡，增加TACE 治療的抗性，降低病人治療靈敏度，治療后TRAF6 下調(diào)則能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并能阻止核因子-κB 信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而改善治療靈敏度［17-18］。

同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-429、TRAF6 蛋白術(shù)后1 個(gè)月與治療前差值預(yù)測(cè)敏感的AUC 分別為0.78、0.74，提示兩者可作為早期預(yù)測(cè)肝癌TACE 靈敏度的標(biāo)志物，為臨床精準(zhǔn)干預(yù)提供客觀參考依據(jù)。此外治療前血清miR-429與TRAF6蛋白呈負(fù)相關(guān)，表明血清miR-429與TRAF6蛋白有關(guān)，呈現(xiàn)出負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Wang 等［19］報(bào)道，上調(diào)miR-429 通過(guò)核因子-κB 通路靶向TRAF6 來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的遷移，佐證了miR-429 與TRAF6 具有上下游靶向作用關(guān)系?？梢?jiàn)miR-429∕TRAF6 或可成為改善肝癌TACE靈敏度的一個(gè)靶點(diǎn)。

綜上所述，血清miR-429、TRAF6 與肝癌TACE靈敏度相關(guān)，槐耳顆?？商岣適iR-429 表達(dá)，降低TRAF6蛋白，增強(qiáng)肝癌TACE靈敏度，提高療效。