高效液相色譜多波長切換法同時測定更年寧中7種有效成分的含量

霍甜甜，李宜鮮，徐金玲，李彥超，申二永

作者單位：河南省藥品醫(yī)療器械檢驗院（河南省疫苗批簽中心），河南 鄭州450009

更年寧是由柴胡、黃芩、白芍、牡丹皮、女貞子（酒炙）等22味中藥組成，臨床主要用于緩解和治療更年期綜合征［1］。方中白芍、酒女貞子、丹皮、黃芩皆為制劑中的臣藥，白芍可養(yǎng)血斂陰、止汗、平抑肝陽；酒女貞子可滋肝益腎、有烏須、明目之功效；牡丹皮可清熱涼血、活血化瘀；黃芩可清熱燥濕兼瀉火解毒。上四味合用，既可以滋陰養(yǎng)血平抑肝陽，又可解方中補益藥之熱。上述四味臣藥中的七種活性成分及藥理作用主要為：白芍中的芍藥苷具有抗抑郁、消炎、鎮(zhèn)痛、保護肝臟、保護神經(jīng)、鎮(zhèn)靜催眠、免疫調(diào)節(jié)等作用［2-3］；酒女貞子中的特女貞苷具有保肝利膽、降血糖血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-5］；牡丹皮中的丹皮酚可以消炎、同時具有保護神經(jīng)、心血管、肝損傷等作用［6-8］；黃芩中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗菌消炎、抗抑郁、抗氧化［9-12］等作用。

更年寧現(xiàn)行標準——《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》第六冊中，只規(guī)定了顯微鑒別和墨旱蓮的鑒別［13］，指標成分單一，且方中多味主藥的質(zhì)量均未得到有效控制。多指標成分測定能更好的從整體上控制中成藥的內(nèi)在質(zhì)量［14-16］，本研究2021 年6 月至2022 年2 月完成，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時更年寧中芍藥苷、特女貞苷、丹皮酚、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素7 種活性成分，從而可以更加全面地控制更年寧的內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器安捷倫1260 高效液相色譜儀，配備1260 二極管陣列檢測器（DAD）（美國安捷倫科技公司）；艾杰爾維納斯一代（Agela Venusil MP）C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；XP105 電子天平（瑞士Mettler 公司）；水浴鍋XMTD-204（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；密理博超純水系統(tǒng)（德國密理博公司）。

1.2 試藥對照品芍藥苷（批號110736～201943，含量96.8%）、特女貞苷（批號111926～201906，含量95.0%）、黃芩苷（批號110715～201821，含量95.4%）、漢黃芩苷（批號112002～201501，含量98.8%）、丹皮酚（批號100708～200506，含量99.9%）、黃芩素（批號111595～201306，含量97.8%）、漢黃芩素（批號111514～201706，含量100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；市售更年寧水蜜丸（吉林玉仁制藥股份有限公司，規(guī)格為4克∕袋，批號200201、200411；北京同仁堂，規(guī)格100粒∕10 克，批號18032338）；乙腈和甲醇均為色譜純（德國Merck公司）；水由密理博超純水系統(tǒng)制備。

1.3 方法

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A），0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序［17］（0～5 min 15% A；＞5～25 min 15%～25% A；＞25～50 min 25%～60% A）；流速：1.0 mL∕min；檢測波長：0～14 min，232 nm（芍藥苷）；14～25 min，226 nm（特女貞苷）；25～50 min，276 nm（黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素）；色譜柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2溶液制備

1.3.2.1對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，加80%甲醇使溶解，配制成質(zhì)量濃度依次為1 039.63、684.00、965.45、190.49、554.64、193.64、361.00 mg∕L 的單標溶液。分別取各單標溶液適量，置于同一容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成各組分濃度依次為103.96、136.80、241.36、38.10、55.46、19.36、7.22 mg∕L 的混合對照品溶液1。分別精密移取2 mL、1 mL、0.5 mL、0.3 mL 的混合對照品溶液1，置于5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液2、3、4、5，備用。

1.3.2.2供試品溶液 取供試品適量，研細，稱取0.5 g（精確到0.001 g），置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞搖散后稱定重量，加熱回流提取1 h，放至室溫后再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得［17］。

1.3.2.3陰性樣品溶液 按更年寧藥材配比和加工處理方法，分別制備缺白芍、酒女貞子、牡丹皮、黃芩和同時缺4 種藥材的陰性樣品溶液，按“1.3.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液，即得。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1專屬性考察 取“1.3.2”項下混合對照品溶液3、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果各成分色譜峰峰型對稱，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于8 000。在混合對照品色譜峰相應(yīng)的保留時間處，陰性樣品溶液沒有對應(yīng)的色譜峰，說明其他成分對目標峰的測定無干擾，表明該方法專屬性良好［17］。

圖1 混合對照品、更年寧供試品及各陰性樣品色譜圖：A為混合對照品；B為更年寧樣品；C為缺白芍陰性樣品；D為缺酒女貞子陰性樣品；E為缺牡丹皮陰性樣品；F為缺黃芩陰性樣品；G為缺4種藥材陰性樣品

2.1.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.3.2.1”項下的混合對照品溶液1、2、3、4、5，按“1.3.1”項下色譜條件分別進樣，記錄各色譜峰峰面積，分別以各成分的濃度和峰面積為橫坐標和縱坐標（Y），繪制各成分標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果表明，7 種成分在實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取混合對照溶液，用80%甲醇進行稀釋，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限及檢出限，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.3精密度試驗 取“1.3.2.1”項下混合對照品溶液3，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各成分色譜峰的峰面積，結(jié)果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.25%、0.72%、0.41%、0.88%、1.14%、1.01%、0.53%，表明儀器精密度良好。

2.1.4重復(fù)性試驗 取更年寧供試品（200201），按“1.3.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進樣測定，結(jié)果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素含量的平均值分別為1.443、1.959、2.171、0.621、0.767、0.222、0.090 mg∕g，RSD 分別為2.33%、1.74%、1.29%、0.93%、2.84%、2.05%、2.11%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5穩(wěn)定性試驗 取更年寧供試品（200201），按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，結(jié)果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為0.73%、0.98%、0.52%、1.04%、0.89%、1.14%、1.66%，結(jié)果表明在24 h內(nèi)，該供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.1.6加樣回收率試驗 精密稱取更年寧供試品（200201）0.25 g 6 份，每組分別加入“1.3.2.1”項下的芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素單標溶液0.35、0.7、0.5、0.8、0.35、0.3、0.07 mL，加入80%甲醇至25 mL，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進樣分析，計算各成分加樣回收率及RSD 值。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該方法準確度良好。

表2 加樣回收率試驗表（n=6）

2.2 樣品含量測定取4 個不同批次的更年寧樣品，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量結(jié)果∕（mg∕g）

3 討論

柴胡疏肝解郁，為更年寧組方中的君藥，皂苷是柴胡中的主要生物活性成分［18］，《中國藥典》（2020 年版）采用HPLC 法測定柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d［19］，從而控制柴胡中的皂苷含量。在提取柴胡中皂苷時建議低溫、堿性環(huán)境下提取［20］，但在該提取條件下，更年寧組方中其他活性成分提取率不高，因此本研究未將柴胡皂苷納入待測組分當中。在后期工作中，實驗室會進一步研究更年寧組方中柴胡的質(zhì)量控制方法，以期更好的控制該制劑的質(zhì)量。表3顯示，不同生產(chǎn)廠家，同一生產(chǎn)廠家的不同批次樣品之間，各成分含有量均存在一定差異，可能與原藥材產(chǎn)地、種植過程、采收季節(jié)、儲藏，飲片炮制差異及生產(chǎn)過程中各參數(shù)的控制等有關(guān)［21-23］。建議藥品生產(chǎn)企業(yè)進一步加強對飲片來源和制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制，同時藥品監(jiān)管部門進一步完善更年寧的質(zhì)量控制標準，以確保更年寧制劑質(zhì)量穩(wěn)定，療效一致。

本研究采用HPLC-DAD 法同時測定更年寧中芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素的含有量，該方法各被測化合物色譜峰峰型對稱，檢測準確、可靠、靈敏度高，獲得了滿意的分離和測定結(jié)果。本方法能夠有效的控制成藥組方中多種飲片的質(zhì)量，從而達到保證藥效的目的，為更年寧的進一步質(zhì)量研究提供了依據(jù)。