基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討大黃治療急性胰腺炎的可能分子機(jī)制

吳波，袁麗萍，朱德發(fā)

作者單位：1中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）急診醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230001；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，a兒科，b老年內(nèi)分泌科，安徽 合肥230022

急性胰腺炎的西醫(yī)治療手段包括藥物和手術(shù)治療，其中藥物治療以抑制胰酶、維持循環(huán)和內(nèi)環(huán)境、預(yù)防感染等為主。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥可以提高對(duì)該病治療的有效率、改善病人的臨床癥狀、降低并發(fā)癥的發(fā)生［1-2］。其中治療該病常用的中藥主要有大黃、芒硝等，但是其作用機(jī)制尚未明確。

因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可廣泛應(yīng)用于中藥活性化合物發(fā)掘、整體作用機(jī)制闡釋等方面［3］；分子對(duì)接技術(shù)可將化合物配體與蛋白受體模擬結(jié)合，預(yù)測(cè)其作用模式及結(jié)合能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物的篩選與設(shè)計(jì)［4-5］。所以，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子模擬對(duì)接技術(shù)，探討中藥大黃在急性胰腺炎治療中產(chǎn)生作用的有效成分和可能的分子作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 檢索大黃活性成分和藥物靶標(biāo)2021 年10 月至2022 年2 月，以“大黃”為檢索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：∕∕old.tcmsp-e.com∕）檢索，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為切點(diǎn)篩選有效成分［3，6］。隨后在該平臺(tái)汲取有效成分相映射的基因靶標(biāo)，通過(guò)比對(duì)Universal Protein 平臺(tái)數(shù) 據(jù)（https：∕∕www.uniprot.org∕），得到靶標(biāo)基因簡(jiǎn)稱。

1.2 檢索疾病靶標(biāo)從Genecards（https：∕∕www.genecards.org∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）、OMIM（https：∕∕www.omim.org∕）、pharmGKB（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Acute pancreatitis”為檢索詞檢索。

1.3 獲取大黃-急性胰腺炎交集靶標(biāo)通過(guò)上述步驟得到藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)取交集，繪制可視化的韋恩（Venn）圖。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶標(biāo)的獲取于String（https：∕∕string-db.org∕）平臺(tái)中，導(dǎo)入交集靶標(biāo)，物種選擇人類(lèi)，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。然后通過(guò)Cytoscape（3.8.2 版）插件CytoNCA 進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的度中心性（DC）、接近中心性（CC）、介數(shù)中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、局部連通性（LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC），找出關(guān)鍵靶標(biāo)［7］。

1.5 藥物成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Cytoscape 程序中輸入前面得到的藥物成分及交集靶標(biāo)，構(gòu)建“大黃活性成分-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，并剔除孤項(xiàng)，后選擇插件CytoNCA 計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值，找出關(guān)鍵有效成分。

1.6 基因富集分析及可視化交集基因本位（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，通過(guò)R 軟件“Annotation-Hub”“ggplot2”數(shù)據(jù)包運(yùn)行并可視化。

1.7 分子對(duì)接及可視化從PubChem 平臺(tái)（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）檢索下載大黃成分的2D結(jié)構(gòu)文件。運(yùn)用ChemOffice2014 處理后導(dǎo)出3D 結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)平臺(tái)（http：∕∕www.rcsb.org）獲取關(guān)鍵蛋白HSP90AA1（PDB ID 5J27）、caspase-3（PDB ID 1CP3）、CASP8（PDB ID 1F9E）、PTGS2（PDB ID 5F19）的3D 結(jié)構(gòu)文件，利用Pymol 軟件對(duì)3D 結(jié)構(gòu)去水分子等處理。再用Autodock Tools 4.0 軟件中“add hydrogen”命令對(duì)3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫處理。以Autodock Vina將處理后的藥物3D結(jié)構(gòu)與蛋白3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子模擬對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能。取結(jié)合能最低構(gòu)象結(jié)果，導(dǎo)入Pymol進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 大黃活性成分及作用靶標(biāo)共篩選活性成分16種（表1）。數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)、刪除重復(fù)項(xiàng)后，共得到62個(gè)大黃潛在作用靶標(biāo)。包括：雄激素受體（AR），B細(xì)胞淋巴瘤基因2（BCL2），BCL2相關(guān)X蛋白（BAX），乙酰膽堿M3 受 體（CHRM3），乙酰膽堿M1 受 體（，CHRM1），乙酰膽堿M4 受體（CHRM4），尼古丁性乙酰膽堿受體α7 亞型（CHRNA7），半胱氨酸蛋白酶9（CASP9），胱天蛋白酶-3（caspase-3），CASP8，凝血因子X(jué)（F10），凝血酶原（F2），PTGS2，凝血因子Ⅶ（F7），雌激素受體2（ESR2），二肽酰胺酶4（DPP4），HSP90AA1，胰蛋白酶原1（PRSS1），核受體共激活因子2（NCOA2），DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（TOP2A），鈣∕鈣調(diào)素依賴激酶MT（CAMKMT），鈉離子通道α亞單位5（SCN5A），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（KDR），過(guò)氧化物酶體素H2 合酶1（PTGS1），醛糖還原酶1（AKR1B1），JUN，雌激素受體1（ESR1），檢查點(diǎn)激酶1（CHEK1），蛋白激酶Aα催化亞單位（PRKACA）微管相關(guān)蛋白2（MAP2），蛋白激酶抑制劑α（PKIA），免疫球蛋白G1（IGHG1），CDKN1A，真核翻譯起始因子6（EIF6），腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白6（TNFAIP6），TP53，脂肪酸合酶（FASN），蛋白激酶Cε（PRKCE），細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），蛋白質(zhì)紫外線過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)因子（PCNA），MYC，白細(xì)胞介素（IL）-1β，蛋白激酶Cδ（PRKCD），細(xì)胞周期蛋白B1（CCNB1），二肽酶1（DPEP1），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），一氧化氮合酶2（NOS2），克魯伯因樣因子7（KLF7）。

表1 大黃活性成分表

2.2 急性胰腺炎疾病相關(guān)靶標(biāo)篩選了急性胰腺炎的相關(guān)基因靶標(biāo)，其中Genecards、DisGeNET、OMIM、DragBank、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到6 989、435、69、6、121 個(gè)靶標(biāo)，合并去重后共得到7 111 個(gè)作用靶標(biāo)。

2.3 大黃-急性胰腺炎交集靶標(biāo)綜合分析藥物和疾病靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)大黃與急性胰腺炎相關(guān)交集靶標(biāo)共55 個(gè)，包 括NOS2，AR，F(xiàn)10，PTGS2，F(xiàn)7，TOP2A，ESR2，DPP4，HSP90AA1，PRSS1，NCOA2，F(xiàn)2，SCN5A，KDR，PPARD，PTGS1，AKR1B1，JUN，ESR1，CHEK1，PRKACA，PGR，KCNH2，DRD1，CHRM3，CHRM1，ADRA1A，CHRM2，ADRB2，CHRNA2，SLC6A4，OPRM1，CHRNA7，BCL2，BAX，CASP9，caspase-3，CASP8，PRKCA，PON1，MAP2，CDKN1A，EIF6，TNFAIP6，TP53，F(xiàn)ASN，PRKCE，CDK1，PCNA，MYC，IL-1β，PRKCD，CCNB1，DPEP1，PPARG3。見(jiàn)圖1。

圖1 大黃與急性胰腺炎靶標(biāo)交集韋恩圖

2.4 PPI 構(gòu)建STRING 庫(kù)中導(dǎo)入55 個(gè)交集靶標(biāo)生成的PPI 包含55 個(gè)節(jié)點(diǎn)288 條邊，見(jiàn)圖2A。通過(guò)計(jì)算得到各節(jié)點(diǎn)的相關(guān)參數(shù)，其中BC中位數(shù)為13.50，CC 中位數(shù)為0.46，DC 中位數(shù)為16，EC 中位數(shù)為0.08，LAC 中位數(shù)為8.5，NC 中位數(shù)為9.21。篩選出參數(shù)均大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)并定義為核心基因靶點(diǎn)，隨后進(jìn)行拓?fù)浞治觯蔡崛〉焦?jié)點(diǎn)18 個(gè)（見(jiàn)圖2B 黃色部分）。然后以上述方法再次拓?fù)浞治觯崛『诵墓?jié)點(diǎn)8 個(gè)，分別為CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2.以此作為下一步分析的核心靶標(biāo)（圖2C）。

圖2 大黃與疾病交集靶標(biāo)蛋白作用拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)：A為交集靶標(biāo)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)；B為初篩核心靶標(biāo)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)；C為最終核心靶標(biāo)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

2.5 “大黃有效成分-交集靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)度值分值高的潛在有效活性成分為β-谷甾醇（MOL000358）、蘆薈大黃素（MOL000471）、澤蘭黃醇（MOL002235），見(jiàn)圖3。

圖3 “大黃有效成分-交集靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.6 富集分析GO 分析結(jié)果包括3 項(xiàng)：生物過(guò)程（BP）結(jié)果1 626 條、細(xì)胞組分（CC）結(jié)果64 條、分子功能（MF）結(jié)果160 條，以P.adjust＜0.01 篩選差異結(jié)果，每項(xiàng)可視化差異顯著的前10 位結(jié)果。KEGG 結(jié)果119 條，以P.adjust＜0.01 篩選差異結(jié)果，并可視化前30條結(jié)果?？梢暬詶l形圖表示。

GO 分析提示，其參與的生物過(guò)程包括：細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、節(jié)律過(guò)程、對(duì)氧水平的反應(yīng)等；細(xì)胞組分包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；分子功能包括：核受體活化、轉(zhuǎn)錄因子活化，直接配體調(diào)控序列特異性脫氧核糖核酸（DNA）結(jié)合、乙酰膽堿受體活化等，見(jiàn)圖4。KEGG 富集通路包括p53 信號(hào)通路、乙型肝炎、小細(xì)胞肺癌等，見(jiàn)圖5。

圖4 大黃疾病交集靶標(biāo)基因本位功能富集分析

圖5 大黃與疾病交集靶標(biāo)京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析

2.7 分子對(duì)接選取有效成分度值最高的β-谷甾醇、蘆薈大黃素及與之對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵蛋白通過(guò)Autodock Vina 計(jì)算結(jié)合能（表2），可視化結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 大黃有效成分與分子對(duì)接結(jié)合能最低的關(guān)鍵靶蛋白分子對(duì)接三維圖：A為蘆薈大黃素與熱休克蛋白90α；B為蘆薈大黃素與前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2；C為蘆薈大黃素與胱天蛋白酶3；D為β-谷甾醇與胱天蛋白酶3；E為β-谷甾醇與熱休克蛋白90α；F為β-谷甾醇與胱天蛋白酶8

表2 大黃活性成分與關(guān)鍵蛋白結(jié)合能∕kcal∕mol

3 討論

大黃是治療急性胰腺炎的傳統(tǒng)中醫(yī)藥物，既可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合使用。大黃進(jìn)行口服或鼻飼可以縮短病人的腹部癥狀的持續(xù)時(shí)間、大便再通時(shí)間以及血和尿淀粉酶恢復(fù)時(shí)間，并降低IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平以及死亡率［1-2］。

大黃用以治療胰腺炎時(shí)發(fā)揮治療效果的活性成分，可能包括蘆薈大黃素，澤蘭黃醇、大黃酸、β-谷甾醇、決明內(nèi)脂、兒茶素等［8］。其中，蘆薈大黃素可下調(diào)AP 大鼠血清中血小板激活因子、IL-6、TNF-α濃度；調(diào)節(jié)Treg∕Th17 免疫細(xì)胞比例發(fā)揮治療作用［2，9］。β-谷甾醇作為植物甾醇，具有降低血脂水平、退熱消炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等作用［10-11］。決明內(nèi)脂能抑制細(xì)菌中遺傳物質(zhì)的生物合成，對(duì)孢子菌、地絲菌等真菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)可降血壓、調(diào)血脂［12］。兒茶素可產(chǎn)生H2O2，上調(diào)katB、sodM 等基因，減輕氧化應(yīng)激和DNA 受損對(duì)細(xì)胞的損傷［12］。澤蘭黃醇具有明顯的抗炎及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［13］。大黃酸可通過(guò)抑制核因子κB信號(hào)通路降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎性因子的濃度，抑制炎癥活化因子轉(zhuǎn)錄，改善炎癥反應(yīng)引起的血管并發(fā)癥［14］。

本研究進(jìn)一步通過(guò)GO和KEGG分析后發(fā)現(xiàn)，大黃活性成分可能與分布在細(xì)胞不同部位的受體相互作用，進(jìn)而參與多種生物過(guò)程、調(diào)控多種通路發(fā)揮作用。通過(guò)PPI，我們發(fā)現(xiàn)CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 可能是大黃治療急性胰腺炎的關(guān)鍵蛋白。其中蘆薈大黃素可 能與CASP8、HSP90AA1、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 受體蛋白相互作用；β-谷甾醇可能與CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、JUN 受體蛋白相互作用；且二者的分子對(duì)接能均＜-5 kcal∕mol。結(jié)合能表示蛋白受體與化合物結(jié)合是否穩(wěn)定，結(jié)合能越低，結(jié)合活性越強(qiáng)。熱休克蛋白（HSP）廣泛存在各種生物細(xì)胞當(dāng)中，當(dāng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，HSP 可大量表達(dá)、起到抗炎、抗細(xì)胞凋亡及抗氧化作用。急性胰腺炎中HSP90 的升高是誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍的危險(xiǎn)因素［15］。HSP90AA1 可以調(diào)節(jié)TNF-α 和IL-6 水平，且有研究提示，抑制HSP90AA1表達(dá)，可降低小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞炎癥小體活性，減少炎性因子分泌［16］。PTGS2又稱環(huán)氧合酶2（COX-2），調(diào)控其表達(dá)的水平可以改善疾病的炎癥癥狀［17］。COX-2高表達(dá)與急性胰腺炎發(fā)生相關(guān)，COX-2 抑制劑可降低炎癥細(xì)胞因子水平，進(jìn)而減輕全身炎癥反應(yīng)并預(yù)防重癥胰腺炎的發(fā)生［18］。JUN 參與激活蛋白-1 復(fù)合物的形成，后者可被大黃抑制，進(jìn)而減少炎性因子TNF-α、IL-6 生成，發(fā)揮治療作用［19］。Tp53 基因參與細(xì)胞凋亡，AP可致胰腺TP53表達(dá)量上調(diào)，加速了胰腺細(xì)胞壞死凋亡［20］。胱天蛋白酶8 是TNF 超家族成員，可與細(xì)胞膜表面的死亡受體信號(hào)通路結(jié)合形成多蛋白死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的凋亡執(zhí)行因子caspase-3、誘導(dǎo)外源性刺激所致的細(xì)胞凋亡。AP 小鼠腸道中caspase-3 表達(dá)升高，大黃素可以下調(diào)該蛋白的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)AP引起的腸道損傷［21］。

綜上所述，大黃治療AP 的作用機(jī)制可能與其活性成分蘆薈大黃素、β-谷甾醇等與靶蛋白（HSP90AA1、PTGS2、CASP8、caspase-3 等）相互結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)多種途徑發(fā)揮生物學(xué)作用。