煙酰胺預(yù)防全反式維甲酸誘導(dǎo)小鼠腭裂的初步實驗研究

李國威，唐世杰

1.深圳大學總醫(yī)院整形美容科，廣東 深圳（518000）；2.汕頭大學第二附屬醫(yī)院整形外科暨唇腭裂治療中心，廣東 汕頭（515000）

先天性腭裂是最常見的生長發(fā)育畸形之一，發(fā)病率可高達1.7‰［1］。腭裂的發(fā)生既影響患兒的語言、聽覺、外觀、心理健康，也對患兒成長中的社會融入過程造成不利影響，同時給其家庭增加嚴重的經(jīng)濟負擔［2-4］。目前學界公認先天性腭裂是多環(huán)境因素、多基因因素共同作用的結(jié)果［5-7］。尋找能夠預(yù)防先天性唇腭裂疾病發(fā)生的方法十分重要。關(guān)于煙酰胺（nicotinamide，NAM）能否預(yù)防腭裂的實驗研究，目前尚無報道。本文在全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，RA）誘導(dǎo)小鼠腭裂模型的基礎(chǔ)上［8］，探索NAM 是否具有預(yù)防腭裂的作用，并探索了其與細胞凋亡相關(guān)機制的可能性，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

全反式維甲酸（RA）（R2625，Sigma，美國），煙酰胺（NAM，N105042，阿拉丁，中國），胎牛血清（10100147，Gibco，美國），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（P1020，索萊寶，中國），二甲基亞砜（D12345，Sigma，美國），改良Eagle 培養(yǎng)基（12430054，Gibco，美國），0.05%胰蛋白酶（Invitrogen，美國），Annexin V - FITC/PI 試劑盒（KGA108，凱基，中國），體式光學顯微鏡（SZX10，Olympus，日本），光學顯微鏡（Ixplore，Olympus，日本），BD Accuri 流式細胞儀（C6，BD，美國）。

1.2 動物實驗

7～8 周齡的昆明小鼠（15 只雌、10 只雄）購于汕頭大學醫(yī)學院動物實驗中心（動物合格證號：2021A023）。小鼠飼養(yǎng)于汕頭大學附屬二院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心動物房。房間內(nèi)相對濕度維持在60%～70%，室溫維持在18℃～22℃。每日提供新鮮的飼料和飲用水，墊料每3～5 d 更換1 次。本次實驗獲得汕頭大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會（批號：SU-2021-0121 號）批準。

篩選體重≥30 g 的昆明小鼠按照雌雄比2∶1～3∶1 的比例在第1 d 20∶00 合籠，于第2 d 08∶00，檢查雌鼠陰道內(nèi)是否含有陰道栓或精液，如含有陰道栓或精液則記為胚胎發(fā)育（embryonic，E）0.5 d（E0.5），稱重，重復(fù)此過程，于E8.5 再次稱重，若體重增長大于等于2 g，則判定小鼠有孕并入組進行實驗。

小鼠被隨機分為3 組：實驗組（1）、實驗組（2）與對照組，每組5 只孕鼠；于E10.5 按70 mg/kg 溶于玉米油中的RA 進行灌胃誘導(dǎo)的小鼠為對照組；實驗組設(shè)置兩個煙酰胺（NAM）濃度（20、40 mg/kg），于E8.5～E13.5 按20 mg/kg 溶于PBS 的NAM 尾靜脈注射處理的腭裂小鼠模型為實驗組（1），于E8.5～E13.5 按40 mg/kg 溶于PBS 的NAM 尾靜脈注射處理的腭裂小鼠模型為實驗組（2），于E16.5 剖腹取出胚胎鼠，觀察胎鼠情況并對腭裂發(fā)生率進行統(tǒng)計。

1.3 細胞實驗

鼠胚腭突間質(zhì)（mouse embryonic palatal mesenchyme，MEPM）細胞的原代培養(yǎng)：另外飼養(yǎng)昆明小鼠（6 只雌、3 只雄），并依照同樣方法合籠，判定有孕后取E13.5 孕鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min，瀝干至不滴液體后移入超凈臺，放置于紗布上，在超凈臺中用無菌眼科剪刀及鑷子切開腹部并取出胚胎放置于全新無菌紗布上。超凈臺中，將顯微剪刀、顯微鑷子用酒精燈外焰灼燒過火。用顯微剪刀剪開胎膜，待羊水流出后，取出胚胎，剪下胎鼠頭部，放入PBS 中清洗2 次，顯微剪刀從兩側(cè)口角進入，將胎鼠的下頜及舌部剪除，在顯微鏡下找到上頜，自唇中線至腭突后緣剪開，充分暴露腭突組織，雙側(cè)上頜外翻，分別剪下雙側(cè)腭突組織，將取出的腭突組織放入培養(yǎng)皿中并剪成1 mm3左右的組織塊。采用組織塊法對腭突細胞培養(yǎng)至第三代（passage 3，P3），第三代至第五代（passage 5，P5）MEPM 細胞將用于后續(xù)實驗中。

MEPM 細胞分為四組：對照組（CONTROL）、RA 1 μmol/L 組（RA 1）、NAM 200 μmol/L 組（NAM 200）、NAM 200 μmol/L+RA 1 μmol/L 組（NAM 200+RA 1），將P3～P5 的MEPM 細胞接種于六孔板中，細胞濃度調(diào)整為105個/mL，每孔2 mL，加入完全培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，待其貼壁后，去除廢液，PBS 沖洗2～3 次；加入無胎牛血清的培養(yǎng)液對MEPM 細胞饑餓培養(yǎng)，24 h 后，加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用Annexin V-FITC/PI雙染色法進行細胞凋亡的檢測。細胞凋亡采用BD Accuri C6 流式細胞儀檢測，構(gòu)建FITC、PI 單陽對照組調(diào)節(jié)補償，并用十字門分區(qū)后，將待測組上機檢測早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率?？偟蛲雎?早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對獨立重復(fù)三次的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析?？ǚ綑z驗分析各組腭裂表型的構(gòu)成比差異，方差分析比較各組MEPM 細胞凋亡率，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物實驗

每組5 只孕鼠，每只孕鼠懷有胚胎2～16 個，無死胎或吸收胎。胎鼠腭裂表型與非腭裂表型見圖1，統(tǒng)計結(jié)果見表1。對照組中，活胎62 只，其中61 只具有腭裂表型，1 只不具有腭裂表型，其腭裂發(fā)生率為98%；實驗組（1）中，活胎47 只，其中41 只具有腭裂表型，6 只不具有腭裂表型，腭裂發(fā)生率為87%，與對照組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.83，P＞0.05）；實驗組（2）中，活胎43 只，其中27 只具有腭裂表型，16 只不具有腭裂表型，腭裂發(fā)生率為63%，與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=21.16，P＜0.01）。

表1 煙酰胺預(yù)防全反式維甲酸誘導(dǎo)小鼠腭裂的胎鼠情況及腭裂率Table 1 Conditions of fetal rats and incidence of cleft palate in mice induced by all-trans retinoic acid with the prevention of nicotinamide

圖1 正常腭與腭裂表型圖Figure 1 Phenotype of normal palate and cleft palate

2.2 細胞實驗

細胞凋亡率結(jié)果如圖2、表2 所示。CONTROL組平均凋亡率16.53%±2.89%；與CONTROL 組相比，RA 1 組平均凋亡率為22.9%±1.85%，凋亡率上升（P＜0.01），NAM 200組平均凋亡率9.23%±1.39%，凋亡率下降（P＜0.01）；與RA 1組相比較，NAM200+RA1 組平均凋亡率為14.9%±7.67%，凋亡率下降（P＜0.01）。

圖2 流式細胞儀檢測MEPM 細胞凋亡Figure 2 Apoptosis of MEPM cells detected by flow cytometry

表2 流式細胞儀檢測MEPM 細胞凋亡統(tǒng)計表Table 2 Statistical table of MEPM cell apoptosis detected by flow cytometry

3 討 論

先天性腭裂是我國常見的出生缺陷疾病［9］，RA 灌胃誘導(dǎo)小鼠腭裂模型是研究該疾病常用的實驗動物研究模型［10］，尋找能夠預(yù)防先天性腭裂的方法具有重大意義。目前關(guān)于NAM 是否能夠預(yù)防腭裂的研究尚無報道。

3.1 RA 誘導(dǎo)小鼠腭裂

RA 是維生素A 在體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物［11］。正常劑量的維生素A 對于維持胚胎細胞增殖、分化、遷移、凋亡具有重要作用，過量的RA 是研究腭裂病因?qū)W常用的致畸劑［12-13］。

RA 誘導(dǎo)胎鼠腭裂的模型受到多種因素影響，包括動物品種、給藥時機、給藥劑量等。給藥時機的不同，誘導(dǎo)腭裂的可能機制也不盡相同。有研究表明于E8 對孕鼠通過灌胃給予RA 可以成功誘導(dǎo)腭裂，其機制可能與RA 影響了神經(jīng)嵴細胞的生長發(fā)育過程有關(guān)；于E10 對孕鼠進行RA 的灌胃干預(yù)，會通過影響MEPM 細胞的增殖使腭突體積變小而誘導(dǎo)腭裂發(fā)生；于E12 對孕鼠進行RA 的灌胃干預(yù)，會通過影響腭的上抬、腭突的接觸融合而誘導(dǎo)腭裂。于E10 對孕鼠進行RA 的灌胃干預(yù)，腭裂率最高，為100%。

本課題組前期于E10.5 使用RA 通過灌胃途徑誘導(dǎo)胎鼠腭裂的動物模型較為成熟，腭裂率為100%［14］。本次動物實驗使用70 mg/kg 的RA 于E10.5 對昆明孕鼠進行灌胃所誘導(dǎo)的腭裂發(fā)生率統(tǒng)計為98%，成功誘導(dǎo)了昆明小鼠腭裂表型的產(chǎn)生。

“維甲酸受體學說”是RA 誘導(dǎo)腭裂的一個可能機制。維甲酸受體是核受體家族中的子家族。RA 在體內(nèi)可與維甲酸受體（retinoic acid receptors，RARs）、視黃素X 受體（retinoid X receptors，RXRs）結(jié)合發(fā)生構(gòu)象變化，釋放轉(zhuǎn)錄共抑制因子（co-repressor），募集轉(zhuǎn)錄共激活因子（co-activator），調(diào)節(jié)核內(nèi)基因的表達［15］。RA 作用于機體的功能很可能是通過調(diào)控基因的表達進而發(fā)揮作用的，維甲酸信號通路的異常很可能是RA 誘導(dǎo)腭裂的重要機制之一。

“細胞凋亡”很可能是RA 誘導(dǎo)小鼠腭裂的另一個重要機制［16］。在對MEPM 細胞的研究中，Yu等［17］在細胞水平上使用梯度濃度的RA 誘導(dǎo)MEPM 細胞凋亡，并檢測了Caspase-3、Caspase-8 以及Caspase-9 的酶活性，Caspase-3、Caspase-9 活性升高的結(jié)果表明，RA 可以通過內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)MEPM 細胞的凋亡，而Caspase-8 活性無差異的結(jié)果也表明，RA 并沒有通過外源性凋亡通路誘導(dǎo)MEPM 細胞的凋亡。在本次實驗中，通過Annexin V-FITC/ PI 雙染色法進行細胞凋亡的流式檢測，驗證了RA 對MEPM 細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。1 μmol/L 的濃度是其出現(xiàn)凋亡表型的閾值，隨著RA 濃度的上升毒性也越加明顯。故本實驗選取了RA 1 μmol/L 的閾值濃度［18］，此濃度即可以使RA 表現(xiàn)出對MEPM 細胞的凋亡誘導(dǎo)作用，不會使MEPM 細胞過度死亡，同時也更容易發(fā)現(xiàn)煙酰胺的預(yù)防凋亡作用。

3.2 預(yù)防腭裂的相關(guān)藥物

目前可能預(yù)防腭裂發(fā)生的藥物主要有維生素B6、葉酸（Vit B9）、白藜蘆醇（resveratrol）、鋅（zinc）等。

人們對葉酸與胚胎發(fā)育的研究開展得較為豐富，葉酸的缺乏會導(dǎo)致腭裂的發(fā)生［19］。在北美，在谷物中添加葉酸已經(jīng)被法律強制要求，流行病學調(diào)查研究已得出葉酸可以使唇腭裂發(fā)病率下調(diào)的結(jié)論［20］。葉酸在一碳單位代謝中起重要作用，葉酸代謝的正常運轉(zhuǎn)對于維持DNA 甲基化、DNA 合成、DNA 修復(fù)具有重要作用，葉酸的缺乏會導(dǎo)致人體總基因組DNA 甲基化水平的降低，或一些DNA甲基化調(diào)節(jié)的異常［5，21］，比如：蛋氨酸合酶（methionine synthase，MS）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（methylene tetrahydrofolate dehydrogenase1，MTHFD1）、亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）［22-23］等。上述酶的異常會引起高同型半胱氨酸血癥，影響DNA 的正常甲基化。葉酸可能是通過影響血液中同型半胱氨酸濃度的改變，影響腭的生長發(fā)育。葉酸也可能通過促進MTHFR 的活性上調(diào)了同型半胱氨酸向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，進而改變了DNA 的合成，預(yù)防腭裂的發(fā)生。

維生素B6 的缺乏也會增加唇腭裂的風險。維生素B6 可能通過阻斷糖皮質(zhì)激素受體，改變了地塞米松誘導(dǎo)小鼠腭裂的核基因表達［24］，同時維生素B6 也是同型半胱氨酸的輔助因子，也可能參與調(diào)節(jié)半胱氨酸向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，改變了DNA 合成，進而預(yù)防腭裂的發(fā)生。

血鋅含量與唇腭裂的發(fā)生也可能具有一定相關(guān)性［25］。既往研究鋅對體外小鼠胚胎腭融合的影響時發(fā)現(xiàn)，較高濃度的鋅能有效促進腭的融合，缺鋅條件下MEPM 細胞中凋亡細胞較對照組明顯增多、腭組織融合被阻礙；然而，在動物試驗中，補充鋅未能有效阻斷RA 誘導(dǎo)的胎鼠腭裂。上述實驗的不同結(jié)果使得鋅預(yù)防腭裂的作用處于爭議狀態(tài)。

白藜蘆醇也很可能具有預(yù)防腭裂的作用。Ni 等［25］通過研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有調(diào)控腭突間質(zhì)細胞中MTHFR 表達的作用，其調(diào)控機制可能與轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/Smad 蛋白家族（Smad familly，Smad）通路有關(guān)。

3.3 NAM 預(yù)防腭裂的可能機制

煙酰胺（NAM），亦稱尼克酰胺，是煙酸（維生素B3）的胺化合物。NAM 目前是臨床上使用的成熟藥物，主要應(yīng)用于防治糙皮病、維生素的補充、洋地黃中毒后緩慢性心律失常的輔助治療、改善維拉帕米引起的心率減慢和房室傳導(dǎo)阻滯等。

本次實驗組相較對照組，胎鼠數(shù)降低，孕期NAM 的補充是否具有毒性反應(yīng)需要討論，通過檢索FDA Drugs Database 記錄中（https://www.drugfuture.com/toxic/q81-q953.html）的毒理實驗，發(fā)現(xiàn)該藥物在小鼠口服途徑的半數(shù)致死量（lethal dose 50%，LD50）為2.5～3.5 g/kg，致畸、致癌、致突變實驗均為陰性，現(xiàn)己被美國FDA 認作安全藥物。本次動物實驗篩選出NAM 經(jīng)尾靜脈注射途徑預(yù)防RA 誘導(dǎo)腭裂的有效濃度為40 mg/kg，遠未達到LD50劑量，但其安全性和毒性仍待評估，其最佳濃度仍待進一步實驗。

本次細胞實驗初步顯示了一定濃度的NAM 具有降低MEPM 細胞凋亡的作用。同時NAM 可以減少MEPM 的細胞凋亡產(chǎn)生，可以拮抗RA 誘導(dǎo)MEPM 的細胞凋亡。

文獻報道NAM 可以調(diào)節(jié)細胞能量代謝，影響和調(diào)節(jié)與細胞存活和死亡［26］。NAM 具有保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用［27］。三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)（線粒體內(nèi)）普遍存在的代謝途徑，輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+）、輔酶Ⅱ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP+）作為遞氫體參與氧化呼吸鏈的代謝過程［28］，還參與脂質(zhì)代謝、糖原分解等過程［29-30］。NAM 是輔酶Ⅰ的前體藥物［31］，可增加輔酶Ⅰ、增加NAD+與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）的比值以緩解氧化應(yīng)激，從而避免細胞發(fā)生凋亡［32-33］。同時，NAM 可抑制ADP-核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase，PARP），保護基因組的完整性，改變細胞的能量代謝，改變細胞中甲基化水平代謝及DNA、蛋白質(zhì)的甲基化，導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)錄組和翻譯組發(fā)生變化，減少細胞凋亡的發(fā)生［34］。

推測NAM 可能是通過抑制MEPM 細胞的凋亡、保護基因組的完整性、改變甲基化水平等可能機制發(fā)揮預(yù)防腭裂的作用，具體機制及相關(guān)通路仍有待進一步研究。

3.4 創(chuàng)新性及展望

本次實驗發(fā)現(xiàn)了NAM 在特定濃度下具有預(yù)防腭裂的作用，并初步探索了與細胞凋亡相關(guān)的機制，發(fā)現(xiàn)了NAM 預(yù)防腭裂的作用機制可能是通過阻斷RA 誘導(dǎo)的MEPM 細胞凋亡產(chǎn)生的。未來將進一步探索相關(guān)機制及通路研究，使孕期補充適量的NAM 成為腭裂預(yù)防的新方法。

【Author contributions】Li GW designed the main experiments, analyzed the data and wrote article.Tang SJ performed the experiments,contributed to the acquisition and analysis of data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.