JAK2-STAT3通路介導(dǎo)牙齦卟啉單胞菌促結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的研究

張若彤，劉曉晨，葉瑋

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔預(yù)防科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海（200011）；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽（110003）

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是革蘭氏陰性厭氧菌，是牙周病中研究最多、最重要的致病菌之一［1］。有研究表明，P.g可以從口腔轉(zhuǎn)移到腸道，結(jié)腸黏膜的厭氧和高pH 環(huán)境亦有利于P.g的黏附［2］。同時(shí)，P.g可分泌多種蛋白酶毒力因子破壞結(jié)腸表面的黏液層，從而直接接觸腸上皮并可能引發(fā)多種腸道疾病如炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）［3］、結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）［4］等。目前，已有越來越多研究證明P.g可以定植于結(jié)腸癌組織內(nèi)，通過招募髓系免疫細(xì)胞，為結(jié)直腸癌細(xì)胞營造一個(gè)富集髓系細(xì)胞的促炎腫瘤微環(huán)境［4］，但P.g對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的作用鮮有研究和報(bào)道。慢性炎癥在促腫瘤生長的過程中發(fā)揮重要作用，雖然目前已經(jīng)明確單獨(dú)的細(xì)胞增殖不會(huì)引起惡性腫瘤的發(fā)生，但是在炎性因子、生長基質(zhì)都非常豐富的環(huán)境下，DNA 損傷促進(jìn)劑存在的環(huán)境下持續(xù)的細(xì)胞增殖可能會(huì)提升腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［5］。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。IL-10 是一種廣泛表達(dá)的抗炎因子，對(duì)腫瘤的生長有一定的抑制效果［6］。IL-6是一種常見且多變的炎癥細(xì)胞因子，常在組織損傷或感染時(shí)分泌增加，它不僅在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中具有核心作用，而且還被認(rèn)為是惡性腫瘤的關(guān)鍵生長因子［7］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是負(fù)責(zé)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白的關(guān)鍵信號(hào)分子之一［8］，過度激活STAT3 可以直接通過腫瘤自主機(jī)制或間接通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基質(zhì)和免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤生長。STAT3 可以通過多種通路被調(diào)節(jié)，蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase 2，JAK2）-STAT3 信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的參與STAT3表達(dá)的最重要通路之一，JAK2-STAT3 信號(hào)通路在許多類型的癌癥中都表現(xiàn)出異常高活化［9］。本實(shí)驗(yàn)采用梯度細(xì)菌感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的P.g對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2）進(jìn)行不同時(shí)間的刺激，觀察Caco-2 中促炎因子IL-6 和抑炎因子IL-10 的表達(dá)水平變化，并深入探討增殖通路JAK2-STAT3 在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步探討P.g與結(jié)腸癌之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

Caco-2 細(xì)胞系SCSP-5027（中科院細(xì)胞庫，中國）；P.gingivalis ATCC33277（中科院細(xì)菌庫，中國）；CCK8 試劑盒（Biosharp 公司，中國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國）；Trizol（Ambion 公司，美國）；Fast-KingcDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生物有限公司，中國）；SuperRealPreMix Plus（SYBR Green）（北京天根生物有限公司，中國）；兔抗人IL-6（Abmart 公司，中國）；IL-10（Abmart 公司，中國）；p-JAK2（Abmart 公司，中國）；p-STAT3（Abmart 公司，中國）；鼠抗β-actin（millipore 公司，美國）；10%胎牛血清（Gibco 公司，美國）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（cytiva 公司，美國）；青霉素、鏈霉素（Gibco 公司，美國）；胰酶（Gibco 公司，美國）；BHI 培養(yǎng)基（Sigma 公司，美國）；氯化血紅素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）；無菌脫纖維羊血（Solarbio 公司，中國）；維生素K1（天津藥業(yè)集團(tuán)，中國）；瓊脂（Sigma 公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮容器中取出細(xì)胞凍存管，立即放入37 ℃水浴鍋中，并不時(shí)搖動(dòng)使其迅速融化。待凍存液完全融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，常溫離心，1 000 rpm 離心5 min，棄去上清液，加入適量含20%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。次日更換1 次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定并生長至70%～80%融合后傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度備用。

1.3P.gATCC33277 培養(yǎng)

將凍存細(xì)菌從-80°冰箱取出，手心溫度融化，接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基含5%脫纖維羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K1。晾干后放至厭氧盒，37 ℃厭氧培養(yǎng)3～5 d。3～5 d 后傳代至新的固體培養(yǎng)基。液體增菌時(shí)，離心管中加5～6 mL 液體培養(yǎng)基。從固體培養(yǎng)基刮取適量菌體入液體培養(yǎng)基，吹勻，擰緊離心管后再檸松半圈。放回厭氧盒，培養(yǎng)16～24 h 備用。

1.4 細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)模型構(gòu)建

Caco-2 細(xì)胞長至70%～80%融合后，消化收集細(xì)胞，重懸于新鮮培養(yǎng)基后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕臃N于不同規(guī)格細(xì)胞培養(yǎng)皿（1 皿用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余用于實(shí)驗(yàn)）中。接種完成后，待細(xì)胞貼壁24 h 后，消化計(jì)數(shù)，計(jì)算每皿總細(xì)胞數(shù)。P.g液體增菌16～24 h后，吸取適量細(xì)菌懸液，5 000 rpm，離心10 min 后，PBS 洗滌1 次，重懸于細(xì)胞完全培養(yǎng)基。設(shè)置刺激時(shí)間分別為12、24、48 h，MOI=0 為對(duì)照組，MOI=1、10、25 為實(shí)驗(yàn)組。使用紫外分光光度計(jì)在OD600測量細(xì)菌濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置MOI 數(shù)值稀釋細(xì)菌至合適濃度并加入至準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

1.5 CCK8 法檢測Caco-2 增殖情況

Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%后，消化收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，96 孔板每孔加入100 μL 調(diào)整后的細(xì)胞懸液。貼壁24 h后，消化3 個(gè)孔進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值，代表每孔實(shí)際細(xì)胞數(shù)。設(shè)置刺激時(shí)間分別為12、24、48 h，MOI=0 為對(duì)照組，MOI=1、10、25 為實(shí)驗(yàn)組。按照組別設(shè)定依次向各孔加入相應(yīng)的細(xì)菌懸液，12、24、48 h 后，更換含有1%抗生素的培養(yǎng)基孵育1 h 后，再更換含有10 μL 的CCK8 試劑的完全培養(yǎng)基110 μL，37 ℃避光孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm 檢測各孔吸光值，每個(gè)條件重復(fù)5 個(gè)孔。對(duì)照組細(xì)胞數(shù)設(shè)置為100%，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD450平均值的比值百分?jǐn)?shù)表示實(shí)驗(yàn)組相對(duì)對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量增殖百分比。

1.6 qRT-PCR檢測P.g梯度感染Caco-2細(xì)胞后IL-6、IL-10、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)

從MOI 梯度和刺激時(shí)間梯度兩個(gè)維度進(jìn)行檢測，首先設(shè)置MOI=0 為對(duì)照組，MOI=1、10、25，刺激時(shí)間為24 h 為實(shí)驗(yàn)組，檢測MOI 梯度下相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況；接著設(shè)置MOI=0 為對(duì)照組，MOI=10、刺激時(shí)間為12、24、48 h 為實(shí)驗(yàn)組，檢測時(shí)間梯度下相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況。檢測P.g梯度感染Caco-2 細(xì)胞后，不同時(shí)間炎癥因子IL-6、IL-10、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)情況。采用TRIzol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μL，并將得到的cDNA 保存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物序列見?。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為20 μL。樣品以β-actin 為內(nèi)參基因，設(shè)置主副孔，每個(gè)條件重復(fù)至少5 次。反應(yīng)條件為95 ℃3 min 預(yù)變性，95 ℃10 s 變性，57 ℃20 s退火，72 ℃20 s 延伸，共45 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt定量分析法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)變化。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.7 Western blot 檢測P.g梯度感染Caco-2 細(xì)胞后IL-6、IL-10、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)

設(shè)置MOI=0 為對(duì)照組，MOI=10、刺激時(shí)間為12、24、48 h 為實(shí)驗(yàn)組，檢測時(shí)間梯度下相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況。將需要抽提蛋白的細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 遍，盡量吸干PBS。按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入Ripa 裂解液（裂解液中預(yù)先按照1∶1 000 的比例混勻蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑）100 μL，冰上放置15～20 min 充分裂解細(xì)胞。用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于離心管中，14 000 rpm 離心40～45 min，取上清，用BCA 試劑盒測定樣品的蛋白濃度。稀釋樣品，按照每孔上樣量為30 μL 蛋白分裝樣品并加入緩沖液95 ℃10 min 處理樣品使蛋白變性。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min。分別加入稀釋好的抗體：IL-6、IL-10、p-JAK2、p-STAT3 和β-actin，4 ℃搖床孵育過夜（至少18 h）。TBST 洗膜3 次，每次15 min。按照1∶3 000 稀釋HRP 標(biāo)記的抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h后，TBST同前洗膜4次，每次7 min。蛋白電泳條帶顯影，使用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值定量分析。以β-actin 條帶做為內(nèi)參，用目的條帶與β-actin條帶的灰度值比例反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 檢測JAK2 抑制劑AZ960 對(duì)P.g感染Caco-2 細(xì)胞的影響

加入JAK2 抑制劑AZ960，檢測感染P.gCaco-2細(xì)胞增殖情況，以及JAK2、STAT3 mRNA，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)。CCK8 實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置加入細(xì)菌（MOI=10，t= 12、24、48 h）、不加AZ960 為對(duì)照組，同時(shí)加入細(xì)菌（MOI=10，t= 12、24、48 h）和AZ960為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)方法同1.5。qRT-PCR 和Western blot 中，設(shè)置不加細(xì)菌和AZ960 為陰性對(duì)照組，加細(xì)菌（MOI=10，t= 24 h）、不加AZ960 為陽性對(duì)照組，同時(shí)加入細(xì)菌（MOI=10，t=24 h）和AZ960 為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)方法同1.6、1.7。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS（version 23.0，IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Graphpad Prism5 作圖。對(duì)于計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)采用近似t 檢驗(yàn)；多組比較采用方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

將常規(guī)培養(yǎng)的結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。MOI=0，培養(yǎng)時(shí)間為12、24、48 h 時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，多數(shù)細(xì)胞呈梭形分枝狀。MOI=1、10 時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，同時(shí)間段相較對(duì)照組貼壁細(xì)胞增多；MOI 增大至25 時(shí)，隨著刺激時(shí)間延長至24 h 和48 h，少量細(xì)胞有飄起現(xiàn)象，但整體細(xì)胞狀態(tài)尚可（圖1）。綜上，P.g感染結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞的模型構(gòu)建成功，細(xì)胞的良好生長狀態(tài)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性建立基礎(chǔ)。

圖1 不同MOI 牙齦卟啉單胞菌刺激下結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞形態(tài)觀察（×40）Figure 1 Morphological observation of Caco - 2 colorectal cancer cells stimulated byP.gat different MOIs(×40)

2.2 CCK8 檢測P.g對(duì)Caco-2 增殖的影響

P.g梯度感染Caco-2 細(xì)胞的結(jié)果顯示，當(dāng)MOI為1 和10 時(shí)，作用時(shí)間12 h、24 h 后，P.g對(duì)Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出持續(xù)促進(jìn)增殖的作用（P＜0.05），其中MOI 為10 時(shí)，P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞刺激作用最為明顯；感染48 h，P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞依然表現(xiàn)出持續(xù)促進(jìn)增殖的作用，但增殖差異不顯著（P=0.176）。當(dāng)MOI 增大至為25 時(shí)，P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞在12 h 時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)生長作用，隨著刺激時(shí)間延長至48 h，Caco-2 細(xì)胞增殖被抑制（圖2）。

2.3P.g感染Caco-2 細(xì)胞后IL-6 和IL-10 表達(dá)

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)刺激時(shí)間為24 h，與對(duì)照組（MOI=0）相比，隨著MOI 從1 增加到10 再到25 時(shí)，IL-6 的mRNA 水平先升高再降低，并在MOI 為10 時(shí)上升至最高（P＜0.001）；而IL-10 的mRNA 水平與IL-6 相比則呈現(xiàn)相反趨勢；當(dāng)MOI 為25 時(shí)，IL-6 和IL-10 的mRNA 水平相較于對(duì)照組均降低（圖3a、3b）。

Figure 2 Effect ofP.gon the proliferation of Caco-2 cells by CCK8 assay圖2P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖的影響

隨后檢測不同感染時(shí)間IL-6 和IL-10 表達(dá)變化，當(dāng)MOI 為10 時(shí)，與對(duì)照組（MOI=0）相比，IL-6 的mRNA 水平在刺激時(shí)間為24 h 時(shí)達(dá)到最高（P＜0.01）；而IL-10 的mRNA 水平與IL-6 呈現(xiàn)相反趨勢，在刺激時(shí)間為24 h 時(shí)顯著低于對(duì)照組（圖3c、3d）（P＜0.05）。

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)MOI 為10 時(shí)，與對(duì)照組（MOI=0）相比，IL-6 的蛋白表達(dá)水平在刺激時(shí)間為24 h 時(shí)達(dá)到最高（P＜0.05）；而IL-10 蛋白表達(dá)水平與IL-6 呈現(xiàn)相反趨勢，在刺激時(shí)間為24 h時(shí)開始顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）（圖3e、3f）。

圖3 感染P.g后Caco-2 細(xì)胞IL-6、IL-10 mRNA 及蛋白表達(dá)Figure 3 IL-6 and IL-10 mRNA and protein expression in Caco-2 cells infected withP.g

2.4P.g感染Caco-2 細(xì)胞后JAK2、STAT3 表達(dá)

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺激時(shí)間為24 h 時(shí)，與對(duì)照組（MOI=0）相比，隨著MOI 從1 增加到10 再到25，P.g刺激后的Caco-2 細(xì)胞相比對(duì)照組JAK2和STAT3 的mRNA 表達(dá)水平先增高后降低，并在MOI 為10 時(shí)達(dá)到最高（P＜0.05）；此后隨著MOI 的增大，P.g對(duì)細(xì)胞增殖呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，JAK2 和STAT3 mRNA 水平下降（圖4a、4b）。

MOI 為10 的情況下，隨著刺激時(shí)間的增加，JAK2 和STAT3 mRNA 水平在24 h 達(dá)到最高后下降，但水平仍然高于對(duì)照組（圖4c、4d）。

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（MOI=0）相比，當(dāng)MOI 為10 時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增加，Caco-2 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)量逐漸增高，并在刺激時(shí)間為24 h 時(shí)達(dá)到最高；48 h 后p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)量開始降低，但仍高于對(duì)照組（圖4e、4f）。

圖4 感染P.g的Caco-2 細(xì)胞JAK2、STAT3 mRNA 及p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)Figure 4 JAK2 and STAT3 mRNA and p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in Caco-2 cells infected withP.g

2.5 JAK2 抑制劑AZ960 對(duì)P.g感染Caco-2 細(xì)胞的影響

添加JAK2 抑制劑AZ960 后，MOI 為10 時(shí)，與未添加抑制劑時(shí)相比，P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖促進(jìn)作用減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）（24 h，P＜0.01；48 h，P＜0.05）。

圖5 添加JAK2 抑制劑AZ960 后P.g感染Caco-2 細(xì)胞增殖情況Figure 5 Cell proliferation of Caco-2 cells infected withP.gafter the addition of the JAK2 inhibitor AZ960

使用JAK2 抑制劑AZ960 后，MOI 為10 時(shí)，P.g處理Caco-2的細(xì)胞24 h后，STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平表達(dá)均顯著低于未添加抑制劑的P.g處理組（陽性對(duì)照組）；JAK2 mRNA 和p-JAK2蛋白表達(dá)水平均顯著低于未添加抑制劑的P.g處理組（圖6）。

圖6 添加JAK2 抑制劑AZ960，感染P.g的Caco-2 細(xì)胞STAT3、JAK2 mRNA 及p-STAT3 和p-JAK2 蛋白表達(dá)Figure 6 STAT3,JAK2 mRNA and p-STAT3,p-JAK2 protein expression in Caco-2 cells infected withP.gafter the addition of the JAK2 inhibitor AZ960

3 討 論

牙周病是多種系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素，然而，牙周病和消化道腫瘤的關(guān)系尚不明確，兩者可能存在潛在的相關(guān)性?？谇晃⑸锶菏亲顝?fù)雜的人類微生物群之一，僅次于胃腸道的微生物群，含有與人體相關(guān)的26%的細(xì)菌種類［10］。此外，有臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，絕大多數(shù)口腔微生物物種可以從口腔傳播到大腸［11］?？谇患?xì)菌與許多口腔疾病和口腔以外的系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。作為牙周病的主要病原體，P.g被證實(shí)與全身多種疾病關(guān)系密切，如口腔鱗狀細(xì)胞癌、食道鱗狀細(xì)胞癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和心血管疾?。?2-16］。同時(shí)有研究證明，P.g與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)［17］。P.g被報(bào)道在結(jié)直腸癌患者的糞便樣品及組織樣本中的陽性率均高于正常組織，且P.g豐度高的患者相對(duì)于P.g豐度低的患者的總生存期和5 年無復(fù)發(fā)生存期較短［4］。

目前已有研究表明，P.g對(duì)不同的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的刺激特性，對(duì)牙齦上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞等表現(xiàn)出促進(jìn)增殖，但對(duì)于軟骨細(xì)胞則促進(jìn)其凋亡［18］。在本研究中，P.g可以持續(xù)促進(jìn)結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞的增殖，這可能與P.g改變了Caco-2 細(xì)胞內(nèi)部增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。P.g具有多種毒力因子，包括莢膜多糖、脂多糖、菌毛、膠原酶、牙齦蛋白酶等［19］，當(dāng)細(xì)菌數(shù)量過多、毒力過強(qiáng)或機(jī)體免疫力低下時(shí)，部分細(xì)菌可以通過粘附、入侵組織和細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的清除，并通過影響周圍細(xì)胞為自己營造適宜生存和繁殖的環(huán)境，其中就包括了通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖以及各種炎性因子的分泌［20］。

不良刺激造成的慢性炎癥與細(xì)胞的惡性增殖行為密切相關(guān)，其中幾種常見的炎癥因子如IL-6、IL-10 等，已經(jīng)被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。IL-6 是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要自分泌生長因子［21］，組織損傷或感染都會(huì)增加腫瘤細(xì)胞IL-6的分泌。據(jù)報(bào)道，在結(jié)腸癌腫瘤組織和患者的血清中，IL-6 的表達(dá)都有所增加，IL-6 的表達(dá)與腫瘤的分期、大小、轉(zhuǎn)移和結(jié)腸癌患者的生存率密切相關(guān)［9］。IL-10 是一種廣泛表達(dá)的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤的發(fā)展有復(fù)雜的影響，有研究認(rèn)為IL-10 可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡以及抑制血管生成從而抑制腫瘤的進(jìn)展［22］。IL-10 的缺乏與炎癥誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān)。

STAT3 與惡性腫瘤增殖密切相關(guān)，它控制了有關(guān)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化的多種基因［23］，STAT3 活性在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的各種腫瘤中顯著升高［24］，結(jié)腸癌的惡性程度和增殖活性與STAT3的活性密切相關(guān)［25］。P.g可以通過STAT3 基因調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。Moffatt 等［26］的研究表明，P.g能通過激活STAT3 抑制牙齦上皮細(xì)胞的內(nèi)在凋亡途徑，從而有助于P.g在附著和侵入牙齦上皮細(xì)胞后的自身存活。Binder 等［27］發(fā)現(xiàn)，持續(xù)放大的STAT3 磷酸化信號(hào)是P.g促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用基礎(chǔ)。JAK2 激酶是激活STAT3 重要的上游基因，JAK2 的磷酸化被激活后，可以進(jìn)一步磷酸化下游STAT3，進(jìn)而調(diào)控多種核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明JAK2-STAT3 途徑在結(jié)腸癌細(xì)胞的過度增殖和侵襲過程中發(fā)揮重要作用［9］。炎性因子IL-6 也是JAK2-STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)的主要激活劑之一，同時(shí)STAT3 促進(jìn)IL-6 基因表達(dá)的能力導(dǎo)致自分泌前饋循環(huán)，接著放大細(xì)胞因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥，與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)［6］。

本研究證明，與對(duì)照組相比，P.g可以顯著上調(diào)Caco-2 細(xì)胞中促炎因子IL-6 的表達(dá)，同時(shí)抑制抑炎因子IL-10 的表達(dá)，這表明P.g可以使Caco-2 形成促炎的腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞增殖與發(fā)展。同時(shí)，相較于對(duì)照組，P.g可顯著上調(diào)Caco-2 細(xì)胞內(nèi)JAK2、STAT3 的mRNA 和p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)。反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在使用JAK2 抑制劑AZ960 處理Caco-2 細(xì)胞后，其下游產(chǎn)物STAT3 的mRNA 和p-STAT3 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均受到明顯抑制。且對(duì)Caco-2 細(xì)胞添加JAK2抑制劑AZ960 后，P.g對(duì)Caco-2 細(xì)胞的增殖促進(jìn)效果減弱。

綜上，本研究推測P.g可以通過改變Caco-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞營造適宜增殖的炎性環(huán)境，并且可能通過激活JAK2-STAT3 通路促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果進(jìn)一步為牙周病、牙周細(xì)菌與結(jié)腸癌之間的聯(lián)系提供依據(jù)，并為預(yù)防和治療結(jié)腸癌的發(fā)展提供了新的思路。

【Author contributions】Zhang RT peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article.Liu XC assisted in experiments performing.Ye W revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.