高效液相色譜非衍生法檢測食用油中的黃曲霉毒素B1 的含量

◎ 黃良江

（來賓市檢驗檢測中心，廣西 來賓 546100）

黃曲霉毒素是一種生物毒素物質(zhì)，主要由黃曲霉、寄生曲霉、特曲霉等真菌曲霉次生代謝產(chǎn)生，具有很強的生物毒性和致癌性，是國際上公認的一種具有強致癌性的物質(zhì)，WHO 將黃曲霉毒素劃定為一類致癌物?！妒称钒踩珖覙?biāo)準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）對各類食品中允許的黃曲霉毒素含量進行了規(guī)定，國家標(biāo)準中規(guī)定玉米油、花生油中黃曲霉毒素B1的限量為不得超過20 μg·kg-1，植物油脂中黃曲霉毒素B1的限量為不得超過10 μg·kg-1。

目前文獻報道的測定黃曲霉毒素B1含量的檢測方法比較多，通常采用的方法有高效液相色譜衍生化法[1]、三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]和酶聯(lián)免疫法[3]。三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀由于價格高，很多實驗室基于成本問題很難配備，液質(zhì)聯(lián)用法檢測費用也比較高，酶聯(lián)免疫法操作煩瑣。采用高效液相色譜法成本較低，操作方法比較簡單，但由于高效液相色譜法采用反相洗脫，會使黃曲霉毒素B1發(fā)生熒光效應(yīng)淬滅的問題，通常需要進行衍生化以增強其熒光效應(yīng)，故國家標(biāo)準和多數(shù)文獻[4-7]均采用衍生化法對黃曲霉毒素B1進行含量測定。而采用衍生化檢測黃曲霉毒素B1的含量必須配備衍生器，增加了檢測成本。為改良和探索新的簡便、可靠、低成本的檢測方法，本實驗探索建立高效液相色譜不連接衍生器直接測定黃曲霉毒素B1含量的新方法，為測定食用油中黃曲霉毒素B1的含量開發(fā)簡便、經(jīng)濟、可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油（批號SP001、SP002、SP003、SP004、SP005，購置于超市），黃曲霉毒素B1標(biāo)準品（1 mg，青島普瑞邦生物工程有限公司），乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，德國默克公司），NaCl 試劑（分析純，上海滬試有限公司），免疫親和柱（3 mL，北京博爾西科技有限公司），實驗用水均使用超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695 高效液相色譜儀（沃特世）、2475 熒光檢測器、電子天平（梅特勒）、離心機（德國西格瑪）和磁力攪拌器（德國海道夫）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱類型和規(guī)格：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相（V乙腈∶V甲醇=50 ∶50）∶B相（水）=35 ∶65；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測器波長：熒光激發(fā)波長366 nm，發(fā)射波長436 nm；洗脫方式：等度洗脫。

1.3.2 標(biāo)準溶液的制備

稱取黃曲霉毒素B1標(biāo)準品1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈進行溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 的容量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成10 μg·mL-1的標(biāo)準品儲備溶液（1 號標(biāo)準液）。準確移取1 號標(biāo)準液1 mL 于50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成200 ng·mL-1的標(biāo)準工作液（2 號標(biāo)準液）。準確移取2 號標(biāo)準液100 μL于20 mL 容量瓶，用初始流動相定容至刻度，配制成濃度為1.0 ng·mL-1標(biāo)準工作液（3 號標(biāo)準液）。同理，用2 號標(biāo)準液配制出濃度為5.0 ng·mL-1（4 號標(biāo)準液）、15.0 ng·mL-1（5 號 標(biāo) 準 液）、30.0 ng·mL-1（6 號 標(biāo)準液）、50.0 ng·mL-1（7 號標(biāo)準液）的系列標(biāo)準工作液。

1.3.3 樣品溶液的制備

取花生油樣品適量，稱取樣品約5 g，準確稱量，置于250 mL 錐形瓶，稱取NaCl 試劑3 g 加入錐形瓶中，再準確量取75 mL 濃度為70%甲醇溶液倒入錐形瓶，以20 000 r·min-1的攪拌速度高速攪拌樣品3 min，再將攪拌后的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，以5 000 r·min-1的速度高速離心10 min，精密移取離心后的上清液15 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻，將搖勻后的上清液轉(zhuǎn)移至離心管，再以5 000 r·min-1的速度離心10 min，離心后再精密吸取上清液20 mL，注入免疫親和柱進行分離，過柱流速為1 mL·min-1，待過柱完成后用20 mL 蒸餾水進行洗脫，讓空氣完全進入免疫親和柱中，將水?dāng)D出柱子，棄去洗脫液，再用適量色譜甲醇進行洗脫，用2 mL 容量瓶收集洗脫下來的洗脫液，用色譜甲醇定容至刻度，充分搖勻后用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，接取濾液于進樣瓶中，待上機用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

將空白溶劑、樣品溶液和標(biāo)準品溶液分別進樣，非衍生法分析條件下，空白試劑不干擾黃曲霉毒素B1的檢測。標(biāo)準品溶液和樣品溶液色譜圖如圖1、圖2所示。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍

取黃曲霉毒素B1標(biāo)準品適量，分別配制成濃度為1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、15.0 ng·mL-1、30.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標(biāo)準品溶液，分別進樣20 μL，以標(biāo)準品濃度為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為標(biāo)準品積分出的峰面積，繪制濃度與峰面積的標(biāo)準曲線。黃曲霉毒素B1的線性方程為Y=94 862.08X-18 268.81，相關(guān)系數(shù)r=0.999 997，黃曲霉毒素B1在1.0 ～50.0 ng·mL-1線性良好。

2.2.2 檢出限和定量限

依據(jù)國標(biāo)GB 5009.22—2016，當(dāng)稱取樣品5 g 時，黃曲霉毒素B1的檢出限和定量限分別為0.03 μg·kg-1、0.1 μg·kg-1，檢出限和定量限換算為濃度單位分別為0.075 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1。本實驗分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比作為方法檢出限和定量限，將低濃度對照品逐級稀釋后進樣分析，當(dāng)信噪比（S/N）約為3.0 時測 得 方法檢 出 限為0.03 ng·mL-1，當(dāng)S/N 約為10.0 時測得方法定量限為0.1 ng·mL-1。本方法測得的方法檢出限和方法定量限均小于標(biāo)準規(guī)定的檢出限和定量限，實驗表明本方法的靈敏度能滿足要求。

2.2.3 精密度

取 濃 度 為5.0 ng·mL-1的 標(biāo) 準 溶 液 以20 μL 進樣量連續(xù)6 針重復(fù)進樣，考察儀器的精密度。6 次進樣的保留時間分別為32.015 min、32.011 min、32.013 min、32.003 min、32.008 min 和32.012 min，保留時間RSD 為0.01%，峰面積分別為461 021、461 333、460 838、460 998、461 003、461 219，峰 面積RSD 為0.04%，保留時間RSD ＜0.2%，峰面積RSD ＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率

稱取已測知含量的花生油樣品約5 g，精密稱定。分別精密加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準品50 ng、75 ng、250 ng，按照1.3.3 項下的制備方法制備低、中、高3 種濃度的樣品溶液共9 份，每份樣品以20 μL 進樣注入高效液相色譜測定黃曲霉毒素B1的含量，計算每份樣品的加標(biāo)回收率。實驗測得低、中、高3 種添加水平的樣品的平均加標(biāo)回收率分別為98.3%、101.5%、99.4%，加標(biāo)回收率在標(biāo)準規(guī)定的70%～125%，表明該方法的準確度良好，結(jié)果見表1。

表1 3 種添加水平下加標(biāo)回收率測定結(jié)果表

2.3 樣品測定

本實驗對批號為SP001、SP002、SP003、SP004和SP005 的5 批次樣品分別采用非衍生法和柱后衍生法進行對比測定，結(jié)果如表2 所示。取樣品溶液進樣20 μL，兩種方法測定時，SP001、SP002、SP003、SP004 樣品均未檢出黃曲霉毒素B1，SP005 樣品非衍生法測得含量為10.63 μg·kg-1，柱后衍生法測得含量為10.98 μg·kg-1，相對標(biāo)準偏差為3.24%，兩種方法檢測結(jié)果沒有顯著差異。5 批次食用油樣品中黃曲霉毒素B1的含量均符合國家標(biāo)準中該產(chǎn)品項下對黃曲霉毒素B1的限量要求，即黃曲霉毒素B1不大于20 μg·kg-1。

表2 5 批次樣品黃曲霉毒素B1 測定結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜非衍生化方法對食用油樣品中的黃曲霉毒素B1含量進行分析檢測，探索樣品經(jīng)過免疫親和柱凈化處理后，采用高效液相色譜非衍生化方法對食用油進行黃曲霉毒素B1含量檢測的可行性。通過方法學(xué)考察了該方法的檢出限、定量限、線性范圍、精密度和加標(biāo)回收率，并對食用油進行了實際樣品的檢測分析，結(jié)果表明該方法的檢出限、定量限、靈敏度均滿足黃曲霉毒素B1含量測定的要求，可以用于食用油中黃曲霉毒素B1含量的檢測。該方法簡便、經(jīng)濟、可靠，可作為食用油中黃曲霉毒素B1含量檢測的參考方法。