畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑檢測能力驗證總結(jié)與分析

◎ 韓 嬌，劉元長，王夢云，錢 章，李 瑩，董文婷

（1.武漢譜尼科技有限公司，湖北 武漢 430000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心（武漢），湖北 武漢 430000）

為提高質(zhì)量控制及管理水平，維持檢測能力，檢驗檢測機(jī)構(gòu)每年都會參加多項能力驗證工作[1-4]。本文以湖北省農(nóng)業(yè)廳2021—2022 兩個年度組織的畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑檢測能力驗證[5]為例，從實際檢測過程中遇到的問題入手，對能力驗證中的前期準(zhǔn)備、技術(shù)細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)傳遞進(jìn)行總結(jié)，分析做好畜禽產(chǎn)品能力驗證的經(jīng)驗及關(guān)鍵點。

1 實際檢測中遇到的問題

1.1 萊克多巴胺回收率不穩(wěn)定

2021 年度，進(jìn)行豬肉中β-受體激動劑檢測預(yù)實驗時，萊克多巴胺回收率不穩(wěn)定。選取豬肉樣品，進(jìn)行4 個不同添加量的加標(biāo)實驗（n=3），按照《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 22286—2008）進(jìn)行檢測，沙丁胺醇和克倫特羅的平行性和回收率符合要求，而萊克多巴胺的回收率不穩(wěn)定，回收率的RSD 數(shù)據(jù)見表1。

表1 沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺不同添加量下回收率的RSD 表（n=3）

表1中的方法是內(nèi)標(biāo)法定量，而萊克多巴胺的內(nèi)標(biāo)是沙丁胺醇-D3，由克倫特羅和沙丁胺醇的數(shù)據(jù)可知，前處理本身沒有問題，因此萊克多巴胺回收率不穩(wěn)定可能是內(nèi)標(biāo)的影響。再次實驗，三者分別采用自己的同位素內(nèi)標(biāo)定量，同一個濃度點的數(shù)據(jù)平行性良好，回收率穩(wěn)定。三者回收率的RSD 數(shù)據(jù)見表2。

表2 沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺不同添加量下回收率的RSD 表（n=3）

由表1、表2 的實驗數(shù)據(jù)對比可知，進(jìn)行獸藥多殘留檢測時，內(nèi)標(biāo)的影響較大，用藥物本身的同位素內(nèi)標(biāo)定量最為準(zhǔn)確[6]。很多藥物參考之前的舊標(biāo)準(zhǔn)采取同一種內(nèi)標(biāo)定量，大部分是因為很多物質(zhì)沒有同位素內(nèi)標(biāo)[7]，目前同位素內(nèi)標(biāo)的種類越來越多，檢測時可以添加多種同位素內(nèi)標(biāo)[8]。

1.2 配標(biāo)過程

在進(jìn)行2021 年的能力驗證時，因預(yù)實驗反復(fù)多次，回收率良好，直接對盲樣進(jìn)行檢測。前處理過程順利，上機(jī)后，三者的標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性，所有的樣品空白、盲樣、質(zhì)控樣及標(biāo)樣目標(biāo)峰響應(yīng)一致，無內(nèi)標(biāo)。經(jīng)反復(fù)確認(rèn)，這是因為配標(biāo)過程中外標(biāo)標(biāo)簽和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)簽貼反，導(dǎo)致工作人員把外標(biāo)誤當(dāng)成內(nèi)標(biāo)加入到考核樣中，屬于人為失誤[9-10]。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，添加15 μg·kg-1的混標(biāo)，陰性基質(zhì)空白和考核樣中沙丁胺醇都在15 μg·kg-1左右，確認(rèn)沙丁胺醇未添加；至于克倫特羅和萊克多巴胺，減去加入外標(biāo)的量，推算考核樣的大概添加范圍，重新在豬肉樣品中加標(biāo)，模擬考核樣的添加量，用內(nèi)標(biāo)法定量確認(rèn)。最終上報結(jié)果3.72 μg·kg-1，考核樣添加量4 μg·kg-1，結(jié)果較滿意。

2 做好畜禽產(chǎn)品的能力驗證

根據(jù)多次參加能力驗證的經(jīng)驗，對做好畜禽產(chǎn)品的能力驗證進(jìn)行總結(jié)，最關(guān)鍵的工作是日常的實驗室質(zhì)量控制。而實驗室質(zhì)量控制貫穿檢測活動的全部環(huán)節(jié)，人、機(jī)、料、法和環(huán)五大因素環(huán)環(huán)相扣，其中“人員”是貫穿檢測各個環(huán)節(jié)的關(guān)鍵因素，檢測人員的技術(shù)水平、能力和經(jīng)驗直接決定了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.1 前期準(zhǔn)備

2.1.1 正確利用能力驗證工作通知

在能力驗證開始之前，省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳一般會提前1 ～2 個月發(fā)布能力驗證工作通知，通知包括組織能力驗證工作的時間、考核的基質(zhì)和項目、推薦的方法、能力驗證結(jié)果上報時間以及結(jié)果判定方式。在收到此通知時，根據(jù)考核時間、項目和推薦方法，有序進(jìn)行人、機(jī)、料、法和環(huán)五大因素的核查準(zhǔn)備工作。

（1）人員。選擇有經(jīng)驗的分析人員，具備獸藥殘留痕量檢測的操作意識、嫻熟的操作技能、良好的操作習(xí)慣，清楚影響回收率的關(guān)鍵控制步驟。

（2）儀器。選擇靈敏度、重現(xiàn)性等性能指標(biāo)滿足檢測方法要求的液質(zhì)聯(lián)用儀，且通過校準(zhǔn)、清洗離子源，根據(jù)調(diào)諧報告判斷毛細(xì)管是否有污染，最終調(diào)整儀器狀態(tài)至最佳。盡量選擇新開封的色譜柱，保證柱效。大型精密儀器日常檢測盡量專人專用、專人管理。

（3）物料。根據(jù)通知考核的基質(zhì)、項目以及推薦方法，核查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尤其是同位素內(nèi)標(biāo)，能力驗證建議采納進(jìn)口、證書信息齊全、固體粉末狀的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，一般首選Dr.公司的固標(biāo)。試劑、器具等耗材，需要再次確認(rèn)是通過驗收且滿足實驗要求的，避免出現(xiàn)污染或者吸附目標(biāo)化合物。

（4）方法。按照能力驗證推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法農(nóng)業(yè)部1025 號公告-18—2008 制定實驗方案，將方法性能優(yōu)化至最佳；若未指定檢測方法，選用本實驗室日常熟悉的檢測方法。

（5）環(huán)境。環(huán)境管理方面，最重要的是常量分析與痕量分析區(qū)域、檢測設(shè)備、實驗器具應(yīng)相對隔離，避免交叉污染。這個工作重在日常，能力驗證的時候需特別注意，以免污染盲樣。

2.1.2 預(yù)實驗

對五大因素核查完畢后，按照CATL 能力驗證鮮樣加標(biāo)的模式開展預(yù)實驗。選取同品種考核基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)量一般在檢出限、2 倍檢出限、5 倍檢出限，每個濃度點3 個平行樣，冷凍保存，預(yù)實驗的次數(shù)可參考日常的回收率決定。

2.2 技術(shù)細(xì)節(jié)

技術(shù)細(xì)節(jié)貫穿于五大因素的各個環(huán)節(jié)，緊密相連，不分別討論，僅從經(jīng)驗中總結(jié)重要細(xì)節(jié)。

2.2.1 明確作業(yè)指導(dǎo)書的要求

每個能力驗證計劃的作業(yè)指導(dǎo)書都有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義，一定要仔細(xì)通讀作業(yè)指導(dǎo)書，明確檢測注意事項和結(jié)果上報的時限及要求，有疑問及時與組織單位進(jìn)行溝通。例如，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑能力驗證樣品，是稱好的鮮樣直接進(jìn)行加標(biāo)，不能分取。而有的機(jī)構(gòu)不熟悉制樣流程，也沒有仔細(xì)研讀作業(yè)指導(dǎo)書，為了多做兩次進(jìn)行分取，導(dǎo)致結(jié)果不滿意；樣品不能分取，但是樣品提取液可以先稱取質(zhì)量，按質(zhì)量進(jìn)行分取，開展二次試驗確認(rèn)；另外，藥物屬于外部添加，不需要酶解；標(biāo)準(zhǔn)方法是外標(biāo)法定量，但是作業(yè)指導(dǎo)書上明確寫了建議同位素內(nèi)標(biāo)法定量，這些要求與檢測標(biāo)準(zhǔn)不一致，需按作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時一定要折算單體、純度；標(biāo)準(zhǔn)溶液盡量不要用純有機(jī)溶劑稀釋使用，否則易揮發(fā)引起體積不準(zhǔn)確，造成溶劑效應(yīng)。此外，配標(biāo)一定要雙人配標(biāo)，一人配標(biāo)，一人監(jiān)督全過程，并做好相應(yīng)記錄。

進(jìn)行獸殘能力驗證時，建議使用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍非常重要，最低點為檢出限濃度的1/2 最為恰當(dāng)，但是這個要根據(jù)儀器的靈敏度而定；濃度點不少于5 個點，相關(guān)系數(shù)盡量在0.999 以上。初次實驗后根據(jù)樣品濃度調(diào)整線性范圍，盡量讓測定濃度落在中間，內(nèi)標(biāo)的峰面積盡量接近中間點的峰面積，這樣定量更為準(zhǔn)確。

2.2.3 樣品前處理及質(zhì)控樣品的設(shè)置

提前準(zhǔn)備空白基質(zhì)，設(shè)置陰性對照和陽性對照；陽性對照添加藥物種類要和考核項目一致，添加濃度在未知情況下，可以按照限量使用的藥物和禁用藥物分別設(shè)計，進(jìn)行幾組不同濃度的添加量。質(zhì)控樣品至少包括試劑空白1 個、樣品空白1 個、陽性添加3 個。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年來畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑能力驗證的結(jié)果統(tǒng)計，禁用藥物添加量一般不會超過10 μg·kg-1?？己酥行囊话闶翘崆耙惶旒訕?biāo)，然后通知考核機(jī)構(gòu)去領(lǐng)取樣品。建議模擬考核流程，提前一天加標(biāo)，第2 天解凍，與盲樣同步開展實驗，保持同步性。

2.2.4 避免交叉污染

整個實驗的前處理過程及儀器測定過程都應(yīng)該避免交叉污染，因能力驗證樣品均為陽性樣品，前處理濃縮時，兩個樣品之間用空白提取溶劑清洗旋蒸儀整個管路或者氮吹儀的導(dǎo)氣針，避免交叉污染，見圖1；儀器測定時進(jìn)樣序列的設(shè)計如圖2，必須在陽性樣品間穿插試劑空白，避免污染。

圖1 避免交叉污染環(huán)節(jié)圖

圖2 進(jìn)樣序列設(shè)計圖

2.3 數(shù)據(jù)傳遞

上報數(shù)據(jù)前，明確有效數(shù)字的保留要求，按照時限要求上報。原始記錄至少要求包含樣品名稱、樣品編號、檢驗項目、檢驗依據(jù)、檢驗日期、環(huán)境條件、標(biāo)準(zhǔn)溶液相關(guān)信息、前處理過程、儀器相關(guān)信息（儀器型號、色譜柱、流動相、流速以及進(jìn)樣體積等）以及圖譜等基本信息，重視原始記錄的溯源性和規(guī)范性。

畜禽產(chǎn)品中β-受體激動劑能力驗證判定依據(jù)是定性準(zhǔn)確，回收率在70%～120%。根據(jù)日常檢測水平及本次質(zhì)控樣的回收率，確認(rèn)上報數(shù)據(jù)是否按照回收率校正。一般藥物殘留不建議按回收率校正，但若回收率偏低或偏高，檢測過程肯定存在不容忽視的問題，不可視而不見。

3 結(jié)語

本文以豬肉中β-受體激動劑檢測為例，對遇到的問題及解決方案進(jìn)行歸納，對做好能力驗證的流程進(jìn)行總結(jié)，并明確日常實驗室質(zhì)量控制的重要性，而人員是重中之重。檢測機(jī)構(gòu)可以選擇檢測經(jīng)驗豐富、操作熟練的技術(shù)骨干成立能力驗證考核小組，最大程度地保證考核結(jié)果滿意。因每年考核項目不一樣，所以日常檢測回收率不合格的項目，要查閱相關(guān)文獻(xiàn)，與同行多交流，保證回收率。只有充分準(zhǔn)備、防止污染、記錄嚴(yán)謹(jǐn)，才能保證能力驗證滿意率，提高檢測能力。