箭葉淫羊藿種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究

侯文川, 楊林林, 初雷霞, 董 寧, 杜真輝, 鐘 華, 董誠明

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 鄭州 450046;2.河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心, 鄭州 450046;3.河南省平輿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 河南 平輿 463400)

箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.]是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物,主要分布于湖南、安徽、河南等省,以葉入藥,為我國傳統(tǒng)中藥材淫羊藿的基原之一[1]。淫羊藿具有抗炎、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[2],在醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3],是最具開發(fā)潛力和市場潛力的中藥之一。隨著市場需求量的不斷增大,箭葉淫羊藿人工栽培面積逐年攀升。目前在河南省豫南地區(qū)已經(jīng)形成較大規(guī)模人工種植基地,其中駐馬店市種植面積為266.67 hm2,年產(chǎn)量在400 t以上。

種子是中藥材生產(chǎn)的源頭,優(yōu)良的種子是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)中藥材的先決條件[4],開展種子質(zhì)量檢驗(yàn)研究不僅是保證中藥材質(zhì)量安全穩(wěn)定的前提,更是規(guī)范化生產(chǎn)急需解決的重要問題[5-7]。箭葉淫羊藿繁殖方式主要包括根莖分蘗和種子繁殖[8]。因箭葉淫羊藿種子結(jié)實(shí)率低,具有休眠特性[9],所以實(shí)際生產(chǎn)多以根莖分蘗為主,但長期的無性繁殖會(huì)導(dǎo)致種性退化,病蟲害頻發(fā),因此種子繁殖技術(shù)研究迫在眉睫。研究表明淫羊藿屬植物種子普遍存在休眠現(xiàn)象,究其原因是胚形態(tài)后熟和發(fā)芽抑制物的存在,而低溫和激素處理能促進(jìn)胚成熟、解除休眠、加快萌發(fā)[10-12]。目前關(guān)于箭葉淫羊藿種子研究主要集中在促進(jìn)萌發(fā)和提高結(jié)實(shí)率等方面,尚未見到箭葉淫羊藿種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究。

本試驗(yàn)參考農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程,從含水量、生活力、發(fā)芽率等方面進(jìn)行種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究,為箭葉淫羊藿種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù),為擴(kuò)大種植生產(chǎn)和提高種子的流通奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為河南省駐馬店市平輿縣箭葉淫羊藿規(guī)范化種植基地提供的當(dāng)年種子,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.)種子。

1.2 儀器和試劑

RTOP-430 D智能人工氣候培養(yǎng)箱(浙江托普儀器有限公司);SMZ-171體視顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);LDZM-80 KCS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

紅四氮唑(分析純)(上海山浦化工有限公司);赤霉素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);脫落酸(北京索萊寶科技有限公司);白菜種子(臨朐縣天和種業(yè)有限公司)。

2 方 法

2.1 種子真實(shí)性鑒定

隨機(jī)數(shù)取種子100粒,重復(fù)3次,逐一觀察種子的形狀、顏色、表面構(gòu)造等特征,測量橫徑與縱徑,并縱剖成熟種子觀察、記錄,計(jì)算胚率。

2.2 千粒重測定

分別用百粒法、五百粒法及千粒法測定,具體操作如下:隨機(jī)取100、500、1 000粒凈種子,稱重,并分別重復(fù)8、6、3次,記錄重量。計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

2.3 含水量測定

隨機(jī)取2份種子,每份2.5 g,分別用低恒溫法[(105±2)℃]和高恒溫法[(130±2)℃]測定含水量。分別于1、2、3、4、5、6、7、8、16 h和1、2、3、4、5、6 h計(jì)算種子水分損失量,重復(fù)3次。

2.4 種皮透水性測定

隨機(jī)取100粒種子,稱定重量。置于蒸餾水中在25 ℃恒溫條件下,每隔1 h取出,用吸水紙吸干表面水分后,稱重,直至連續(xù)2次測定值接近恒重為止。重復(fù)3次,計(jì)算吸水率并繪制吸水曲線。

吸水率/%=[(W1-W)/W]×100%,式中,W1為吸水后重量,W為吸水前重量。

2.5 生活力測定

采用TTC染色法,用pH值為6.5～7.5的緩沖液分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的TTC溶液,避光保存。種子在蒸餾水中浸泡8 h后沿種胚縱切,暴露胚,于25 ℃下分別染色1、2、3、4 h后,沖洗3～5次,觀察、記錄種子染色情況,計(jì)算生活率。重復(fù)3次,每次取種子100粒。

2.6 種子發(fā)芽最適條件

2.6.1適宜的發(fā)芽床

種子經(jīng)75%酒精消毒2 min后,分別置于高溫滅菌過的沙床、紙床、脫脂棉3種發(fā)芽床上。在溫度設(shè)定為15 ℃培養(yǎng)90 d后轉(zhuǎn)至4 ℃的培養(yǎng)箱中發(fā)芽,每隔20 d觀察記錄種子霉變情況。3次重復(fù),每次100粒種子。

2.6.2適宜的種子破眠溫度

取1 000粒種子拌于沙床中,置于4 ℃、15 ℃、25 ℃黑暗恒溫下進(jìn)行試驗(yàn)。每隔7 d攪拌翻動(dòng)以保持通風(fēng)并及時(shí)補(bǔ)充水分。每隔20 d,隨機(jī)抽取15粒種子,于體視解剖鏡下觀察不同層積階段種胚生長發(fā)育狀況,測定胚長、胚乳長,并計(jì)算胚率,3次重復(fù)。

胚率/%=(胚長/胚乳長)×100%。

2.6.3適宜的種子破眠激素處理

選擇外源激素赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA),分別設(shè)置不同濃度:

GA3:100 mg/L、200 mg/L;

ABA:50 mg/L、100 mg/L。

圖1 箭葉淫羊藿種子表面構(gòu)造Fig.1 Surface structure of E. sagittatum seeds

種子處理方式為浸泡8 h和種胚達(dá)到魚雷期后,以噴施形式保濕兩種。設(shè)計(jì)以蒸餾水處理為空白對照的9個(gè)處理組(表1),篩選最適破眠激素處理。

表1 種子破眠激素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Seed sleep hormone trial design

2.6.4發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

破眠處理后種子出現(xiàn)出芽時(shí),即可進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。在15 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,光照12 h/d,每處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)150粒種子,以伸出子葉為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),于第16天測定其發(fā)芽率。

3 結(jié) 果

3.1 種子基本形態(tài)

箭葉淫羊藿種子為腎狀長圓形,飽滿,外種皮呈現(xiàn)黑色有褶皺紋理,內(nèi)種皮呈現(xiàn)紅褐色光亮不皺縮或皺縮,種臍明顯,種孔與種臍位于同一部位,形成倒生胚珠,具有瘤狀突起的種阜;種子的外部形態(tài)變化不大,經(jīng)測定,箭葉淫羊藿種子橫徑為(1.643±0.169)mm,縱徑為(4.728±0.388)mm(圖1);種子成熟時(shí),其胚率較低,為2.63%,存在明顯的形態(tài)休眠。

3.2 千粒重測定

由表2可知,3種方法變異系數(shù)均小于4.0%。將百粒法與五百粒法測定的種子重量換算為千粒重,結(jié)果分別為:(3.080 3±0.040 8)g、(3.036 6±0.096 9)g、(3.062 8±0.042 1)g。進(jìn)行方差分析,3種方法不存在顯著差異,故可用百粒法測定千粒重。

表2 箭葉淫羊藿種子重量測定Table 2 Determination results of seed weight of E. sagittatum

3.3 含水量測定

箭葉淫羊藿種子含水量測定結(jié)果見表3,使用高恒溫法(130±2)℃和低恒溫法(105±2)℃烘干1 h后,水分含量無顯著變化。但高恒溫法所測得含水量較高,為31.07%,且連續(xù)5 h無變化,因此選擇高恒溫法(130±2)℃烘干1 h檢測箭葉淫羊藿種子含水量。

表3 低溫法、高溫法測定箭葉淫羊藿種子含水量Table 3 Water content determination of E. sagittatum seeds by low temperature method and high temperature method

3.4 種皮透水性測定

箭葉淫羊藿種子最終吸水率為58.52%。吸水過程可分為3個(gè)時(shí)期:快速吸水期(0～1 h)、緩慢吸水期(1～8 h)和近飽和期(8～10 h)(見圖2)。種子吸水結(jié)束后,種皮的顏色加深,種皮吸水而軟化。

表4 TTC法測定箭葉淫羊藿種子活力Table 4 Seed vigor of E. sagittatum determined by TTC method

3.5 生活力測定

由表4可知,染色1 h,各處理染色情況無顯著差異,表現(xiàn)為不能染色;0.1%的TTC溶液染色2 h、3 h、4 h,染色率顯著低于其他處理;染色2 h時(shí)0.5%、1.0%或1.5%濃度的TTC溶液染色情況無顯著差異,且染色均勻,染色效果好?？紤]TTC溶液的毒性,箭葉淫羊藿種子生活力測定采用0.5%TTC溶液染色2 h即可(判定標(biāo)準(zhǔn):有生活力的種子——胚和胚乳完全染色或胚完全染色,胚乳一半以上染色;無生活力的種子——胚未染色,胚乳染色或未染色;胚染色,胚乳一半或一半以上未染色)。

圖2 箭葉淫羊藿種子吸水曲線Fig. 2 Water absorption curve of E. sagittatum seeds

3.6 種子發(fā)芽最適條件

3.6.1適宜的發(fā)芽床

紙床,脫脂棉的發(fā)芽床上霉變種子從第9天開始出現(xiàn)并增多,在第60天霉變率達(dá)90%以上;而沙床的種子偶見霉變,因此以沙床進(jìn)行種子處理實(shí)驗(yàn)。

3.6.2適宜的溫度處理

由圖3可見,在恒溫處理140 d內(nèi),25 ℃處理下種子胚率顯著低于15 ℃及4 ℃處理;15 ℃處理下種子的胚率逐漸上升,20～40 d種子胚率上升較快,在80 d之前,胚率一直顯著高于其他處理;4 ℃處理下,種子在40 d后胚率快速增長,在140 d時(shí)胚率達(dá)到66.18%,發(fā)芽盒內(nèi)種子已出芽。在140 d時(shí)對4 ℃處理種子進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn),第16天其發(fā)芽率達(dá)到46.67%。

圖3 不同溫度恒溫處理下胚率變化Fig.3 Changes of embryo rate under different temperature and constant temperature treatment

3.6.3適宜的激素處理和發(fā)芽率

不同激素處理對箭葉淫羊藿種子破眠影響不同。在層積時(shí)間為80 d時(shí),處理5、處理6、處理7發(fā)芽,且胚率最高,分別為70.69%、69.25%、79.34%,此時(shí)處理1(對照組)的胚率為53.88%。而處理8、處理9在層積100 d時(shí)發(fā)芽,處理1～處理4均在120 d發(fā)芽。

對發(fā)芽的處理組進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。對9組處理按照綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行計(jì)算,綜合評(píng)價(jià)。對層積時(shí)長及發(fā)芽率分別賦予0.5的權(quán)重系數(shù),公式如下:

OD=(0.5×amax/ai+0.5×bi/bmax)×100,式中i指第i個(gè)實(shí)驗(yàn)處理;max指該指標(biāo)項(xiàng)下最大值。結(jié)果見表5。

由表5可以看出,處理7的OD值為1.22,綜合得分最高,層積時(shí)間為80 d,發(fā)芽率最高。因此箭葉淫羊藿種子發(fā)芽試驗(yàn)的最適處理為:種子在蒸餾水中浸泡8 h,置沙床于4 ℃黑暗培養(yǎng)至魚雷期后,噴施200 mg/L GA3保濕。此處理80 d后種子出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象,96 d后發(fā)芽率為82.67%。

表5 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Comprehensive evaluation results

4 討 論

種子作為基本生產(chǎn)資料,是中藥材安全生產(chǎn)的基礎(chǔ)。優(yōu)質(zhì)種子對中藥材提高產(chǎn)量、穩(wěn)定質(zhì)量起關(guān)鍵作用[13]。隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大,中藥材種子產(chǎn)業(yè)市場發(fā)展迅速,目前三七[14]、人參[15]等種子已發(fā)布國際標(biāo)準(zhǔn),這對中藥材種子規(guī)范起到了引領(lǐng)作用,但與農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程相比,中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制還相對落后。箭葉淫羊藿與其他4種入藥典淫羊藿屬藥用植物,在湖北、河南等地已經(jīng)形成較大規(guī)模種植基地,但尚未見過其種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的相關(guān)報(bào)道,這與其種子萌發(fā)困難、休眠特性及繁育周期長等特點(diǎn)有很大關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn),箭葉淫羊藿種子自然成熟時(shí)種胚尚未完全發(fā)育成熟,胚率較低,有明顯的形態(tài)生理休眠,這與田向榮等[9]的研究結(jié)果一致。除此之外,筆者對其種子內(nèi)抑制物進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),箭葉淫羊藿種子水提物及醇提物對白菜種子發(fā)芽率及根長均有抑制作用,且抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng),說明箭葉淫羊藿種子[9]與巫山淫羊藿[10-11]、朝鮮淫羊藿[12]種子相似,內(nèi)含萌發(fā)抑制物。

種子的萌發(fā)和休眠是植物生命周期中具有重要農(nóng)藝和生態(tài)意義的關(guān)鍵組成部分[16]。溫度是種子在發(fā)育過程中影響萌發(fā)的最重要因素[17],水分吸收是啟動(dòng)種子萌發(fā)的關(guān)鍵觸發(fā)因素[18]。ABA和GA3是兩種主要的拮抗植物激素,兩種激素的合成和分解動(dòng)態(tài)平衡是促進(jìn)種子萌發(fā)和休眠平衡的關(guān)鍵,決定種子的萌發(fā)能力[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,4 ℃低溫層積和GA3激素處理種子,可將種子發(fā)芽時(shí)間縮短至80 d左右,96 d后發(fā)芽率為82.67%。

在種子檢驗(yàn)的各項(xiàng)指標(biāo)中,發(fā)芽率最為重要,可直接反映種子出苗率;千粒重和生活力可以間接反映種子的萌發(fā)潛力;種皮透水性直接反映種子是否存在種皮吸水障礙,含水量與千粒重、發(fā)芽率等密切相關(guān)。本研究設(shè)置以上指標(biāo),旨在對箭葉淫羊藿種子進(jìn)行科學(xué)合理的檢驗(yàn),為淫羊藿屬藥用植物種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法和參考,為提高種子繁育專業(yè)化水平奠定基礎(chǔ)。