• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胡蘿卜果膠桿菌侵染下半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息分析

    2023-05-19 01:57:14舒福興王馨瑤袁碧霞保正娟羅清清陳集雙
    種子 2023年2期
    關(guān)鍵詞:軟腐病基元果膠

    舒福興, 黃 瑤, 賈 啟, 王馨瑤, 唐 瀅,袁碧霞, 保正娟, 羅清清, 陳集雙

    (1.遵義醫(yī)科大學(xué)生物資源健康利用研究中心, 貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院臨床學(xué)院, 貴州 遵義 563000)

    半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit)屬于天南星科半夏屬草本植物,具有止咳、降逆止嘔、抗腫瘤等作用[1]。半夏主要分布于南亞地區(qū),在中國主要分布于貴州、甘肅、河北等地[2]。由于半夏原生環(huán)境持續(xù)惡化以及被無節(jié)制挖掘,致使野生半夏資源減少,品種、數(shù)量均急劇下降。盡管多地進(jìn)行了半夏人工種植,但面積依然不夠大,并且面臨半夏軟腐病引起的絕收。研究表明,多種致病菌可引起半夏軟腐病,其中胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)最常見、致病性強(qiáng),接種20 h即可引起軟腐病癥狀[3]。因此,篩選半夏軟腐病抗病品種顯得尤為重要。而獲得軟腐病抗病半夏品種首先得找到可以鑒定抗病品種的輔助育種方法。

    簡單重復(fù)序列SSR(Simple Sequence Repeat),又稱微衛(wèi)星標(biāo)記,是一種廣泛分布于真核和原核生物基因組中,由1~6個核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列,其兩側(cè)是相同的基因組序列,但在非基因區(qū)域更頻繁地出現(xiàn)。其具有多態(tài)性高、重復(fù)性高、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn),廣泛運(yùn)用于遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助育種[4],尤其是在許多作物中,選擇數(shù)量性狀位點(diǎn)QTL作圖的標(biāo)記方法長期以來一直是SSR[5]。SSR的來源常用的有兩種:基因組SSR、轉(zhuǎn)錄組SSR(EST-SSR)[6-7]。最初的SSR標(biāo)記引物開發(fā)需要構(gòu)建DNA文庫,該過程步驟繁瑣、失敗率高、耗資大、工作量大[8]。EST-SSR則擯棄繁瑣的DNA建庫過程,通過轉(zhuǎn)錄組開發(fā)標(biāo)記引物,能夠直接反應(yīng)參與某一進(jìn)程轉(zhuǎn)錄基因信息。目前,NCBI中收錄的半夏EST序列較少,基于軟腐病菌侵染的半夏轉(zhuǎn)錄組信息更少,難以滿足SSR引物開發(fā)的需要。因此,本研究通過挖掘軟腐病菌胡蘿卜果膠桿菌侵染本團(tuán)隊(duì)特有的T 2+半夏品種,以獲得此條件下的半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息,為鑒別半夏軟腐病抗病品種提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)材料為組培條件下胡蘿卜果膠桿菌侵染的半夏嫩芽。胡蘿卜果膠桿菌為本團(tuán)隊(duì)保存,菌樣甘油保存于-80 ℃;T 2+半夏品種保留于遵義醫(yī)科大學(xué)生物資源健康利用研究中心組培室,培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx,光照時間12 h/d,培養(yǎng)溫度(25±1)℃。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    在恒溫?fù)u床中,利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)胡蘿卜果膠桿菌;培養(yǎng)溫度為28 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min;在波長為600 nm下測量菌液OD值,到0.6時停止培養(yǎng),取出搖床待用。采用同一批接種、長勢均一的半夏組培苗作為接種對象。實(shí)驗(yàn)設(shè)置0 h和20 h實(shí)驗(yàn)組,并在相應(yīng)時間點(diǎn)設(shè)對照組。試驗(yàn)組用半夏組培苗與5 mL胡蘿卜果膠桿菌培養(yǎng)液共培養(yǎng),每組重復(fù)3次;對照組采用半夏組培苗與5 mL LB培養(yǎng)基共培養(yǎng),每組重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2 000 lx,光照時間12 h/d,培養(yǎng)溫度(25±1)℃。分別采集各組半夏嫩芽立即投入液氮中速凍,利用提前液氮冷凍的凍存管裝好,埋在干冰中送往山東開源基因公司進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建及l(fā)lumina HiSeq X Ten平臺測序獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)生物信息學(xué)SSR位點(diǎn)分析軟件對轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)(Unigenes)進(jìn)行檢索和分析。參數(shù)設(shè)置參考蔣維昕等[9]的方法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的數(shù)量

    通過對半夏轉(zhuǎn)錄組中75 517條Unigene(總長度90 921 938 bp)進(jìn)行SSR分析獲得40 621個SSR,出現(xiàn)頻率為36.09%,分布于27 252條Unigene,這些Unigene的數(shù)量為總Unigenes數(shù)量的36.09%。其中,含有2個及以上SSR位點(diǎn)的Unigene有8 916條。含有復(fù)合型SSR位點(diǎn)的Unigene有4 969條。半夏轉(zhuǎn)錄組中,平均每2.24 kb序列就會出現(xiàn)1個SSR位點(diǎn),詳見表1。

    表1 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR基本信息Table 1 Basic information of SSR in the transcriptome of Pinellia ternata

    2.2 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元類型及占比

    半夏轉(zhuǎn)錄組具有單核苷酸至六核苷酸等多種SSR重復(fù)基元種類。不同SSR重復(fù)基元類型在數(shù)量上差異懸殊,基元類型較多的是單、二、三核苷酸重復(fù)。其中,二核苷酸重復(fù)類型有16 936個,數(shù)量最多,占總SSR數(shù)量的41.69%;單核苷酸重復(fù)類型有13 293個,排第二位,占總SSR數(shù)量的32.72%;三核苷酸重復(fù)類型有9 829個,排第三位,占總SSR數(shù)量的24.20%;其余基元重復(fù)類型所占比例較低,三者占總SSR數(shù)量之和的1.39%。總體上,含SSR位點(diǎn)的序列數(shù)量隨著核苷酸基元堿基數(shù)的增加逐漸變少。二核苷酸重復(fù)類型SSR的平均分布距離最小,為5.37 kb,五核苷酸重復(fù)類型SSR的平均分布距離最大,為1 466.48 kb,是二核苷酸重復(fù)類型平均分布距離的273.09倍,詳見表2。

    表2 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量及重復(fù)基元類型Table 2 Type and repeat motifs of SSR loci in the transcriptome of Pinellia ternata

    2.3 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元的堿基組成

    分析發(fā)現(xiàn),有40 621個SSR位點(diǎn)存在于半夏轉(zhuǎn)錄組中。這些SSR中一共發(fā)現(xiàn)106種重復(fù)基元類型。其中,單核苷酸至六核苷酸重復(fù)基元分別有2、4、10、25、28、37種。在所有SSR基元重復(fù)類型中,以AG/CT為堿基的基元重復(fù)類型為優(yōu)勢類群,占總SSR的30.93%;其次為單核苷酸重復(fù)基元,該重復(fù)類型中A/T基元占總SSR的29.72%。三核苷酸基元類型中,優(yōu)勢重復(fù)基元及占總SSR的比例分別為:CCG/CGG占比6.65%、AAG/CCT占比4.60%、AGG/CCT占比4.01%、AAG/CTT占比4.60%、其余四、五、六及其他核苷酸重復(fù)基元種類也比較豐富,但全部加起來僅占19.49%(詳見圖1)。

    圖1 半夏轉(zhuǎn)錄組中不同重復(fù)基元SSR的占比情況Fig.1 Percentage of SSRs with different repeats motifs in the transcriptome of Pinellia ternata

    2.4 半夏轉(zhuǎn)錄組中SSR的多態(tài)性分析

    2.4.1半夏轉(zhuǎn)錄組序列中SSR基元重復(fù)次數(shù)的分布

    分析半夏轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)發(fā)現(xiàn),基元重復(fù)次數(shù)的增加使不同類型核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量和比例逐漸下降(圖2和表3)。有37 008個SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)集中在5~20次,占總SSR數(shù)量的91.11%(表3)。其中,有25 478個低重復(fù)率(5~10次)SSR位點(diǎn),數(shù)量為總SSR數(shù)量的62.72%;中重復(fù)次數(shù)中,11~15次的SSR位點(diǎn)數(shù)為9 350個,占總SSR數(shù)量的23.02%,16~20次的SSR位點(diǎn)數(shù)為2 180個,占總SSR數(shù)量的5.37%。在SSR所有重復(fù)類型中,占比排列前三的依次為10次、6次、5次重復(fù)類型,分別有6 550、5 949、5 522個,各占SSR總數(shù)的16.14%、14.65%、13.59%。

    注:不同顏色代表不同重復(fù)單元次數(shù),帶有顏色的方框面積越大對應(yīng)的SSR數(shù)量越多。圖2 半夏轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of the SSR repeat types of the transcriptome of Pinellia ternata

    2.4.2半夏轉(zhuǎn)錄組高多態(tài)性SSR分析

    研究認(rèn)為,具有較高多態(tài)性的SSR序列的長度往往大于等于20 bp,具有這一特點(diǎn)的SSR可以成為首選標(biāo)記位點(diǎn);多態(tài)性適中的序列長度在12~20 bp之間;而SSR序列長度一旦小于12 bp,則多態(tài)性表現(xiàn)極低[10]。因此,本研究以此為依據(jù)分析高多態(tài)性的SSR數(shù)量及占比(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有12 521個SSR序列長度集中于12~20 bp,占SSR總數(shù)的30.82%;有4 006個SSR序列長度處于20~30 bp,占SSR總數(shù)的9.86%。 有3 754個SSR序列長度超過30 bp,占10.53%;共計(jì)有20.39%的SSR序列長度符合高多態(tài)性SSR的特征。此外,半夏轉(zhuǎn)錄組SSR序列的平均長度為2.24 kb,其中G/C單核苷酸類型具有最長重復(fù)片段為66 bp,其出現(xiàn)3次。

    表3 半夏轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)次數(shù)的SSR數(shù)量分布Table 3 SSR quantity distribution with different repetitions in transcriptome of Pinellia ternata

    圖3 半夏轉(zhuǎn)錄組不同長度SSR重復(fù)框的占比Fig.3 Proportion of SSR repeat fragments of different lengths in the transcriptome of Pinellia ternata

    3 討 論

    不同品種半夏呈現(xiàn)出的軟腐病抗病性有極大差異,有的表現(xiàn)為延遲發(fā)病,有的表現(xiàn)為易感病狀態(tài),還有的表現(xiàn)為抗病狀態(tài)。目前,唐曉晶[11]用ISSR-PCR方法鑒定半夏近緣混淆品種及多來源品種;張君毅[12]、楊旻[13]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析半夏遺傳多樣性;上述尋找SSR的方法比較傳統(tǒng),過程繁瑣信息不夠全面。之后,馬芃銳等[14]采用磁珠富集法獲得芍藥葉型半夏基因組序列841條,分析出SSR 406條,篩選出可以鑒定4種葉型半夏品種的引物7對。然而,在SSR挖掘數(shù)量以及可用性方面,磁珠法遠(yuǎn)不如轉(zhuǎn)錄組法。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟,多種植物已經(jīng)成功將其用于SSR開發(fā)[15-17]。因此,基于轉(zhuǎn)錄組信息分析半夏SSR分子標(biāo)記具有可行性。

    在以往的研究中,已有基于正常半夏轉(zhuǎn)錄組獲得SSR分子標(biāo)記的研究,例如王森等[15]在正常轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)14 468個SSR,分布于12 000條Unigene 中;劉丹等[16]在正常轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)半夏中含有SSR位點(diǎn)的Unigene有14 640條,有19 270個SSR位點(diǎn);這為半夏品種的鑒定打下基礎(chǔ)。然而,這些基于非軟腐病菌脅迫下的半夏轉(zhuǎn)錄組分析而來的SSR用于半夏軟腐病抗病品種篩選具有很大缺點(diǎn),例如: 1) 非軟腐病抗病相關(guān)的SSR在篩選軟腐病抗病品種過程中加大了分析工作量,甚至導(dǎo)致軟腐病抗病品種篩選的失敗; 2) 半夏未被軟腐病菌侵染時,某些抗病基因可能未發(fā)生轉(zhuǎn)錄,那么使用這種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR分析,可能會造成部分抗病相關(guān)的SSR遺失。為克服這些缺點(diǎn),本研究利用軟腐病致病菌(胡蘿卜果膠桿菌)侵染半夏T 2+,并獲得半夏T 2+的轉(zhuǎn)錄組信息,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析SSR信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在27 252條Unigene中找到40 621個SSR位點(diǎn),同時比較T 2+正常轉(zhuǎn)錄組中Unigene的數(shù)量(107 777個)發(fā)現(xiàn)[2],T 2+半夏在胡蘿卜果膠桿菌侵染下,轉(zhuǎn)錄組中的Unigene數(shù)量顯著降至75 517個,因此,利用本轉(zhuǎn)錄組篩選SSR用于抗軟腐病半夏品種育種將更具針對性及必要性;盡管本次T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)量顯著下降,但其SSR數(shù)量遠(yuǎn)高于王森等[15]和劉丹等[16]報(bào)道的SSR數(shù)量,這說明半夏品系之間轉(zhuǎn)錄組水平有極大的差異性,對其他半夏品種的EST-SSR研究也有必要。

    本研究中,T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組SSR基元重復(fù)類型種類多,出現(xiàn)的密度大,頻率高。在27 252條Unigene中找到符合條件的SSR位點(diǎn)40 621個,Unigene出現(xiàn)頻率為36.09%,這個頻率遠(yuǎn)高于王森等[15]報(bào)道的13.47%和劉丹等[16]報(bào)道的17.06%;也高于同屬天南星科的魔芋17.91%[18],造成這一差異的原因一方面可能是來自種屬之間的差異;另一方面可能是轉(zhuǎn)錄組收集到了正常轉(zhuǎn)錄組未收集到的含有SSR的Unigene。本研究中,SSR的平均距離為2.24 kb,高于王森等[15]報(bào)道的4.33 kb及劉丹等[16]報(bào)道的3.39 kb,說明本研究發(fā)現(xiàn)的SSR作為分子標(biāo)記具有很大潛力。

    半夏轉(zhuǎn)錄組中以單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)類型為SSR主要基元類型,這與劉丹等[16]報(bào)道的趨勢一致。SSR基元重復(fù)次數(shù)、序列片段長度決定了SSR的多態(tài)性。隨著SSR基元重復(fù)次數(shù)的增加,尤其是重復(fù)次數(shù)大于等于12次或者序列長度大于等于20 bp時將其開發(fā)為多態(tài)性標(biāo)記的潛力將大大提升[19]。本研究中的SSR重復(fù)單元次數(shù)主要集中在5~20次之間,占比約為91.11%,其中重復(fù)次數(shù)大于等于12次的SSR占總SSR的比例為26.33%,表明這些SSR位點(diǎn)具有較大開發(fā)潛力。

    總之,本研究利用胡蘿卜果膠桿菌侵染下的T 2+半夏轉(zhuǎn)錄組篩選出的SSR重復(fù)基元類型多,出現(xiàn)頻率高、密度大、其作為多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)的潛能大。這些SSR標(biāo)記將縮短半夏抗軟腐病品種選育的時間、增加半夏多樣性研究以及遺傳圖譜繪制的手段。

    猜你喜歡
    軟腐病基元果膠
    中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗細(xì)菌性軟腐病抗性基因
    關(guān)注基元反應(yīng)的考查
    從五種天然色素提取廢渣中分離果膠的初步研究
    河南周口水果市場上獼猴桃軟腐病主要病原真菌鑒定及防治研究
    中國果樹(2020年2期)2020-07-25 02:14:24
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    人體細(xì)胞內(nèi)存在全新DNA結(jié)構(gòu)
    伊犁地區(qū)蝴蝶蘭軟腐病病原體的分離與鑒定
    提取劑對大豆果膠類多糖的提取率及性質(zhì)影響
    不同氮、磷、鉀肥施用量對魔芋軟腐病的影響
    長江蔬菜(2014年22期)2014-12-08 08:57:12
    Numerical Modeling and Analysis of Gas Entrainment for the Ventilated Cavity in Vertical Pipe*
    国产片特级美女逼逼视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 大香蕉久久网| 这个男人来自地球电影免费观看| 日本wwww免费看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲熟女毛片儿| 少妇精品久久久久久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 男人舔女人的私密视频| 国产精品.久久久| 18在线观看网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 成人免费观看视频高清| 99香蕉大伊视频| 中国国产av一级| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 男女午夜视频在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 美女大奶头黄色视频| 各种免费的搞黄视频| 国产99久久九九免费精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲 国产 在线| 十八禁网站网址无遮挡| 99精品久久久久人妻精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲 国产 在线| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产在线免费精品| 亚洲国产av新网站| 精品国产国语对白av| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 中文欧美无线码| 多毛熟女@视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av线在线观看网站| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 操出白浆在线播放| 精品高清国产在线一区| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 成人国语在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产男女超爽视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在线观看免费高清a一片| 超碰97精品在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产免费又黄又爽又色| 晚上一个人看的免费电影| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 色94色欧美一区二区| 亚洲人成电影观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产麻豆69| av天堂久久9| 中文字幕高清在线视频| 又大又黄又爽视频免费| 大型av网站在线播放| 青草久久国产| 777米奇影视久久| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产av新网站| 久久影院123| 亚洲中文日韩欧美视频| 一级黄色大片毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美人与善性xxx| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费观看人在逋| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人免费观看mmmm| 成人影院久久| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av天堂在线播放| 人妻一区二区av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久视频综合| 91老司机精品| 亚洲一区中文字幕在线| 国产日韩欧美在线精品| kizo精华| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费不卡黄色视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 91九色精品人成在线观看| 久久精品久久久久久久性| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲图色成人| 国产主播在线观看一区二区 | 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品自拍成人| bbb黄色大片| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲国产欧美网| 亚洲欧美激情在线| 涩涩av久久男人的天堂| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久99一区二区三区| bbb黄色大片| 国产99久久九九免费精品| 欧美精品亚洲一区二区| 韩国精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 两个人免费观看高清视频| 在线观看一区二区三区激情| 丝袜在线中文字幕| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲欧美清纯卡通| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩av久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一本综合久久免费| 一级毛片我不卡| 午夜免费鲁丝| 大片免费播放器 马上看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲五月色婷婷综合| 日韩一区二区三区影片| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲,一卡二卡三卡| 性色av一级| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲av电影在线进入| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品国产三级专区第一集| 成人国产av品久久久| 免费在线观看影片大全网站 | 欧美在线一区亚洲| 精品久久久久久电影网| 99热网站在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 色播在线永久视频| 下体分泌物呈黄色| 欧美 日韩 精品 国产| 国产一级毛片在线| 久久国产精品影院| 另类精品久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美日本中文国产一区发布| 满18在线观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲人成电影免费在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| av天堂久久9| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色 视频免费看| 日韩电影二区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲天堂av无毛| 亚洲国产欧美在线一区| 精品久久久久久电影网| 色婷婷av一区二区三区视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 少妇 在线观看| 1024香蕉在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| av网站在线播放免费| 高清欧美精品videossex| 国产日韩欧美亚洲二区| 大话2 男鬼变身卡| 国产男人的电影天堂91| 精品高清国产在线一区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久av网站| 最新的欧美精品一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产午夜精品一二区理论片| 一区福利在线观看| 国产在线视频一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲久久久国产精品| 九草在线视频观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产色视频综合| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看国产h片| 五月天丁香电影| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久国产电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 后天国语完整版免费观看| 国产高清videossex| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久久久网色| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 黄色一级大片看看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产人伦9x9x在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 老司机靠b影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 高清欧美精品videossex| 韩国高清视频一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 美女中出高潮动态图| 国产亚洲欧美在线一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看 | 曰老女人黄片| 婷婷成人精品国产| 久久亚洲精品不卡| 色94色欧美一区二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产欧美在线一区| 国产一区二区 视频在线| 日本欧美国产在线视频| 搡老岳熟女国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日本午夜av视频| 免费av中文字幕在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 999久久久国产精品视频| 男女午夜视频在线观看| 久热这里只有精品99| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产免费视频播放在线视频| 国产视频一区二区在线看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美黑人精品巨大| 免费观看人在逋| 国产国语露脸激情在线看| 青青草视频在线视频观看| 日韩免费高清中文字幕av| 丝袜在线中文字幕| 日韩电影二区| 欧美人与善性xxx| 日韩av在线免费看完整版不卡| 丝袜人妻中文字幕| 午夜av观看不卡| 亚洲国产av新网站| 桃花免费在线播放| 高清不卡的av网站| 少妇粗大呻吟视频| 深夜精品福利| 成人黄色视频免费在线看| 免费在线观看日本一区| 晚上一个人看的免费电影| 另类亚洲欧美激情| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 男女边吃奶边做爰视频| 色播在线永久视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久久久久久久久大奶| 两人在一起打扑克的视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品日本国产第一区| 飞空精品影院首页| 男人添女人高潮全过程视频| av欧美777| 看十八女毛片水多多多| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久影院123| 国产亚洲av高清不卡| 考比视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 九草在线视频观看| 亚洲av国产av综合av卡| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲久久久国产精品| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲成人免费av在线播放| 51午夜福利影视在线观看| www.精华液| 在现免费观看毛片| 精品视频人人做人人爽| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av美国av| 亚洲天堂av无毛| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99国产精品免费福利视频| 视频在线观看一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久精品区二区三区| 捣出白浆h1v1| 波多野结衣一区麻豆| 男女边吃奶边做爰视频| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 天堂中文最新版在线下载| 夫妻午夜视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 精品人妻1区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 波多野结衣一区麻豆| 国产成人啪精品午夜网站| 又黄又粗又硬又大视频| 免费黄频网站在线观看国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| www.自偷自拍.com| 久久国产精品大桥未久av| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 赤兔流量卡办理| 午夜老司机福利片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91成人精品电影| 精品福利永久在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产免费现黄频在线看| 国产97色在线日韩免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品成人免费网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 日本vs欧美在线观看视频| 日日夜夜操网爽| 自线自在国产av| 久久人妻熟女aⅴ| 国产一区二区在线观看av| 久久影院123| 国产在线观看jvid| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜av观看不卡| 亚洲国产最新在线播放| 青春草视频在线免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 一本久久精品| 赤兔流量卡办理| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲av综合色区一区| 黑丝袜美女国产一区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜福利一区二区在线看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品美女久久av网站| 91麻豆av在线| 亚洲精品国产区一区二| 欧美日韩综合久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 岛国毛片在线播放| 精品久久久久久电影网| www日本在线高清视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩一本色道免费dvd| 久久精品国产综合久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美女视频免费永久观看网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 高清不卡的av网站| 国产不卡av网站在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美日韩精品网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久视频综合| 国产精品久久久久久精品古装| www.av在线官网国产| 亚洲av男天堂| 丰满饥渴人妻一区二区三| 成在线人永久免费视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲中文av在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | av有码第一页| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜影院在线不卡| 精品久久久久久电影网| 午夜两性在线视频| 满18在线观看网站| 午夜91福利影院| 一二三四社区在线视频社区8| 国产97色在线日韩免费| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产99久久九九免费精品| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲成国产人片在线观看| 丝袜在线中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久中文字幕一级| 国产成人免费无遮挡视频| 赤兔流量卡办理| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色a级毛片大全视频| 天天影视国产精品| 久久这里只有精品19| 老汉色∧v一级毛片| 中国美女看黄片| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 97在线人人人人妻| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日韩av久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黄色怎么调成土黄色| 日韩欧美一区视频在线观看| 99热网站在线观看| 中文字幕制服av| 一级片免费观看大全| videos熟女内射| 久久女婷五月综合色啪小说| 人人澡人人妻人| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本欧美国产在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品国产一区二区久久| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品自拍成人| 热re99久久国产66热| 欧美黑人欧美精品刺激| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产在线一区二区三区精| 久久久亚洲精品成人影院| 99九九在线精品视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 夫妻午夜视频| 亚洲成人免费av在线播放| 精品国产一区二区久久| 黄色 视频免费看| 精品福利永久在线观看| 一本久久精品| 亚洲精品一二三| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美日韩福利视频一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲一码二码三码区别大吗| 咕卡用的链子| 老司机影院毛片| 欧美久久黑人一区二区| 久久狼人影院| 成人三级做爰电影| 搡老岳熟女国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 后天国语完整版免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲人成电影观看| 国产视频一区二区在线看| 1024视频免费在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 国产伦理片在线播放av一区| 一边亲一边摸免费视频| 成人国产一区最新在线观看 | 国产成人欧美| 制服诱惑二区| 国产一级毛片在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美成人午夜精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 手机成人av网站| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩精品网址| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产免费一区二区三区四区乱码| 岛国毛片在线播放| 免费在线观看日本一区| 美女主播在线视频| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利在线免费观看网站| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利,免费看| 搡老乐熟女国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区av电影网| 韩国精品一区二区三区| 午夜老司机福利片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久国产精品影院| 超色免费av| 亚洲欧美激情在线| 日本av免费视频播放| 悠悠久久av| 又大又爽又粗| 国产日韩欧美视频二区| 大型av网站在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 色网站视频免费| 国产成人精品久久二区二区免费| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产高清国产精品国产三级| 免费看不卡的av| 国产亚洲欧美精品永久| av在线老鸭窝| 美女扒开内裤让男人捅视频| 美女午夜性视频免费| 一级片'在线观看视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品欧美一区二区三区在线| 国产日韩欧美在线精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 丝袜喷水一区| 国产精品亚洲av一区麻豆| videos熟女内射| av片东京热男人的天堂| 亚洲伊人色综图| 日本wwww免费看| 亚洲 国产 在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av线在线观看网站| 精品久久久久久电影网| 午夜免费成人在线视频| 最新在线观看一区二区三区 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产高清不卡午夜福利| 99国产精品一区二区三区| a级毛片在线看网站| 久久久精品区二区三区| bbb黄色大片| 丝袜喷水一区| 婷婷丁香在线五月| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久ye,这里只有精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av国产精品久久久久影院| 天天添夜夜摸| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男的添女的下面高潮视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲中文字幕日韩| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av在线老鸭窝| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看免费高清a一片| 夫妻性生交免费视频一级片| 一区二区三区乱码不卡18| 久久人妻熟女aⅴ| 久久久久网色| 麻豆av在线久日| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝瓜视频免费看黄片| 日本vs欧美在线观看视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产不卡av网站在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成在线人永久免费视频| a级毛片黄视频| 制服诱惑二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品三级大全| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一区二区三区四区激情视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 老司机影院成人| 视频在线观看一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区 | 少妇人妻久久综合中文|