湛江灣抗生素抗性基因的時(shí)空分布及其影響因素

葉映儀，侯慶華，藍(lán)東和，張際標(biāo)

(1.廣東海洋大學(xué) 近海海洋變化與災(zāi)害預(yù)警實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088)

自1929年人類發(fā)明抗生素以來[1]，抗生素在人類醫(yī)療及畜牧養(yǎng)殖等行業(yè)得到了廣泛使用[2]，2015年全球抗生素使用量較2000年增長了65%[3]。有研究預(yù)測，在無政策干預(yù)的情況下，2030年全球抗生素消費(fèi)量可能比2015年高出200%[3]。長期過量使用抗生素促進(jìn)了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene，ARGs)的出現(xiàn)[4]。水生生態(tài)系統(tǒng)中的抗生素通過河流和小溪等途徑進(jìn)入到河口和海灣，進(jìn)而導(dǎo)致抗生素和ARGs在河口和海灣的污染[4-5]。釋放到這些環(huán)境中的抗生素通過多種途徑不斷地傳播、擴(kuò)散和積累，給近海生態(tài)、海洋資源利用及人類健康帶來了嚴(yán)重威脅[6]。因此，研究ARGs在環(huán)境中的分布及其影響機(jī)制，對于環(huán)境治理及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防具有極其重要的意義。

有關(guān)抗生素和ARGs在河口、海灣和近海海洋環(huán)境中的分布狀況已有報(bào)道[5，7]。對海灣中ARGs的研究包括澳大利亞的菲利普港灣[8]，以及中國的渤海海灣(遼州灣、渤海灣和萊州灣)[9-10]及東海海灣(杭州灣、香山灣和臺州灣)[7]等。研究顯示，生活污水、工業(yè)廢水和養(yǎng)殖廢水的排放，導(dǎo)致了海灣理化因子、抗生素和重金屬等污染物的變化，影響了海灣ARGs的分布[7，9-11]。目前，對ARGs的研究主要集中在海灣中的空間分布特征，對其時(shí)間尺度(如4個(gè)季節(jié)的變化)上的分布特征，僅見Guo等[12]對長江河口環(huán)境進(jìn)行了相關(guān)研究，而有關(guān)海灣中ARGs 4個(gè)季節(jié)的變化特征及其影響因素尚缺乏相關(guān)研究。

本研究中，對湛江灣的重金屬、抗生素和環(huán)境理化因子等指標(biāo)進(jìn)行了測定，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法，對四環(huán)素類、磺胺類和氟喹諾酮類ARGs在湛江灣表層沉積物中的時(shí)空分布特征進(jìn)行了分析，同步檢測可移動遺傳元件的一類整合子基因(intI1)作為ARGs水平轉(zhuǎn)移的指示劑，并結(jié)合重金屬、抗生素和環(huán)境理化因子等指標(biāo)，探討了自然環(huán)境和人為污染對海灣ARGs季節(jié)分布的潛在影響，以期為ARGs在海灣環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)評估及控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域和樣品采集

分別于2017年4月(春)、8月(夏)、11月(秋)及2018年1月(冬)在湛江灣海域(109°40′～110°58′E，20°13′～21°57′N)的3個(gè)代表性站位采集表層沉積物樣品(圖1)。湛江灣屬于半封閉海灣，海水流動交換較緩慢[13]。其中，Z04站位設(shè)置在接近湛江市霞山區(qū)附近的排污口，用以表征城市生活污水區(qū)域；Z21站位設(shè)置在東海島上的湛江寶鋼鋼鐵廠的排污口，用于表征工業(yè)污水區(qū)域；Z06站位則是遠(yuǎn)離污水口的站位，用以表征遠(yuǎn)離污水污染區(qū)域，將其作為對照站位。使用抓取式采樣器采集各站位表層沉積物(0～3 cm)，立即收集到無菌塑封袋中，4 ℃低溫下貯存并快速運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。用于后續(xù)基因豐度檢測的樣品使用5 mL凍存管貯存于-80 ℃超低溫冰箱中，其余樣品在-20 ℃下保存用于后續(xù)理化性質(zhì)分析。

本圖基于自然資源部標(biāo)準(zhǔn)地圖服務(wù)網(wǎng)站GS(2019)3266號標(biāo)準(zhǔn)地圖為底圖，底圖邊界無修改。The figure is based on the standard map GS(2019)3266 in the Standard Map Service website of Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China，with no modifications of the boundaries in the standard map.圖1 湛江灣采樣站位圖Fig.1 Sampling sites in the Zhanjiang Bay

1.2 方法

1.2.2 抗生素檢測 選取中國近海環(huán)境中檢出頻率較高的四環(huán)素類、磺胺類和氟喹諾酮類抗生素進(jìn)行湛江灣抗生素季節(jié)分布特征的分析[15]。其中，四環(huán)素類的代表包括土霉素(oxytetracycline，OTC)和四環(huán)素(tetracycline，TC)，磺胺類的代表包括磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)和磺胺甲基異惡唑(sulfamethoxazole，SMX)，氟喹諾酮類的代表包括諾氟沙星(norfloxacin，NFC)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CFC)和氧氟沙星(ofloxacin，OFC)。所有沉積物樣品均送至中國廣州分析測試中心進(jìn)行抗生素檢測，具體過程：取適量沉積物樣品，加入適量乙腈-磷酸緩沖液(體積比為1∶1)，渦旋超聲后，離心取上清液過濾，隨后采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法(LC-MS/MS，Agilent 1290，US)，對上述7種抗生素進(jìn)行檢測。

1.2.3 重金屬檢測 選取近海沉積物中出現(xiàn)頻率較高的重金屬[16]，結(jié)合前期研究對湛江灣重金屬的檢測結(jié)果[17]，對湛江灣表層沉積物中9類重金屬總濃度進(jìn)行檢測，包括鉻(Cr)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、錳(Mn)、鎳(Ni)、砷(As)和汞(Hg)。所有沉積物樣品均送至廣東海洋大學(xué)分析測試中心進(jìn)行檢測，具體過程：沉積物樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨，過孔徑為120 μm的篩，利用安東帕微波消解儀(Multiwave PRO 41 HVT56)，在室溫下用鹽酸與硝酸混合溶液對樣品進(jìn)行微波消解后，過濾、定容，用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HY/T 147.2—2013/6)，在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫，7500Cx)上分別測定提取液中Cr、Cu、Zn、Cd、Pb、Mn、Ni和As 8種重金屬的總濃度；采用原子熒光法(GB 17378.5—2007/5.1)，在金索坤SK-銳析AFS雙道原子熒光光譜儀上檢測Hg濃度。

1.2.4 DNA提取與目的基因的qPCR定量檢測 稱取0.25 g表層沉積物樣品，用PowerSoil?DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories，Carls bad，CA)對每個(gè)樣品的總DNA進(jìn)行提取。使用Nano VueTMPlus微量分析儀(GE Healthcare Life S，UK)測定DNA的濃度，DNA的OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0時(shí)，方可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。選取四環(huán)素類抗性基因(tetQ)、磺胺類抗性基因(sul1)、喹諾酮抗性基因(qnrS)、整合子基因(intI1)和總細(xì)菌16S rRNA作為目標(biāo)基因，各基因的引物和退火溫度見表1。qPCR反應(yīng)體系配制和反應(yīng)程序設(shè)置參照Guo等[12]使用的方法。

表1 目的基因的qPCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequences of target genes

通過對目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后構(gòu)建質(zhì)粒，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。對測序正確的質(zhì)粒按照10倍梯度稀釋構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果均滿足R2>0.99，擴(kuò)增效率在90%～100%，達(dá)到試驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)粒濃度計(jì)算出基因絕對豐度拷貝數(shù)。為了消除生物量的影響，通過16S rRNA基因?qū)RGs和intI1的絕對豐度標(biāo)準(zhǔn)化[19]，通過計(jì)算各個(gè)基因與16S rRNA基因拷貝數(shù)的比值得到基因相對豐度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05，探討ARGs之間及其與環(huán)境理化因子、抗生素和重金屬之間的相關(guān)性。采用Ocean Data View 5.3軟件繪制站位圖，采用OriginPro 2021軟件繪制基因豐度柱狀圖和相關(guān)性熱圖，采用Canoco 5軟件進(jìn)行RDA分析，采用美吉生物云工具進(jìn)行VPA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 湛江灣表層沉積物中環(huán)境因子的時(shí)空分布

對湛江灣表層沉積物的6種理化因子檢測顯示：溫度、鹽度、pH和溶解氧的季節(jié)變化較明顯，但站位變化不顯著，在春、夏季溫度和pH較高，鹽度和溶解氧較低；銨鹽的站位變化較明顯，在Z04站位的平均濃度高于Z06和Z21站位，硝酸鹽的平均濃度在春季最高、夏季最低，最高濃度出現(xiàn)在春季Z04站位(表2)。

對沉積物樣品中三大類共7種抗生素的時(shí)空分布特征分析顯示：磺胺甲基異惡唑和氧氟沙星在所有樣品中均檢出，磺胺嘧啶在所有樣品中均未檢出，其余抗生素在部分樣品中檢出；在已檢出的樣品中，平均濃度最高的抗生素類型為氟喹諾酮類，其次為四環(huán)素類，磺胺類平均濃度最低；結(jié)合站位和季節(jié)變化來看，三類抗生素的最高濃度均出現(xiàn)在冬季Z04站位，且四環(huán)素類和氟喹諾酮類的平均濃度季節(jié)變化均為冬季最高、夏季最低(表2)。

表2 湛江灣表層沉積物中理化因子與抗生素4個(gè)季節(jié)的檢測值Tab.2 Detection values of physicochemical factors and antibiotics in surface sediments of Zhanjiang Bay in four seasons

對沉積物樣品中的重金屬分析顯示：在所有樣品中均檢出9種重金屬，其中Mn是4個(gè)季節(jié)中平均濃度最高的重金屬；從季節(jié)變化上看，大部分重金屬的平均濃度在夏季達(dá)到最低值；從站位變化上看，大部分重金屬平均濃度在Z04站位最高，在Z21站位最低(表3)。

表3 湛江灣表層沉積物中重金屬4個(gè)季節(jié)的檢測值Tab.3 Detection values of heavy metals in surface sediments of Zhanjiang Bay in four seasons μg/g

2.2 16S rRNA、ARGs和intI1絕對豐度的時(shí)空分布特征

從圖2可見：16S rRNA基因、3種ARGs(sul1、tetQ和qnrS)和intI1在所有樣品中的檢出頻率均為100%；16S rRNA基因、sul1、tetQ、qnrS和intI1在4個(gè)季節(jié)所有樣品中的平均絕對豐度依次為5.27×106、7.23×104、2.68×104、7.93×102、1.62×105copies/g。所有基因的平均絕對豐度值均呈現(xiàn)出時(shí)間和空間尺度上的差異：從時(shí)間尺度來看，16S rRNA基因、3種ARGs和intI1的平均絕對豐度值均呈現(xiàn)出冬季最高，春、秋季次之，夏季最低的現(xiàn)象；從空間尺度來看，16S rRNA基因在各站位的平均絕對豐度變化規(guī)律為Z04>Z21>Z06，而3種ARGs和intI1的平均絕對豐度值均呈現(xiàn)出Z21>Z04>Z06的現(xiàn)象(圖2)。

2.3 ARGs和intI1相對豐度的時(shí)空分布特征

3種抗性基因和intI1在沉積物樣品中的相對豐度分布如圖3所示，3種抗性基因sul1、tetQ和qnrS的相對豐度均在夏季Z06樣品異常高，分別達(dá)4.55×10-2、2.28×10-1、2.08×10-3，而在其余樣品中分布較均勻，其余樣品4個(gè)季節(jié)的平均相對豐度依次為1.41×10-2、5.26×10-3和1.72×10-4。

圖3 湛江灣表層沉積物中目的基因相對豐度的季節(jié)分布Fig.3 Seasonal distribution of relative abundance of target genes in surface sediments of Zhanjiang Bay

從季節(jié)尺度看，3種ARGs的平均相對豐度均呈現(xiàn)出夏季最高的現(xiàn)象；從空間尺度看，3種ARGs在各站位平均相對豐度均為Z06>Z21>Z04。intI1 4個(gè)季節(jié)的平均相對豐度為2.59×10-2，其分布規(guī)律與3種ARGs明顯不同，季節(jié)平均相對豐度冬季高于夏季，與平均絕對豐度季節(jié)變化相似；各站位平均相對豐度均為Z21>Z06>Z04(圖3)。

2.4 各基因豐度間的相關(guān)性分析

基因絕對豐度間的Sperarman相關(guān)性分析顯示：3種ARGs(sul1、qnrS和tetQ)彼此之間均呈顯著正相關(guān)(r>0.700，P<0.01)；sul1、tetQ與intI1之間均呈顯著正相關(guān)(r>0.600，P<0.05)，而qnrS與intI1無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)，且3種ARGs、intI1均與16S rRNA基因間呈顯著正相關(guān)(r>0.600，P<0.05)(圖4(a))?；蛳鄬ωS度間的Speratman相關(guān)性分析顯示：除了sul1相對豐度分別與qnrS、tetQ和intI1相對豐度間呈顯著正相關(guān)(r>0.600，P<0.05)之外，其余基因的相對豐度之間均無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)(圖4(b))。

圖4 各基因豐度間及其與環(huán)境因子間的Spearman相關(guān)性分析Fig.4 Spearman correlation analysis between ARGs，and between ARGs and environmental factors

2.5 各基因豐度與環(huán)境因子間的相關(guān)性分析

5個(gè)基因的豐度與環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性分析顯示，理化因子僅DO與tetQ絕對豐度呈正相關(guān)(r=0.636，P<0.05)(圖4(c))。5個(gè)基因豐度與抗生素的Spearman相關(guān)性分析顯示：四環(huán)素類和氟喹諾酮類抗生素與基因豐度間相關(guān)性較顯著；環(huán)丙沙星與sul1、tetQ和16S rRNA基因，以及土霉素與sul1、16S rRNA基因絕對豐度間均呈顯著正相關(guān)(r>0.600，P<0.05)(圖4(c))；氧氟沙星與sul1相對豐度間呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.500，P<0.05)，土霉素、諾氟沙星與qnrS相對豐度間均呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.500，P<0.05)(圖4(d))。5個(gè)基因豐度與重金屬的Spearman相關(guān)性分析顯示：Mn與qnrS、tetQ的絕對豐度間均呈顯著正相關(guān)(r>0.600，P<0.05)(圖4(c))；Cu、Pb與部分ARGs(sul1或qnrS)相對豐度間呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.500，P<0.05)，Cd、Pb與intI1相對豐度間均呈顯著負(fù)相關(guān)(r<-0.600，P<0.05)(圖4(d))。

將16S rRNA基因、ARGs(sul1、qnrS和tetQ)和intI1基因的豐度與各項(xiàng)理化因子、抗生素及重金屬進(jìn)行冗余分析(RDA分析)(圖5)。基因絕對豐度的RDA分析顯示：僅重金屬Cd與目的基因絕對豐度的分布和變化密切相關(guān)(Pseudo-F=5.8，P<0.05)(圖5(c))，重金屬對基因絕對豐度分布的總解釋度為93.01%，并且該值也為前兩個(gè)坐標(biāo)軸(RDA1和RDA2)的累計(jì)解釋度；其他環(huán)境因子對基因絕對豐度影響較弱(圖5(a)、(b))，理化因子和抗生素對基因絕對豐度分布的總解釋度分別為48.21%和77.44%，兩者均未與各基因絕對豐度顯著相關(guān)?；蛳鄬ωS度的RDA分析顯示：重金屬Cu可能是影響目的基因相對豐度分布和變化的主要環(huán)境因子(Pseudo-F=18.3，P<0.01)(圖5(f))，且Pb、Cr和Mn也是潛在影響目的基因相對豐度分布的重要環(huán)境因子(4.70.05)。

圖5 基因絕對豐度和相對豐度分別與三類環(huán)境因子的RDA分析Fig.5 Redundancy discriminant analysis (RDA)of gene absolute abundance and relative abundance with three kinds of environmental factors

進(jìn)一步對各類環(huán)境因子與ARGs相對豐度進(jìn)行方差分解分析，發(fā)現(xiàn)重金屬對海灣ARGs相對豐度變化的貢獻(xiàn)大于理化因子和抗生素，高達(dá)87.15%，三類環(huán)境因子的共同貢獻(xiàn)小于20%(圖6)。

圖6 三類環(huán)境因子對ARGs相對豐度分布解釋度的方差分解分析(VPA)Fig.6 Variation portioning analysis (VPA)of three kinds of environmental factors on the ARGs distribution (based on relative abundance)

3 討論

3.1 ARGs的季節(jié)分布

16S rRNA基因的絕對豐度值能反映出對應(yīng)沉積物樣品中的細(xì)菌總量，而intI1作為一種能攜帶抗生素抗性基因的整合子，其豐度的分布情況反映了ARGs水平轉(zhuǎn)移的情況。從絕對豐度來看，湛江灣表層沉積物中各類ARGs和intI1的平均絕對豐度在各季節(jié)的分布，整體上呈現(xiàn)出冬季最高、夏季最低的季節(jié)分布規(guī)律，該結(jié)果與中國大陸沿岸水域ARGs和intI1的平均絕對豐度值呈現(xiàn)出冬季高于夏季[23]的結(jié)果相似，但該結(jié)果與長江河口區(qū)表層沉積物中各類ARGs夏季高、冬季低的研究結(jié)果相反[12]。從相對豐度來看，3種ARGs的平均相對豐度在夏季異常增大的原因與16S rRNA基因的豐度有關(guān)，因?yàn)榧?xì)菌平均絕對豐度在夏季樣品中最低。Spearman相關(guān)性分析顯示，各類ARGs的絕對豐度均與16S rRNA基因絕對豐度間顯著相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，同時(shí)前人對長江河口的相關(guān)研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)[24]，說明細(xì)菌豐度對ARGs相對豐度與絕對豐度分布有重要影響。

本研究中，從3種類型的ARGs在湛江灣表層沉積物中的絕對豐度和相對豐度值可知，磺胺類抗性基因sul1是湛江灣表層沉積物中最豐富的ARGs，其次是四環(huán)素類抗性基因tetQ，而氟喹諾酮類抗性基因qnrS豐度最低。此外，前人在多個(gè)河口和近海表層沉積物環(huán)境中的研究結(jié)果均表明，sul1基因是ARGs中最豐富的一類[7，10，12，25]，sul1基因在多個(gè)近海環(huán)境中分布最廣和最豐富的現(xiàn)象與其在環(huán)境中較高的持久性密切相關(guān)[26]。

將湛江灣沉積物中各季節(jié)不同類型ARGs的絕對豐度值與相對豐度值同其他近海環(huán)境進(jìn)行比較。與春季東海3個(gè)海灣(杭州灣、象山灣和臺州灣)相比，春季湛江灣沉積物中磺胺類抗性基因sul1的絕對豐度值(104～105copies/g)比東海臺州灣(106～107copies/g)約低2個(gè)數(shù)量級[7]；四環(huán)素類抗性基因tetQ的絕對豐度值(103～104copies/g)遠(yuǎn)低于東海3個(gè)海灣(104～107copies/g)[7]。與夏冬季渤海灣相比，夏冬季湛江灣沉積物中磺胺類抗性基因sul1的絕對豐度值(103～105copies/g)低于渤海灣沉積物(104～107copies/g)[25]；四環(huán)素類抗性基因tetQ的絕對豐度值(103～104copies/g)低于渤海灣沉積物(105～107copies/g)[25]；氟喹諾酮類抗性基因(qnrS)的最高絕對豐度值(約103copies/g)比渤海灣沉積物(約108copies/g)低5個(gè)數(shù)量級，最高相對豐度(10-3)比其對應(yīng)值(約10-2)約低1個(gè)數(shù)量級[25]。此外，湛江灣除夏季Z06站位樣品外，其余站位樣品中sul1 4個(gè)季節(jié)的平均相對豐度值(1.41×10-2)與全球河口和近海環(huán)境中的數(shù)值(1.46×10-2)接近[27]。上述結(jié)果表明，湛江灣沉積物中存在一定程度的ARGs污染，但污染程度整體低于其他海灣。

3.2 ARGs的空間分布

本研究中，從絕對豐度來看，湛江灣表層沉積物中ARGs和intI1的平均絕對豐度在靠近寶鋼鋼鐵廠的Z21站位污染情況最嚴(yán)重，其次是受城市生活污水排放影響的Z04站位，而Z06站位的污染程度最低。從相對豐度來看，ARGs的平均相對豐度均在Z06站位最高，可能是受細(xì)菌豐度影響的原因。在其他海灣和河口環(huán)境的研究中，也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)，在靠近醫(yī)藥基地的站位中檢測到ARGs出現(xiàn)的頻率和豐度均相對更高；Guo等[12]和Lu等[23]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ARGs和intI1在污水處理廠尾水排放區(qū)域的豐度相對較高；Lu等[28]和Zhu等[5]發(fā)現(xiàn)，海岸帶和河流樣品或不同河口樣品中，ARGs和可移動遺傳元件的豐度差異顯著。Zhang等[25]指出，ARGs的不同空間分布是受到海洋污染和陸基污染的相互作用，以及密集的人為活動影響。這些結(jié)果表明，環(huán)境中不同區(qū)域的ARGs分布普遍存在差異。

3.3 ARGs與整合子基因intI1的關(guān)系

整合子是可移動遺傳元件(mobile genetic elements，MGEs)的一種，當(dāng)兩種微生物接觸時(shí)，MGEs可驅(qū)動DNA從供體微生物轉(zhuǎn)移到受體微生物，從而使受體微生物的基因組發(fā)生變化[29]，這種基因轉(zhuǎn)移機(jī)制有利于抗性基因的傳播。而整合子(如intI1)已被報(bào)道廣泛存在于多個(gè)河口和近海環(huán)境中[27]。本研究中，intI1在湛江灣沉積物中的平均絕對豐度值僅次于16S rRNA基因，其絕對豐度比整體渤海灣和黃海沉積物中的最高絕對豐度低2～3個(gè)數(shù)量級[25，28]，而其最高相對豐度(10-2)比萊州灣中的intI1(約10-3)高1個(gè)數(shù)量級[9]。湛江灣沉積物中intI1的絕對豐度和相對豐度均與磺胺類抗性基因sul1顯著相關(guān)(P<0.05)，這與前人在河口和海岸環(huán)境中的諸多報(bào)道一致[5，7，9-10，12]，據(jù)分析是由于sul1能經(jīng)常疊加于intI1基因序列上所致[30]。除了磺胺類抗性基因外，湛江灣表層沉積物中的intI1與四環(huán)素類抗性基因tetQ的絕對豐度顯著相關(guān)(P<0.05)，與前人在河口和海岸環(huán)境中二者顯著相關(guān)的研究結(jié)果一致[7，12，23]，說明intI1可能驅(qū)動了四環(huán)素類抗性基因在近海環(huán)境中的傳播。本研究中，湛江灣表層沉積物中的intI1與氟喹諾酮類抗性基因qnrS并無相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果與Lu等[28]對渤海、黃海海域的相關(guān)研究結(jié)果一致，但與Guo等[12]對長江河口中二者顯著相關(guān)的研究結(jié)果不符，說明intI1與氟喹諾酮類抗性基因的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。綜合以上研究，intI1可能驅(qū)動了近海環(huán)境中磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因的傳播，而對氟喹諾酮類抗性基因的潛在影響有待進(jìn)一步研究。

3.4 ARGs與環(huán)境因子的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，污水處理廠和城市河流排放的重金屬、化學(xué)需氧量(DOC)和總氮(TN)等污染物與長江口表層沉積物中的ARGs相關(guān)且呈現(xiàn)出相似的季節(jié)變化規(guī)律，表明沿岸產(chǎn)業(yè)的污水排放可能會對ARGs的局部分布規(guī)律產(chǎn)生影響[12]。對于ARGs的空間分布而言，Zhu等[5]分析了中國近岸多個(gè)河口水域表層沉積物中ARGs的分布特征，指出環(huán)境理化因子和細(xì)菌群落并不是驅(qū)動ARGs在近岸河口水域分布的因素，而人類活動如城市生活污水的排放、抗生素的污染等是影響海灣ARGs空間分布的重要因素。

3.4.1 抗生素 本研究中，湛江灣沉積物中三類抗生素的平均濃度依次為氟喹諾酮類>四環(huán)素類>磺胺類，并且三類抗生素最高濃度均出現(xiàn)在Z04站位冬季樣品中，該結(jié)果與前人對水域環(huán)境中抗生素濃度冬季高于夏季的結(jié)果相似，主要是由于冬季人類患病增多和夏季雨水稀釋等原因所致[15]。雖然湛江灣沉積物中磺胺類抗生素的平均濃度在三類抗生素中最低，但是磺胺類抗性基因sul1在3種ARGs中占主導(dǎo)地位，磺胺類抗生素與sul1之間并無顯著的相關(guān)性，該現(xiàn)象與前人對河口和近海環(huán)境中ARGs的報(bào)道相似，即磺胺類抗性基因可能是由河口附近的污染源排放，而不是經(jīng)抗生素壓力而原位形成[12，31]。對湛江灣沉積物中氟喹諾酮類抗生素與其抗性基因的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類抗生素在檢測的三類抗生素中平均濃度最高，但其對應(yīng)的抗性基因qnrS豐度卻在3種ARGs中最低，氟喹諾酮類抗生素諾氟沙星與抗性基因qnrS的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，前人對長江河口區(qū)的研究中也曾發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類是最主要的抗生素，但氟喹諾酮類抗性基因并不是占主導(dǎo)的ARGs[12]。此外，ARGs與抗生素的相關(guān)性分析還顯示，四環(huán)素類抗生素(土霉素)除與其對應(yīng)的抗性基因tetQ的絕對豐度呈顯著正相關(guān)外，其與非對應(yīng)的磺胺類抗性基因sul1的絕對豐度和氟喹諾酮類抗性基因qnrS的相對豐度也存在相關(guān)關(guān)系。氟喹諾酮類抗生素除與相對應(yīng)的抗性基因qnrS的相對豐度呈負(fù)相關(guān)外，其與非對應(yīng)的磺胺類抗性基因sul1的絕對豐度和相對豐度及四環(huán)素類抗性基因tetQ的相對豐度存在相關(guān)性。這種ARGs與非對應(yīng)抗生素之間存在相關(guān)性的現(xiàn)象在其他沿海環(huán)境中也曾出現(xiàn)[5，9-10，23，27]。然而RDA分析結(jié)果卻顯示，抗生素與抗性基因絕對豐度和相對豐度的時(shí)空分布均無顯著相關(guān)性，說明抗生素對抗性基因整體分布的影響較小，而對特定基因的影響程度可能更顯著。以上結(jié)果表明，湛江灣表層沉積物中各類ARGs的分布除了受到污染源的直接排放影響外，還可能受到對應(yīng)抗生素或非對應(yīng)抗生素選擇性壓力的影響。

3.4.2 重金屬 除了抗生素，重金屬作為重要的非對應(yīng)污染物對ARGs的分布具有長期選擇性壓力[32]。苗蓀等[33]對全球水體和沉積環(huán)境中的重金屬與ARGs的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的多種重金屬(如Cu、Cd、Hg等)與ARGs顯著相關(guān)。本研究中，比較湛江灣與近海環(huán)境中的Cu與磺胺類抗性基因sul1相對豐度的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，湛江灣表層沉積物中二者間呈顯著負(fù)相關(guān)，這與長江口水域中磺胺類抗性基因sul2相對豐度與Cu呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相似[24]，但與萊州灣和湘江中段水域的Cu與磺胺類抗性基因(sul1或sul2)相對豐度呈正相關(guān)的結(jié)果不同[9，34]。本研究中，湛江灣沉積物中的Pb與磺胺類抗性基因sul1和整合子intI1相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與長江口水域中Pb與抗性基因sul2相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)的結(jié)果相似[24]，但與萊州灣中Pb與抗性基因sul2、整合子intI1相對豐度呈正相關(guān)的結(jié)果相反[9]。本研究中，RDA分析結(jié)果顯示，Cd與ARGs絕對豐度的分布變化密切相關(guān)，并顯示Cu可能是影響湛江灣ARGs相對豐度分布變化的主要環(huán)境因子，以及Pb、Cr和Mn對ARGs相對豐度也有潛在影響，重金屬與ARGs的相關(guān)性較顯著。同時(shí)，ARGs相對豐度與理化因子、抗生素和重金屬的VPA分析結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了重金屬對ARGs時(shí)空分布的貢獻(xiàn)要大于其他環(huán)境因子，這與東海海灣沉積物中ARGs的分布結(jié)果一致[7]。上述結(jié)果表明，三類環(huán)境因子中重金屬可能對ARGs時(shí)空分布產(chǎn)生了重要影響。

3.4.3 環(huán)境理化因子 除了抗生素和重金屬，一些環(huán)境參數(shù)也可能對ARGs的分布產(chǎn)生影響，如溫度、鹽度、pH和各種營養(yǎng)鹽等。Zheng等[27]認(rèn)為，不同ARGs在全球范圍內(nèi)的豐度分布產(chǎn)生顯著的緯度差異，其可能歸因于不同ARGs的最適溫度差異。對澳大利亞菲利浦港灣沿岸灘涂中ARGs的研究顯示，鹽度是控制其分布的主導(dǎo)因素[8]。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，渤海灣水體樣品中的磺胺類抗性基因sul2的相對豐度與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，并由此指出，中性條件下的海水能使ARGs更持久。此外，各種形式的C、N和P等營養(yǎng)物質(zhì)也被報(bào)道與ARGs的分布相關(guān)[12，24-25，27]。本研究中，湛江灣沉積物中除了DO與四環(huán)素類抗性基因tetQ的絕對豐度顯著正相關(guān)外，其余ARGs和intI1均與理化因子間無顯著相關(guān)性。在對萊州灣和遼東灣水域的研究中，也有ARGs與所測定的理化因子(如溫度、鹽度、pH、COD、總氮、銨鹽和硝酸鹽等)之間無相關(guān)性或相關(guān)性較少的報(bào)道[9，31]。本研究中，RDA分析結(jié)果顯示，理化因子與抗性基因絕對豐度和相對豐度均無顯著相關(guān)性。上述結(jié)果表明，在不同的海洋環(huán)境中，理化因子對ARGs分布的影響程度存在差異。

4 結(jié)論

1)湛江灣表層沉積物中ARGs、16S rRNA和intI1基因的豐度分布存在明顯的空間和季節(jié)性分布特征，說明海灣中ARGs的分布具有不均勻性，同時(shí)會受到氣候變化的影響。

2)Spearman相關(guān)性分析、RDA分析和VPA分析結(jié)果共同揭示了細(xì)菌總量(16S rRNA基因豐度)、intI1、理化因子、抗生素和重金屬是影響ARGs豐度的潛在因素，其中重金屬是起最主要作用的環(huán)境因子，而污染物濃度在人類生活區(qū)域更高，說明人類活動會對海灣中ARGs的分布造成顯著影響。