銀鼓魚海豚鏈球菌的分離、鑒定及毒力基因檢測

楊林狄，賈新蕾，黃增朝，呂靜，梁華芳，黃郁蔥*

(1.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東高等學校水產經濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088)

銀鼓魚(Selenotocamultifasciata)，又稱為多紋錢蝶魚，隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)鱸形目(Perciformes)金錢魚科(Scatophagidae)，廣泛分布于澳大利亞、菲律賓和泰國等地的江河入?？?，在中國東海南部至南海，以及北部灣區(qū)域亦有分布，該魚棲息于海灣、河口、紅樹林及淡水河流和小溪的下游，目前，已開始在廣東省、海南省和廣西壯族自治區(qū)的網箱和池塘中大量養(yǎng)殖。銀鼓魚屬于偏植食性的雜食性海水魚類，具有耐高溫和廣鹽的特性，其肉質嫩滑鮮美，深受廣大消費者的喜愛，是一種兼具觀賞和食用價值的重要經濟魚類。有關銀鼓魚的研究報道，主要涉及其胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育觀察[1-2]及對其完整線粒體基因組的測序[3]等方面，但對銀鼓魚的病害研究鮮見報道，僅見羅璋等[4]從天津某觀賞魚養(yǎng)殖場銀鼓魚中分離出一株海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)。

2021年，北部灣地區(qū)銀鼓魚養(yǎng)殖場病害頻發(fā)，造成大批量死亡。本研究中，對現場采集的患病銀鼓魚進行病原菌的分離鑒定，并全面開展了組織病理學、人工感染、毒力基因檢測及藥物敏感性等較為系統(tǒng)的研究，以期為后續(xù)北部灣地區(qū)銀鼓魚養(yǎng)殖中的病害防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

患病銀鼓魚于2021年分別采自廣東省湛江市坡頭區(qū)南三鎮(zhèn)、廉江市和廣西北海市的3個不同養(yǎng)殖場，從每個養(yǎng)殖場采集3尾，體長為(18±4)cm?；貧w感染試驗用健康銀鼓魚體長為10～15 cm，購自湛江市某養(yǎng)殖場。

試劑：BHI液體培養(yǎng)基、BHI瓊脂培養(yǎng)基、M-H血瓊脂培養(yǎng)基和革蘭氏染色試劑均購自青島海博生物技術有限公司；血瓊脂平板培養(yǎng)基購自廣州環(huán)凱微生物有限公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PCR所用試劑購自寶生物(大連)有限公司；細菌生化微量鑒定管、藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；海豚鏈球菌ATCC29178株購自美國ATCC菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學觀察 取自然感染發(fā)病銀鼓魚的腦、心和肝臟等組織，迅速置于體積分數為10%的中性福爾馬林中，固定24 h后，用乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋后進行切片(4～6 μm)，使用HE染色劑試劑盒進行染色，用中性樹膠將切片封藏于玻片上，在顯微鏡下觀察并對典型病變組織進行拍照。

1.2.2 病原菌的分離純化 用體積分數為75%的乙醇棉球反復擦拭患病銀鼓魚體表后，在無菌條件下進行解剖，觀察記錄其內部器官的病癥，取其腦、脾臟和肝臟組織，用無菌水沖洗、研磨，劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基，倒置于生化培養(yǎng)箱，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h后，挑取優(yōu)勢單菌落在BHI瓊脂培養(yǎng)基上反復劃線純化2～3次，獲得純化菌株。挑取純化后的菌落于BHI液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進行后續(xù)鑒定工作。

1.2.3 分離菌株的鑒定

1)菌落和菌體形態(tài)觀察。用接種環(huán)挑取純化后的單菌落，接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，倒置于生化培養(yǎng)箱，在28 ℃下培養(yǎng)24～48 h后，挑取單菌落制備菌液涂片，使用革蘭氏染色試劑進行染色，觀察其菌落形態(tài)及菌體形態(tài)并進行拍照。

2)生理生化鑒定。挑取純化后的單菌落接種于細菌微量生化反應管中，倒置于生化培養(yǎng)箱，在28 ℃下培養(yǎng)24～48 h，以參考菌株ATCC29178作為陽性對照，根據《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[5]對菌株培養(yǎng)結果進行初步鑒定。

3)16S rRNA序列分析。利用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的DNA，使用細菌16S rRNA通用引物27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)和1492R(5′GGTTACCTTGTTA CGACTT 3′)對分離菌株的16S rRNA基因進行擴增。PCR體系(20 μL)：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Ex-Taq 10 μL，用ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，56 ℃下退火1.5 min，72 ℃下延伸1 min，共進行36個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。PCR產物經電泳檢測驗證后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將分離菌株的16S rRNA序列與GenBank數據庫中已知核酸序列進行BLAST分析。采用MEGA 5.0軟件，將分離株(BBW S1、BBW S2和BBW S3)與其他細菌的16S rRNA核苷酸序列一起構建系統(tǒng)發(fā)育樹，節(jié)點的置信度檢驗采取Bootstrap分析(1 000個循環(huán))。

1.2.4 人工回歸感染試驗 回歸感染試驗于廣東海洋大學海洋生物研究基地室內養(yǎng)殖桶(體積為0.1 m3)中進行，水溫控制在28 ℃，24 h持續(xù)充氣，每天換水量為1/3，每日投喂兩次商品配合飼料。將分離獲得的菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24 h后，用無菌PBS制成不同濃度的菌懸液。試驗前隨機取5尾實驗室暫養(yǎng)14 d的健康銀鼓魚進行解剖，檢測確認其無細菌、寄生蟲和病毒感染后，將試驗魚隨機分為6組，每組30尾。試驗組銀鼓魚每尾腹腔注射0.2 mL濃度分別為1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL的菌懸液，對照組注射等量無菌PBS。接種后觀察并記14 d內魚的發(fā)病死亡情況，及時剖檢瀕死試驗魚，并再次對其致病菌進行分離鑒定。使用改進的寇氏法[6]計算半數致死量(LD50)。

1.2.5 海豚鏈球菌主要毒力基因的PCR檢測 毒力基因pgmA和cfi的引物參照熊向英等[7]的方法設計合成，其余毒力基因scpI、simA、pdi、sagA和cpsD的引物參照Baums等[8]的方法設計合成。用PCR檢測分離菌株攜帶scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7個主要毒力基因的情況，各毒力基因的引物序列、目的片段大小及退火溫度見表1。PCR體系20 μL，同“1.2.3節(jié)”16S rRNA的PCR擴增。PCR反應程序：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，按各基因的退火溫度(表1)，退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共進行36個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。取5 μL PCR擴增產物，用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR擴增反應產物和長度。

1.2.6 藥敏試驗 采用K-B法[9]測定分離菌株對18種抗菌藥物的敏感性。將分離菌株菌懸液濃度稀釋至 1.0×108CFU/mL，均勻涂布于M-H血瓊脂培養(yǎng)基，貼上藥敏紙片，倒置于生化培養(yǎng)箱，在28 ℃下培養(yǎng)24 h后，使用游標卡尺測量抑菌圈大小，并按照產品說明書判定菌株的耐藥性，試驗設置3個重復并取其平均值。

2 結果與分析

2.1 患病銀鼓魚的臨床癥狀

患病銀鼓魚離群獨游，靠岸打轉，體表特征為腹部腫脹，鰭基部充血發(fā)紅(圖1A)，眼球突出、充血(圖1B)；剖檢發(fā)現，腸道內有積水或黃色黏液，肝臟萎縮、發(fā)黃(圖1C)。

A—鰭基部充血發(fā)紅；B—眼球突出、充血；C—腸道積液、肝臟萎縮。A—red and congested fins；B—exophthalmos and hyperemia；C—intestinal effusion and liver atrophy.圖1 患病銀鼓魚的臨床癥狀Fig.1 Clinical syndrome of diseased Selenotoca multifasciata

2.2 組織病理學變化

對患病銀鼓魚進行組織病理觀察發(fā)現，各組織器官均有不同程度的病變?；疾〉你y鼓魚腦膜增厚，伴隨著毛細血管充血，大量淋巴細胞浸潤(圖2A)，且腦膜疏松水腫(圖2B)；眼球的脈絡膜血管細胞崩解、脫落(圖2C)；心外膜增厚且伴隨著炎性細胞浸潤(圖2D)；肝實質出現空泡變性，肝細胞有多灶性壞死(圖2E)；脾實質組織多處液化壞死、疏松(圖2F)，伴隨著充血，炎性細胞浸潤；腎小管萎縮、溶解 (圖2G)；鰓基部細胞增生伴有充血(圖2H)；腸道出現空泡樣結構，腸黏膜破裂受損(圖2I)。

2.3 病原菌分離鑒定

2.3.1 病原菌分離與形態(tài)學觀察 從湛江市南三鎮(zhèn)、廉江市和北海市3個不同養(yǎng)殖場的患病銀鼓魚組織中分別分離得到1株優(yōu)勢菌株，命名為BBW S1、BBW S2和BBW S3。3株分離菌株在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，均形成圓形、中央隆起、邊緣光滑、直徑約為0.7 mm的乳白色菌落，同時在血瓊脂平板培養(yǎng)基上生長產生β溶血(透明溶血環(huán))的菌落(圖3A)，經革蘭氏染色后鏡檢觀察，均為紫色鏈狀革蘭氏陽性菌(圖3B)。

A—血瓊脂平板菌落形態(tài)；B—革蘭氏染色后菌體的顯微觀察。A—colony morphology on blood agar；B—microscopic observation of bacterial strains after Gram staining.圖3 分離菌株的菌落和菌體形態(tài)特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of isolated strains

2.3.2 生理生化鑒定 從表2可見，3株分離菌株在10 ℃不生長，在37、45 ℃生長，溶血類型為β溶血，均可發(fā)酵麥芽糖、木糖、七葉苷、葡萄糖和蔗糖，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、乳糖、棉子糖和阿拉伯糖，V-P試驗、觸酶試驗、賴氨酸、鳥氨酸、β-半乳糖苷酶和H2S檢測呈陰性，精氨酸雙水解酶呈陽性。其結果與陽性對照組ATCC29178基本一致，符合海豚鏈球菌的生化特性。

表2 病原菌部分生理生化特征Tab.2 Selected physiological and biochemical characteristics of pathogenic bacteria

2.3.3 16S rRNA序列分析 使用細菌16S rRNA通用引物對分離菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3進行PCR擴增后，均獲得預期大小約為1 500 bp的基因片段(圖4)。將測序得到的序列使用BLAST進行比對，結果顯示，均與海豚鏈球菌的同源性最高，一致性均達到99%以上。系統(tǒng)進化分析顯示，分離菌株BBW S1、BBW S2和BBW S3與S.iniae親緣關系最近(圖5)。

綜合分離菌株的形態(tài)特征及生理生化特性，并結合16S rRNA序列、BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結果，判定3株分離菌株BBW S1、BBW S2、BBW S3均為S.iniae。

2.4 人工回歸感染試驗

從表3可見，3株分離菌株的LD50分別為3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL。試驗魚感染發(fā)病的癥狀與自然感染發(fā)病的銀鼓魚相似，從感染發(fā)病死亡的銀鼓魚體中再次分離細菌，均與原分離菌的形態(tài)特征一致，經16S rRNA鑒定仍為S.iniae。因此，確定3株分離菌株均為引起3個地區(qū)人工養(yǎng)殖銀鼓魚暴發(fā)性死亡的病原菌。

表3 銀鼓魚人工感染試驗結果Tab.3 Results of artificial infection of Selenotoca multifasciata

2.5 海豚鏈球菌主要毒力基因的PCR檢測

對3株海豚鏈球菌的scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7種毒力基因進行PCR檢測，均擴增出了預期大小的片段(圖6)，這表明3株海豚鏈球菌均含有以上7種主要的毒力基因。

M—DL2000 DNA marker；1-7—scpI，simA，pdi，sagA，cpsD，pgmA and cfi genes.圖6 海豚鏈球菌主要毒力基因的PCR檢測Fig.6 PCR detection of major virulence genes of Streptococcus iniae

2.6 藥敏檢測

采用紙片擴散法檢測分離菌株對氟苯尼考和恩諾沙星等18種抗菌藥物的敏感性，結果如表4所示，3株分離菌株均對阿莫西林、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、環(huán)丙沙星和多黏菌素B敏感，對頭孢噻吩、青霉素G、紅霉素等耐藥，對氨芐西林、頭孢他啶、慶大霉素、大觀霉素、氟苯尼考、萬古霉素和卡那霉素等有不同程度的敏感性。

表4 菌株的藥物敏感性試驗結果Tab.4 Drug susceptibility results of bacterial strains

3 討論

3.1 病原菌的分離鑒定

從20世紀70年代開始，世界范圍內就陸續(xù)有鏈球菌侵染魚類導致死亡的案例報道，至今鏈球菌依舊是水產養(yǎng)殖動物患病的主要病原菌。海豚鏈球菌由Pier等[10]從亞馬遜淡水海豚中首次分離得到，故被命名為海豚鏈球菌。Kitao等[11]于20世紀80年代首次報道海豚鏈球菌感染魚類，并在患病的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、香魚(Plecoglossusaltivelis)和尼羅羅非魚(Oreochromisnilotica)中分離出海豚鏈球菌。迄今為止，海豚鏈球菌廣泛流行于中國、美國、新加坡、日本、加拿大和澳大利亞等世界各地水域，可感染多種淡水、海水養(yǎng)殖品種及野生魚類，導致魚類大量死亡，對全球水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。此外，海豚鏈球菌還能夠威脅人類的健康與安全，目前，已有多例人感染海豚鏈球菌的報道。在中國已有海豚鏈球菌感染羅非魚(O.niloticus)[12]、 卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[12-13]和斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[14]等相關報道。本研究中，從3個養(yǎng)殖場的患病銀鼓魚中共分離得到3株優(yōu)勢菌BBW S1、BBW S2和BBW S3，通過菌株形態(tài)學、生理生化試驗、16S rRNA序列分析和回歸感染試驗，鑒定其均為海豚鏈球菌，這與羅璋等[4]的研究結果一致，說明銀鼓魚是海豚鏈球菌的天然宿主。

3.2 海豚鏈球菌對銀鼓魚的致病性

魚類感染海豚鏈球菌后的主要臨床癥狀為眼球突出、全身性敗血、心包炎及腦膜炎等[15]。脾臟和腎臟是魚類重要的免疫器官，銀鼓魚感染海豚鏈球菌后，腎臟和脾臟嚴重損傷，進一步降低了銀鼓魚的防御能力，并引發(fā)多器官發(fā)生病變。本研究中，患病銀鼓魚出現腦膜增厚、疏松水腫等特征性病變，表明海豚鏈球菌能夠突破銀鼓魚血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，引起腦膜炎，其與鱘(Acipensersinensis)[16]、羅非魚[17]感染海豚鏈球菌的病理特征相似。此外，本研究中發(fā)現，患病銀鼓魚的肝臟、鰓和腸道均有損傷，表明海豚鏈球菌通過血液循環(huán)到達各組織器官，導致多器官功能受損，最后致魚器官衰竭死亡。

本研究中，人工回歸感染試驗顯示，BBW S1、BBW S2和BBW S3的LD50分別為3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL，且受感染的銀鼓魚與自然發(fā)病銀鼓魚癥狀相似，說明3株海豚鏈球菌均對銀鼓魚具有較強的致病性。3株分離菌株間的LD50與雜交鱘源海豚鏈球菌的LD50(1.20×105CFU/mL)[18]及西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)源海豚鏈球菌的LD50(3.20×106CFU/mL)[19]值存在差異，說明海豚鏈球菌株的致病性與菌株來源、 宿主種類和大小等有關。

3.3 銀鼓魚海豚鏈球菌的毒力基因檢測

海豚鏈球菌編碼的大量毒力因子與其致病機制密切相關，在細菌黏附、定植、侵入和體內增殖及免疫逃逸等方面起著重要作用。研究表明，鏈球菌的致病力取決于細菌在宿主免疫細胞中的存活，以及感染、誘導細胞凋亡的能力[20]。simA基因編碼的M蛋白是高度保守的毒力因子，在海豚鏈球菌的致病過程中起著重要作用，能夠為海豚鏈球菌提供抗吞噬細胞的吞噬作用，有助于海豚鏈球菌對細胞的黏附和侵染[21]；sagA基因編碼的溶血素S是目前已知最有效的細胞毒素之一[22]，能夠破壞紅細胞、血小板、中性粒細胞和淋巴細胞等細胞膜，以及線粒體、溶酶體等亞細胞器[23]；scpI基因編碼的C5a肽酶能夠水解中性粒細胞化學誘導物補體因子C5a，有助于海豚鏈球菌黏附宿主上皮細胞[21]；pdi基因編碼的脫乙酰基酶能夠使海豚鏈球菌對溶酶體產生耐受，增強海豚鏈球菌對宿主細胞的黏附和入侵能力[24]；cps編碼的莢膜多糖能夠調節(jié)和抑制吞噬細胞的吞噬，阻止宿主補體因子C3a的沉積，也能增強溶血素S的生成[25]；pgmA基因編碼的葡萄糖磷酸變位酶對海豚鏈球菌的毒力至關重要，在維持正常的細胞壁形態(tài)、莢膜表達和抵抗先天免疫清除機制中發(fā)揮作用，參與細胞壁和莢膜生物合成，并能抵抗陽離子抗菌肽[26]；cfi基因編碼的CAMP因子能使海豚鏈球菌以兩種方式侵害宿主機體，第一種是協(xié)同其他能夠分泌鞘磷脂酶的細菌溶解宿主細胞膜，第二種是結合免疫球蛋白Fc片段，攔截抗體向補體釋放抗原[27]。海豚鏈球菌的致病力完全取決于其毒力因子，對菌株致病力的判斷可以通過檢測毒力因子加以辨別[28]。本研究中，對海豚鏈球菌7種主要毒力基因進行PCR檢測，均能擴增出相應大小的條帶，這與熊向英等[7]對卵形鯧鲹源海豚鏈球菌及白明煥等[29]對鱘源海豚鏈球菌的毒力基因檢測結果高度相似，均含有上述毒力基因，表明3株海豚鏈球菌均為強毒株型。

3.4 海豚鏈球菌病的防治

魚類鏈球菌病的發(fā)生是由環(huán)境、宿主和病原菌共同作用的結果，對其防治措施主要包括改善養(yǎng)殖水環(huán)境、免疫預防和藥物治療等方法。接種疫苗是預防鏈球菌病的有效方法，目前研發(fā)的海豚鏈球菌疫苗主要有滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗。如王靜波等[30]利用分離自患病雜交鱘的海豚鏈球菌制備滅活疫苗免疫雜交鱘，其相對保護率(RPS)高達92.8%；Locke等[21]將構建的海豚鏈球菌△simA突變菌株作為減毒疫苗，對條紋鱸(Moronesaxatilis)和斑馬魚(Daniorerio)均顯示出較好的保護效果。目前，國外已有商品化的海豚鏈球菌疫苗。在養(yǎng)殖生產中，使用抗菌藥物來預防和治療細菌類疾病是最為簡單和便捷的方法，藥物敏感性試驗對臨床合理選擇抗菌藥物不僅具有重要的指導意義，而且能夠避免因濫用抗生素而導致細菌的耐藥性增強，減少多重耐藥性菌株的產生。本研究中，自患病銀鼓魚分離的3株海豚鏈球菌均對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素等8種抗菌藥物敏感，參考2020年6月農業(yè)農村部發(fā)布的最新《水產養(yǎng)殖用藥明白紙》，銀鼓魚發(fā)病后，可采用水產用鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星粉對銀鼓魚海豚鏈球菌病進行治療。對于不同規(guī)格和養(yǎng)殖環(huán)境的患病銀鼓魚，其給藥途徑、劑量和間隔時間等尚需要進一步研究，以便制定合理方案，確?？茖W用藥。此外，應鼓勵開發(fā)綠色和安全的防治技術，如開發(fā)免疫調節(jié)劑、益生菌和中草藥等綠色抗生素替代藥物。

4 結論

1)從北部灣地區(qū)3個不同地域的養(yǎng)殖銀鼓魚中共分離出3株優(yōu)勢菌BBW S1、BBW S2和BBW S3，經形態(tài)學、生理生化和16S rRNA序列分析鑒定，均為海豚鏈球菌。3個菌株對銀鼓魚的半數致死量(LD50)分別為3.75×105、7.11×105、4.85×105CFU/mL，均具有較強致病性。

2)海豚鏈球菌可造成銀鼓魚腦、肝和脾等多臟器不同程度損傷，表現為變性、壞死及炎性細胞浸潤等。

3)3株海豚鏈球菌均攜帶scpI、simA、pdi、sagA、cpsD、pgmA和cfi7種毒力基因，屬于強毒株型。

4)根據藥敏試驗結果，在海豚鏈球菌引起銀鼓魚鏈球菌病的防治中，推薦交替使用水產用鹽酸多西環(huán)素粉和恩諾沙星粉，并分別執(zhí)行750度日和500度日的休藥期。