一株蝦源假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)的分離鑒定及口服后對對蝦體內弧菌的影響

朱娜，王秀華，張紅芳，李婷，王平，張雪梅

(1.浙江海洋大學 水產學院，浙江 舟山 316022；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業(yè)農村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室，山東 青島 266071；3.海南中正水產科技有限公司，海南 東方 572632)

中國養(yǎng)殖對蝦年產量已經突破200萬t[1]，對蝦養(yǎng)殖業(yè)已成為漁業(yè)經濟的重要支柱。然而在對蝦養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，對蝦疾病也成為影響產業(yè)發(fā)展的關鍵問題，特別是近年來新出現(xiàn)的由病原菌感染導致的對蝦急性肝胰腺壞死病、玻璃苗癥等，給中國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重危害[2-3]。目前，已確定的對蝦病原有副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[4]、哈維氏弧菌(V.harveyi)[5]、坎貝氏弧菌(V.campbellii)[6]、歐文氏弧菌(V.owensii)[7]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[8]和美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)[9]等。

水產養(yǎng)殖中對細菌病的防控方法，傳統(tǒng)上多采用抗生素進行處理[10]，而抗生素的使用可對環(huán)境及人類健康產生較多的潛在危害[11]。近年來，為滿足市場對綠色健康水產品的需求，水產動物疾病的生物防控技術受到了廣泛重視，其中，益生菌已廣泛用于水產養(yǎng)殖中的多個環(huán)節(jié)[12]，并在改善水質、提高養(yǎng)殖動物免疫力、促進魚蝦腸道健康等方面發(fā)揮了不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在海洋環(huán)境中有些假交替單胞菌屬的細菌能夠分泌抑菌物質[13-14]，并表現(xiàn)出極大的潛在開發(fā)前景。

本研究中，從海南一個對蝦育苗場的蝦苗池水中，分離到一株對對蝦多種病原菌具有明顯抑制作用的海洋細菌，并對該菌的分類地位進行了初步的研究，開展了該菌對多種病原菌的拮抗效果評價，分析了該菌株的生物安全性及應用效果，以期為解決對蝦細菌病危害嚴重的問題提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株安全性評價所用凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)購于山東濰坊某對蝦養(yǎng)殖場，體長為(7.40±0.49)cm，體質量為(4.26±0.21)g。養(yǎng)殖用凡納濱對蝦來源于海南某育苗場，體長為(3.14±0.33)cm，體質量為(0.26±0.02)g。

弧菌拮抗用指示菌分別為副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌；攻毒感染試驗中，對照組細菌用副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；溶血對照組細菌及生理生化鑒定用參考菌株為殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida2515)[15](以下簡稱“2515”)。上述菌株均來自農業(yè)農村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室。

羊血平板購自北京陸橋技術股份有限公司，魚血平板制備參考張宇哲等[15]的方法。

1.2 方法

1.2.1 菌株采集與分離純化 從海南省某對蝦育苗場蝦苗池中采集水樣，置于1.5 mL無菌離心管，低溫保存帶回實驗室。在無菌條件下，取水樣于2216E平板上劃線分離純化，共分離出15株海洋細菌，通過平板點種法篩選出一株對哈維氏弧菌、副溶血弧菌和歐文氏弧菌均具有拮抗作用的菌株，編號為2021041402-14(簡稱“菌株02HN”)，將純培養(yǎng)后的菌株02HN保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌的篩選 將副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌分別接種于2216E液體培養(yǎng)基，在28 ℃下以150 r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌PBS稀釋成濃度為1×107CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液均勻涂布于2216E固體平板。用接種環(huán)挑取少量活化24 h的待篩選菌株，點種于上述平板上，并對各測試菌株進行編號，于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察點樣區(qū)是否有透明抑菌圈，每個樣品設3個平行。

1.2.3 拮抗菌抑菌效果的測定 參考李靜舒等[16]的方法，采用牛津杯打孔法進行拮抗菌抑菌效果的測定。分別取濃度為1×107CFU/mL的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌的發(fā)酵液100 μL，均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，用牛津杯在平板上等距打4個孔，其中，2個孔內放置50 μL拮抗菌發(fā)酵液(濃度為1×108CFU/mL)，另2個孔放置50 μL無菌PBS作為空白對照，每個平板設3個重復，待菌液被完全吸收后，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用游標卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑，結果取3個平行的平均值。

1.2.4 最低抑菌濃度的測定 將濃度為2.32×108CFU/mL的拮抗菌發(fā)酵液，用無菌PBS進行10倍梯度稀釋，最低稀釋到2.32×102CFU/mL，參照“1.2.3節(jié)”的方法，以濃度為1×107CFU/mL的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌為指示菌，進行各稀釋梯度發(fā)酵液的抑菌試驗，每個平板打4個孔，用無菌PBS作為空白對照，每個平板設3個平行，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌情況。參照李成海等[17]的判斷方法，結果用“+”或“—”表示。

1.2.5 菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

1)16S rRNA基因鑒定。將菌株發(fā)酵液以4 300g離心5 min，棄上清液，菌體用PBS緩沖液離心洗滌2次后，用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA[天根生化科技(北京)有限公司]。以提取的細菌DNA為模板，采用細菌16S rRNA序列擴增的通用引物27F(5′ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′)和1492R(5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′)進行PCR擴增。PCR反應體系(共25 μL)：ddH2O 9.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL[寶生物工程(大連)有限公司]。PCR擴增條件：94 ℃下預變性10 min；94 ℃下變性50 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1.5 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果用NCBI數(shù)據庫的BLAST進行同源性比對，采用MEGA 7.0軟件將菌株與同源性較高的其他菌株序列進行多重序列比較，并通過鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步判定菌株種類。

2)gyrB與rpoD基因鑒定。反應體系(共25 μL)：ddH2O 9.5 μL，DNA模板 1.0 μL，上、下引物各1.0 μL(表1)，Premix Taq酶12.5 μL。擴增條件：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min。PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果用BLAST進行同源性比對，選取同源性較高的其他菌株基因序列，結合標準菌株相應的基因序列進行多重序列比對，并通過鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株生化鑒定 參考Khalifa等[20]的方法，采用Biolog Gen Ⅲ微生物鑒定系統(tǒng)(Biolog，美國)對菌株02HN進行生理生化鑒定。以殺魚假交替單胞菌2515為參考菌株，具體操作步驟參考Biolog Gen Ⅲ MicroPlate使用說明書，采用Microlog 3軟件讀取試驗結果。

1.2.7 菌株02HN對對蝦的生物毒性測試 采用2216E海水培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵菌株02HN、副溶血弧菌和枯草芽孢桿菌24 h，發(fā)酵液經4 000g離心10 min，將離心后的沉淀用PBS洗滌2次備用。采用浸泡攻毒方法評價菌株02HN對對蝦的安全性，將暫養(yǎng)1周的健康凡納濱對蝦分別置于16個有效水體為20 L的水槽中，每個水槽中放對蝦10尾。試驗設菌株02HN組、陽性對蝦組、陰性對照組和空白組4個組。其中，菌株02HN組，設置菌株終濃度分別為1.70×108、1.70×107、1.70×106、1.70×105、1.70×104CFU/mL；陽性對照組為副溶血弧菌組，設置菌株終濃度分別為1.55×108、1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104CFU/mL；陰性對照組為枯草芽孢桿菌組，設置菌株終濃度分別為1.58×108、1.58×107、1.58×106、1.57×105、1.56×104CFU/mL；空白對照組只添加PBS。浸泡感染24 h后正常投喂、吸污、日換水50%，養(yǎng)殖水溫為(26.0～29.0)℃，pH為7.8±0.5，鹽度為32。每日記錄對蝦死亡情況，至各組對蝦穩(wěn)定后，統(tǒng)計對蝦累計死亡率。整個感染試驗重復兩次，采用SPSS 16.0軟件計算對蝦的半致死濃度(LC50)，安全濃度定義為LC50的1/10。

1.2.8 菌株02HN的溶血活性 28 ℃條件下于2216E平板上接種菌株02HN及對照用殺魚假交替單胞菌2515，培養(yǎng)24 h后刮取菌落，分別用PBS制成濃度為1.90×109CFU/mL、1.75×109CFU/mL的菌懸液，各取5 μL等距點種在羊血和魚血瓊脂平板上，每種菌株設3個重復。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察溶血情況。

1.2.9 菌株02HN在對蝦養(yǎng)殖中的抑菌效果試驗

1)飼料制備及試驗設計。參照王楓林等[21]的方法進行飼料制備。通過搖瓶發(fā)酵菌株02HN獲取菌體，采用平板涂布法測定02HN發(fā)酵液濃度后，按照含量1×105、1×107cells/g將02HN發(fā)酵菌液添加到對蝦原飼料中，以質量分數(shù)為1%的褐藻酸鈉為黏合劑進行制粒，作為試驗組飼料，空白對照飼料不添加菌株，在常溫下晾干備用。

試驗設置2個含菌飼料投喂組(含菌株02HN 1×105、1×107cells/g飼料)，另設1個空白對照組，投喂不含菌株的飼料。每個處理組設置4個重復，其中1個組用于補齊其他3個組采樣后的對蝦數(shù)量。對蝦養(yǎng)殖于體積為60 L的水族箱中，有效水體為40 L，每個箱內隨機放養(yǎng)30尾健康凡納濱對蝦。各組每天按照飼料量的70%添加蔗糖，以培養(yǎng)生物絮團控制養(yǎng)殖池水體中的氨氮含量[22]，每日投喂3次，日投喂量為對蝦體質量的3%，試驗的第一周不換水，之后每天換水10%。養(yǎng)殖期間水溫為(27.0±2.2)℃，鹽度為32.1±1.8，連續(xù)充氣。

2)對蝦腸道及肝胰腺中的弧菌定量。于養(yǎng)殖試驗開始后的第3天和結束時(第28天)，從各組取樣，分析其腸道及肝胰腺中的弧菌數(shù)量，取樣前12 h停止投喂。從每組隨機取對蝦3尾，無菌條件下剪取部分對蝦腸道和肝胰腺，精確稱重后加入10倍質量的PBS緩沖液并充分研磨，再進行10倍梯度稀釋(肝胰腺樣品進行101～103倍稀釋，腸道樣品進行102～104倍稀釋)，取每個稀釋后的樣品100 μL涂布于TCBS平板上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，取菌落數(shù)為10～100的平板計數(shù)。每個樣品涂布3個平行樣。

3)對蝦存活率及生長率測定。在養(yǎng)殖試驗結束時，記錄每組蝦的存活數(shù)，統(tǒng)計各組蝦的生物學體長，并計算存活率(RS，%)和體長增長率(GBL，%)。計算公式為

RS=Nt/N0×100%，

GBL=(Lt-L0)/L0×100%。

其中：Nt為試驗結束時對蝦存活的數(shù)量(ind.)；N0為試驗初始時對蝦的數(shù)量(ind.)；Lt、L0分別為試驗結束時和初始時對蝦的體長(cm)。

4)生物絮團定量。養(yǎng)殖試驗結束時，對養(yǎng)殖水體中生物絮團量進行測定，在距離水面20 cm處，用滅菌的50 mL離心管取3個不同點的水樣各40 mL，以4 000g離心10 min后棄上清液，取絮團濕質量進行稱重后，計算絮團的濃度。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

菌株02HN在2216E平板上的菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，橙黃色。用副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌測試菌株02HN的拮抗作用(圖1)，可見菌株02HN對6株致病菌的生長均具有一定的抑制作用，但抑制效果存在差異。

A～F—副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌。A-F—V.parahaemolyticus，V.harveyi，V.cambellii，V.owensii，V. alginolyticus and P.damselae，respectively.圖1 菌株02HN對6株蝦病原菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of strain 02HN against 6 strains of shrimp pathogenic bacteria

測量菌株02HN對6株蝦病原菌的抑菌圈直徑，結果顯示，菌株02HN對病原菌抑制效果最強的是哈維氏弧菌，其次是歐文氏弧菌，溶藻弧菌的抑菌圈直徑最小(表2)。

表2 菌株02HN對不同病原菌的拮抗效果評價Tab.2 Evaluation of antagonistic effect of strain 02HN against different pathogenic bacteria

2.2 菌株02HN對6株致病菌的最低抑菌濃度

菌株02HN發(fā)酵液經10倍梯度稀釋后，檢測不同濃度菌液對6株致病菌的最低抑菌濃度，結果顯示，菌株02HN對歐文氏弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人魚發(fā)光桿菌的最低抑菌濃度分別為2.32×104、2.32×103、2.32×106、2.32×106、2.32×103、2.32×106CFU/mL(表3)。表明菌株02HN對哈維氏弧菌和副溶血弧菌2種對蝦病原菌極為敏感。

表3 菌株02HN對6株蝦病原菌的最低抑菌濃度Tab.3 Minimum inhibitory concentration of strain 02HN against 6 pathogens bacteria of shrimp

2.3 菌株的分子鑒定

用PCR擴增菌株02HN的16S rRNA序列，結果顯示，16S rRNA擴增產物經測序得到1 437 bp的基因序列(圖2)，將該序列提交到GenBank(登錄號ON619585)。將測得的序列在NCBI上進行BLAST同源性分析，結果顯示，該菌株與殺魚假交替單胞菌(KY366347.1)的一致性最高，為99.7%。選取與菌株02HN同源性較高的假交替單胞菌及其他屬細菌的15個16S rRNA序列，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)，結果顯示，該菌株與殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)聚為一支，表明菌株02HN為一株假交替單胞菌。

M—DL2000 DNA marker；1—16S rRNA基因；2—gyrB基因；3—rpoD基因；4～6—空白對照。M—DL2000 DNA marker；1—16S rRNA gene；2—gyrB gene；3—rpoD gene；4-6—blank control.圖2 菌株02HN管家基因電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of housekeeping gene of strain 02HN

節(jié)點數(shù)字表示bootstrap支持率，1 000次重復，下同。Numbers at nodes indicate the percentage of bootstrap support after 1 000 replicates，et sequentia.圖3 基于16S rRNA序列構建的菌株02HN與相近菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 02HN and its closest relatives based on 16S rRNA sequence

用PCR擴增菌株02HN的gyrB和rpoD基因序列，對擴增產物進行測序，將測得的核苷酸序列在NCBI上進行BLAST同源性分析，結果顯示，兩個基因均與殺魚假交替單胞菌的核苷酸序列一致性最高，分別為99.66%和99.86%?；趃yrB-rpoD串聯(lián)基因序列構建菌株02HN的系統(tǒng)進化樹，結果顯示，菌株02HN的分類地位界于P.piscicida與P.flavipulchra之間(圖4)，表明菌株02HN為假交替單胞菌屬中的一個種。

圖4 基于gyrB-rpoD串聯(lián)基因序列構建的菌株02HN的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 02HN and its closest relatives based on gyrB-rpoD sequence

2.4 菌株02HN的生化鑒定

采用Biolog Gen Ⅲ微孔板細菌鑒定系統(tǒng)，測試菌株02HN的94個表型(表4)。從表4可見，菌株02HN對26個檢測指標表現(xiàn)出陽性，而參考菌株2515對31個檢測指標表現(xiàn)出陽性。菌株02HN和2515均可在1% NaCl、4% NaCl、8% NaCl、乳酸鈉、pH 6、梭鏈孢酸和四唑藍的條件下生長，在林肯霉素中菌株02HN能夠生長，而菌株2515的生長受到抑制；菌株2515可在α-D-葡糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、蜜二糖等存在下生長，而菌株02HN呈陰性反應。這表明，菌株02HN與參考菌株殺魚假交替單胞菌2515在生理生化檢測中存在一定差異。通過Microlog 3軟件讀取菌株02HN的鑒定結果，顯示該菌的最大SIM值及DIST均較低，分別為0.06與14.25，表明該數(shù)據庫中無分類地位與之匹配的菌株。

表4 菌株02HN的生化鑒定結果Tab.4 Biochemical identification results of strain 02HN

2.5 菌株02HN對對蝦的生物毒性

用不同濃度的菌株02HN浸泡感染凡納濱對蝦，試驗至6 d后統(tǒng)計其死亡率(表5)。養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，菌株02HN高濃度組(1.70×108CFU/mL)在感染后48 h內無死亡，至第3天時有一只對蝦死亡，而在第5天時1.70×107CFU/mL組也有一只對蝦死亡；陽性對照副溶血弧菌的2個高濃度組(1.55×108、1.55×107CFU/mL)，在浸泡24 h內死亡率分別高達100%、90%，感染后的對蝦空腸空胃，肝胰腺呈淡黃色；陰性對照枯草芽孢桿菌1.58×107CFU/mL組，在試驗第3天時有一只對蝦死亡；空白對照組對蝦活力正常，無死亡。菌株02HN浸泡感染對蝦的LC50為1.96×1010CFU/mL，安全濃度為1.96×109CFU/mL，副溶血弧菌浸泡感染對蝦的LC50為3.15×106CFU/mL，菌株02HN的LC50是副溶血弧菌的6 222倍，表明菌株02HN在濃度為107CFU/mL以下時，對對蝦生物毒性不明顯。

2.6 菌株02HN的溶血活性

菌株02HN在羊血和魚血瓊脂平板上的溶血效果見圖5，菌株02HN對羊及魚的紅細胞均具有溶血活性，菌株02HN的溶血效果與陽性對照菌株2515在兩種血平板上的溶血活性相似。

圖5 菌株02HN在羊血和魚血平板上的溶血情況Fig.5 Hemolysis of strain 02HN on sheep blood and fish blood agar plates

2.7 菌株02HN在對蝦養(yǎng)殖中的抑菌效果

投喂分別添加菌株02HN含量為1×105、1×107cells/g的飼料養(yǎng)殖凡納濱對蝦28 d后，對蝦的存活率及體長增長率與對照組無顯著性差異(P>0.05)，表明飼料中添加菌株02HN不影響對蝦的生長及存活(表6)。分析各組對蝦肝胰腺、腸道中的弧菌總數(shù)，試驗組與對照組間存在一定差異。養(yǎng)殖3、28 d時，與對照組相比，飼料中分別添加含量為1×105、1×107cells/g的菌株02HN，均能顯著降低蝦肝胰腺中弧菌的數(shù)量(P<0.05)；養(yǎng)殖至第3天時，低菌含量試驗組(1×105cells/g)蝦腸道中的弧菌數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，至第28天時，試驗組與對照組均維持在104數(shù)量級，但低菌含量組顯著高于高菌含量組與對照組(P<0.05)(表7)。統(tǒng)計第28天時各組養(yǎng)殖水體中生物絮團的密度，飼料中添加含量為1×105、1×107cells/g的菌株02HN后，養(yǎng)殖水體生物絮團的密度與對照組均無顯著性差異(P>0.05)(表8)。

表6 各組對蝦的存活率和體長增長率Tab.6 Survival rate and body length growth rate of shrimp in each group

表7 對蝦肝胰腺、腸道中的弧菌數(shù)量Tab.7 Vibrios count in hepatopancreas and intestine of shrimp

表8 各組養(yǎng)殖水體中生物絮團密度Tab.8 Density of biofloc in water of each group

3 討論

3.1 菌株02HN的分離鑒定

假交替單胞菌是由Gaulthier等[23]于1995年發(fā)現(xiàn)并命名的一類好氧異養(yǎng)型不產芽孢、具有鞭毛的革蘭氏陰性細菌。已發(fā)現(xiàn)的假交替單胞菌均分離自海洋環(huán)境，該屬細菌能在甲殼動物、無脊椎動物幼蟲等生物表面附著，多種多樣的適應機制使其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。據研究報道，該屬菌株能夠分泌多種胞外活性物質，包括抗菌溶菌物質、抗生素、抗真菌物質、胞外酶類及胞外多糖等，在海洋生物地化循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，并具有良好的應用前景[24-25]。假交替單胞菌屬細菌分為產生色素和不產生色素兩類，兩類菌產生的生物活性物質在功能上存在較大差異[24]，產生抗菌代謝產物的假交替單胞菌多分泌色素類[26]。本研究中的菌株02HN分離自海水環(huán)境，可產黃色色素，該菌與Biolog Gen Ⅲ 微生物鑒定系統(tǒng)中的已知菌均存在較大差別，不能給出準確的鑒定結果，與已知的殺魚假交替單胞菌2515在測試的94個反應表型中也存在較大區(qū)別，但通過分子生物學、形態(tài)學及生物活性的特點，可綜合判定該菌應為一株假交替單胞菌。

3.2 菌株02HN對病原菌的拮抗效果

許多拮抗菌產生的抑菌物質能夠殺死病原菌或對病原菌的生長起到一定抑制作用。從大菱鲆(Scophthalmusmaximus)養(yǎng)殖水中分離的一株金麗假交替單胞菌(P.flavipulchra)，能合成具有L-氨基酸氧化酶活性的假交替單胞菌抗菌蛋白(PfaP)和5種小分子化合物，對多種弧菌、氣單胞菌和芽孢桿菌具有抑制作用[27]。Wang等[28]從健康凡納濱對蝦體中分離出的兩株假交替單胞菌可以形成黃色菌落，產生氧化酶和水解明膠，兩個菌株均表現(xiàn)出對對蝦肝胰腺壞死病原VpAHPND具有拮抗活性，應用于對蝦養(yǎng)殖中能降低對蝦感染VpAHPND后的死亡率。Richards等[29]研究表明，假交替單胞菌會釋放蛋白水解酶等抗菌物質，并轉移水解囊泡來破壞弧菌。本研究中分離并鑒定的假交替單胞菌02HN，對副溶血弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、溶藻弧菌和美人魚發(fā)光桿菌均表現(xiàn)出良好的拮抗效果，但其拮抗機制還有待深入研究。

3.3 菌株02HN對對蝦的生物毒性

研究發(fā)現(xiàn)，某些假交替單胞菌屬細菌對病原菌有良好的拮抗作用，但也有報道顯示，假交替單胞菌屬中的有些細菌對養(yǎng)殖動物表現(xiàn)出一定的致病性，可產生胞外毒素并引起魚類或蟹類死亡[30]，以及海參潰瘍、腐皮[31]。一株與菌株02HN分類地位相近的假交替單胞菌對魚類紅細胞具有溶血活性，而對對蝦的血細胞無溶血效果[15]。本研究中，菌株02HN為分離自健康對蝦育苗池中的海洋菌，盡管該菌對對蝦的LC50高達1.96×1010CFU/mL，但在攻毒過程中仍然出現(xiàn)個別蝦死亡，表明該菌可能對對蝦存在弱毒性。作為一種對對蝦弧菌病原具有廣譜拮抗效果的潛在益生菌，為使其能在海水養(yǎng)殖中開發(fā)應用，在生物安全性評價方面尚需進行綜合研究，闡明其可能存在毒素的種類、敏感宿主、脫除方法及抗藥性等，確保該菌株在有效的前提下，對養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖環(huán)境及人具有良好的安全性。

3.4 口服菌株02HN對對蝦體內弧菌的抑制作用

Wang等[28]將假交替單胞菌添加到凡納濱對蝦飼料中，結果顯示，對蝦腸道內的弧菌數(shù)有所降低，并顯著降低了受副溶血弧菌感染后的死亡率。胡毅等[32]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌在試驗前期和末期均能顯著降低對蝦腸道的弧菌數(shù)量。本研究中也有類似結果，在飼料中分別添加含量為1×105、1×107cells/g的菌株02HN，對對蝦的生長和存活無顯著性影響。在試驗初及試驗末的兩次檢測中，兩個試驗組與對照組相比均能顯著降低對蝦肝胰腺中的弧菌數(shù)量；而對對蝦腸道中的弧菌數(shù)量，僅低菌含量組弧菌數(shù)在試驗初期有顯著降低，在試驗后期，試驗組對蝦腸道弧菌數(shù)量盡管存在差別，但基本趨于一致，維持在相同的數(shù)量級?？v向比較兩次檢測結果可知，各組肝胰腺中的弧菌數(shù)量隨養(yǎng)殖時間增長而減少，而腸道中的弧菌數(shù)量在高菌含量試驗組與對照組中均出現(xiàn)減少趨勢，在低菌含量試驗組中出現(xiàn)增加趨勢。推測可能是隨著投喂時間的延長，菌株02HN的抗菌成分在肝胰腺中持續(xù)發(fā)揮作用，同時在養(yǎng)殖環(huán)境中因生物絮團養(yǎng)殖系統(tǒng)的穩(wěn)定運行，弧菌的密度也存在逐漸下降的趨勢[33]，但菌株抗菌物質對對蝦腸道中弧菌的抑制效果不顯著，提示對蝦口服菌株02HN后，抗菌活性物質在對蝦消化系統(tǒng)中的代謝機制尚待闡明。

綜上可知，假交替單胞菌菌株02HN對多種對蝦病原菌具有拮抗作用，當飼料中菌株02HN添加量為1×107cells/g以下時，不僅對凡納濱對蝦無明顯的副作用，而且能夠降低肝胰腺中弧菌的數(shù)量，表明該菌具有較高的產業(yè)開發(fā)價值。