單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在人精原干細(xì)胞研究中的應(yīng)用

劉士瑋，羅嘉強(qiáng)，朱子玨，趙亮宇，姚晨成，田汝輝，李 錚，*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海一院臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201066；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科中心男科/上海交通大學(xué)泌尿外科研究所男性健康評估中心，上海 200080

精子發(fā)生包括精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的自我更新、增殖與分化，精母細(xì)胞的減數(shù)分裂，以及精子細(xì)胞變形為成熟精子的過程［1］。SSCs 的自我更新、增殖與分化調(diào)節(jié)過程高度有序，維持精子發(fā)生源源不斷進(jìn)行。闡明SSCs 的分子調(diào)控機(jī)制是構(gòu)建人SSCs 體外誘導(dǎo)分化體系的理論基礎(chǔ)，對于精子發(fā)生研究至關(guān)重要［2］。然而，由于樣本來源以及技術(shù)限制等因素，人SSCs亞型種類及其功能研究甚少，相關(guān)體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究工作迄今效率不高。因此，迫切需要新方法探索不同SSCs亞型及其轉(zhuǎn)錄組水平與功能變化。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的新技術(shù)，可以有效捕獲睪丸內(nèi)單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行高通量測序分析獲取其轉(zhuǎn)錄組水平信息。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序研究僅能分析組織中細(xì)胞群基因表達(dá)平均水平，無法鑒別個(gè)體細(xì)胞的特異基因表達(dá)，因此往往會(huì)忽略細(xì)胞間的差異。2009年，Tang等［3］首次提出單細(xì)胞測序技術(shù)，在此基礎(chǔ)上逐漸演變發(fā)展形成多種單細(xì)胞測序方案。其主要過程包括細(xì)胞懸液樣本制備、單細(xì)胞捕獲、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增、文庫構(gòu)建、測序及后續(xù)分析［4］。scRNA-seq能夠精細(xì)描述細(xì)胞類型、揭示細(xì)胞異質(zhì)性并推測其發(fā)育軌跡［5］。因此，scRNA-seq 獨(dú)特而強(qiáng)大，可分析睪丸個(gè)體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征，在檢測數(shù)千個(gè)甚至更多細(xì)胞時(shí)，不會(huì)忽略細(xì)胞間差異，更能代表整個(gè)睪丸的細(xì)胞組成（圖1）。近年來，scRNA-seq技術(shù)在人睪丸細(xì)胞的研究應(yīng)用不斷被報(bào)道［6-8］，本文旨在綜述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在人SSCs研究中的應(yīng)用，以期揭示SSCs 亞型種類及其轉(zhuǎn)錄組水平和生物學(xué)功能變化，為SSCs的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

圖1 人睪丸scRNA-seq分析流程圖Figure 1 Flow chart of human testis scRNA-seq analysis

1 基于scRNA-seq技術(shù)揭示SSCs起源

SSCs 起源于原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs），作為精子發(fā)生源頭維持產(chǎn)生成熟配子。然而，人PGCs 向SSCs 分化這一過程涉及的轉(zhuǎn)錄組水平及功能變化仍未完全闡明，scRNA-seq 技術(shù)有助于認(rèn)識(shí)這一變化過程。

Guo 等［8］將scRNA-seq 鑒定出的成人原始SSCs（stage 0階段）與嬰兒（12～13個(gè)月）生殖細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理及擬時(shí)序分析。結(jié)果表明，大部分stage 0 階段的基因標(biāo)志物（PIWIL4、TSPAN33 等）在嬰兒生殖細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，發(fā)育軌跡上兩者位置毗鄰，提示該嬰兒生殖細(xì)胞可能是PGCs演變成SSCs的過渡階段。后期，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對胚胎期（6～8周）、胎兒期（12、15、16 周）和嬰兒期（5 個(gè)月）睪丸進(jìn)行scRNA-seq分析，并與前期成人睪丸scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在SSCs形成前期過程，共鑒定出2種細(xì)胞階段，包括：①PGCs 階段（存在于胚胎、胎兒期）：特異表達(dá)TFAP2C、KIT、NANOG、POUF51、SOX17等基因；②stage f0階段（存在于胎兒、嬰兒期）：特異表達(dá)PIWIL4、EGR4、MSL3、TSPAN33 等基因［9］。該發(fā)現(xiàn)與前期Sohni 等［6］在嬰兒期睪丸scRNA-seq 分析工作中鑒定的PGCs 及前SSCs 階段相吻合。進(jìn)一步，該團(tuán)隊(duì)對兩階段的特異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋，發(fā)現(xiàn)PGCs 階段與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、性腺和干細(xì)胞發(fā)育等生物學(xué)功能有關(guān)，在進(jìn)入胎兒期時(shí)，這些功能通路受到明顯抑制；stage f0 階段中涉及轉(zhuǎn)錄、同源異形的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)SSCs 基因標(biāo)志物開始表達(dá)。該團(tuán)隊(duì)觀察到stage f0至原始SSCs的轉(zhuǎn)變是SSCs基因標(biāo)志物表達(dá)的持續(xù)升高，而不是大量新基因的出現(xiàn)，這提示該轉(zhuǎn)變過程可能是PGCs 分化至SSCs 的過渡階段。進(jìn)一步，通過免疫染色實(shí)驗(yàn)證明，在胚胎至胎兒階段，NANOG（PGCs 基因標(biāo)志物）和MKI67（增殖基因標(biāo)志物）表達(dá)降低；在早期胎兒期，PIWIL4（SSCs基因標(biāo)志物）被檢測出。

以上表明，PGCs 至原始SSCs 的轉(zhuǎn)變可能發(fā)生于早期胎兒階段，涉及類多能性、增殖活性等生物學(xué)功能的抑制，以及SSCs 基因標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，提示在嬰兒乃至胎兒階段，原始SSCs 雛形逐步形成。同時(shí)，鑒定發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)于PGCs 階段基因標(biāo)志物，包括ETV4、PIM2、POU5F1、PHLDA3、PDPN、ITM2C、RNPEP 和THY1，stage f0（SSCs前階段）基因標(biāo)志物，包括RHOXF1、STK31、CSRP2、ASZ1、SIX1和THRA。該組基因可能在人PGCs 向原始SSCs 轉(zhuǎn)化過程中，如SSCs 基因標(biāo)志物的表達(dá)調(diào)控、多能性抑制等方面起到重要作用，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制。

2 基于scRNA-seq揭示人SSCs亞型及其基因標(biāo)志物

基于形態(tài)學(xué)分析，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為人精原細(xì)胞包括A pale（Ap）、A dark（Ad）、B型精原細(xì)胞［10］。Ap和Ad 型精原細(xì)胞代表人SSCs 的不同階段，Ad 型SSCs相對靜止，Ap型SSCs相對活躍，Ad型精原細(xì)胞可進(jìn)行自我更新或分化為Ap型精原細(xì)胞，后者可分化產(chǎn)生B 型精原細(xì)胞［11-12］。然而，僅依賴形態(tài)學(xué)方法描述人SSCs 是不準(zhǔn)確的，有研究使用PAS 染色法（periodic acid-Schiff stain，PAS）、蘇木精伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）及免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)部分Ap 與Ad 型精原細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平結(jié)果相似，提示兩者可能為同一細(xì)胞類型［13］。因此，需要更精細(xì)、準(zhǔn)確的方法鑒定、描述人SSCs亞型。

目前基于scRNA-seq 技術(shù)，結(jié)合已報(bào)道精原細(xì)胞基因標(biāo)志物，鑒定出4種精原細(xì)胞亞型，包括早期未分化精原細(xì)胞（相對靜止、SSC-1）、晚期未分化精原細(xì)胞（相對活躍、SSC-2）、分化中精原細(xì)胞（早期分化精原細(xì)胞）、分化精原細(xì)胞［6，8，13-15］。

Wang 等［16］對scRNA-seq 分析獲得的SSCs 亞群進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)NANOS2、ZBTB16、SALL4、POU3F1、UTF1、NANOS3 高表達(dá)于該亞群。進(jìn)一步分析該SSCs 亞群，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部存在異質(zhì)性，對該亞群進(jìn)行降維處理，鑒定出2 種不同的SSCs 表達(dá)模式，包括SSC-1：GFRA1lowUTF1high（基因標(biāo)志物：PIWIL4）；SSC-2：GFRA1highUTF1low（基因標(biāo)志物：ASB9、LITD1），后期Guo等［8］單細(xì)胞測序工作中鑒定發(fā)現(xiàn)的SSCs亞群stage 0、1階段，與其表達(dá)模式類似。

Guo 等［8］通過scRNA-seq 對未分化精原細(xì)胞簇進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)一種更早期階段細(xì)胞亞群，將其與嬰兒生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有很大共性。同時(shí)，擬時(shí)序分析結(jié)果表明該亞群與嬰兒生殖細(xì)胞位置相鄰，均位于發(fā)育軌跡的起始，提示該精原細(xì)胞亞群可能是最原始SSCs（stage 0 階段）。其中，stage 0 階段特異表達(dá)PIWIL4、EGR4、TSPAN33、PHGDH、PPP1R36、ICA1L等，早期已鑒定SSCs基因標(biāo)志物ID4、FGFR3、TCF3 和UTF1在stage 0、1階段均表達(dá)。通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)PIWIL4、PHGDH、SLC25A22、ICA1L、PPP1R36、MAGEB1、EGR4、MSL3、TSPAN33 特異表達(dá)于stage 0 階段，GFRA1、ETV5、L1TD1 特異表達(dá)于stage 1 階段，KIT、MKI67特異表達(dá)于stage 2 階段及分化精原細(xì)胞，而UTF1、FGFR3和TCF3在三階段均表達(dá)。

Sohni等［6］通過scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)2種SSCs亞群，包括早期SSCs（SSC-1）及晚期SSCs（SSC-2）。分析過程中發(fā)現(xiàn)SSC-1 亞群內(nèi)部存在異質(zhì)性，對其進(jìn)行進(jìn)一步聚類分析，鑒定發(fā)現(xiàn)出3個(gè)子亞群，將其命名為SSC-1A、SSC-1B 和SSC-1C。擬時(shí)序分析揭示其發(fā)育軌跡：SSC-1B→SSC-1A、SSC-1C→SSC-2，這提示SSC-1B 可能是原始SSCs。對各階段基因標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，SSC-1A 中包括A2M、ENO3；SSC-1B 中包括C19orf84、EGR4、FSD1；SSC-1C 中包括NANOS2；SSC-2中包括ID4、GFRA1、NANOS3。進(jìn)一步通過免疫染色驗(yàn)證EGR4、FSD1、LPPR3、PIWIL4 和TSPAN33 可作為原始SSCs（SSC-1B）的新型基因標(biāo)志物，與已知SSCs 基因標(biāo)志物UTF1、GFRA1 共染，比較發(fā)現(xiàn)LPPR3、PIWIL4 較UTF1 可作為原始SSCs更特異的基因標(biāo)志物。同時(shí)，利用熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)（fluorescence-activatedcell sorting，F(xiàn)ACS），發(fā)現(xiàn)膜蛋白編碼基因LPPR3 和TSPAN33 標(biāo)記志更局限的睪丸細(xì)胞群，表明其作為原始SSCs基因標(biāo)志物的可行性。在Persio等［17］單細(xì)胞測序工作中鑒定類似的SSCs亞群，包括stage 0階段（PIWIL4、PHDGH、EGR4）；stage 0A 階段（UTF1、SERPINE2、FGFR3）；stage 0B（NANOS2）；stage 1 階段（GFRA1、GFRA2、NANOS3、ID4），其發(fā)育軌跡為stage 0→stage 0A、stage 0B→stage 1。

綜上所述，目前scRNA-seq 研究中鑒定出4 種SSCs亞型，包括原始精原干細(xì)胞階段SSC-0，基因標(biāo)志物包含C19orf84、EGR4、FSD1、PHDGH、LPPR3、PIWIL4和TSPAN33；中間階段SSC-1A與SSC-1B，基因標(biāo)志物包含A2M、ENO3、UTF1、SERPINE2、FGFR3 和NANOS2；晚期精原干細(xì)胞SSC-2，基因標(biāo)志物包含GFRA1、GFRA2、NANOS3、ID4。這些基因標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有助于鑒定不同SSCs 亞型，并推測各亞型可能的生物學(xué)功能。然而，鑒于個(gè)體之間遺傳差異，不同研究結(jié)果有所偏差。同時(shí)，各基因標(biāo)志物的表達(dá)定位及作用功能需進(jìn)一步驗(yàn)證、闡明。

3 基于scRNA-seq 探索人SSCs 自我更新、增殖與分化調(diào)控機(jī)制

SSCs 通過自我更新保持自身細(xì)胞群數(shù)量的恒定，對于生育力維持至關(guān)重要。Hermann 等［14］聚焦于人、小鼠SSCs亞群，scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF 均表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)EIF2、mTOR 和p70S6K 的翻譯，這可能是一種驅(qū)動(dòng)SSCs 自我更新轉(zhuǎn)錄本選擇性翻譯的機(jī)制。小鼠研究中，GDNF 通過作用于未分化精原細(xì)胞上的RET 酪氨酸激酶，對SSCs的自我更新起到重要作用［18］。在Wang等［16］研究中，GO注釋發(fā)現(xiàn)SSCs亞群富集于“基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控”和“細(xì)胞生物合成過程的負(fù)調(diào)控”等生物學(xué)功能過程，表明該亞群細(xì)胞狀態(tài)相對靜止。基于scRNA-seq 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）相關(guān)受體FGFR1、FGFR2、FGFR3高表達(dá)于未分化精原細(xì)胞中，F(xiàn)GF在維持SSCs 自我更新上起到重要作用。其中，F(xiàn)GF8-FGFR1信號(hào)可能通過激活ERK1/2信號(hào)通路來維持SSCs自我更新［19］；FGF 可通過激活MAPK2K1、ERK 和Akt通路信號(hào)，維持SSCs 自我更新［20］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)FGF在人SSCs體外長期培養(yǎng)中起重要作用，是SSCs體外培養(yǎng)基的關(guān)鍵組分［21］。研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號(hào)相關(guān)成員特異表達(dá)于SSCs，包括：BMPR1B、BMP7、BMPR2、SMAD1、SMAD5、SMAD9，其中BMPR1B特異表達(dá)于SSCs，對BMPR1B+SSCs 細(xì)胞亞群染色發(fā)現(xiàn)，磷酸化的SMAD1/5/9、ID1和ID4蛋白表達(dá)陽性，表明在SSCs中BMP通路激活［22］。小鼠研究中，BMP通路在調(diào)節(jié)小鼠精原細(xì)胞未分化狀態(tài)中起到重要的作用。BMP4、BMP7和BMP8B已被證明可誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生早期生殖細(xì)胞［23］。以上結(jié)果表明，GDNF、FGF 和BMP 通路在參與維持人SSCs 的自我更新上可能起到重要作用。然而迄今為止，人SSCs 的體外培養(yǎng)研究仍進(jìn)展緩慢，睪丸單細(xì)胞測序鑒定出的基因標(biāo)志物有望推動(dòng)這一進(jìn)展，但仍需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

SSCs的增殖與分化作為精子發(fā)生起始步驟，細(xì)胞狀態(tài)由相對靜止向增殖活躍轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生定向分化的精原細(xì)胞，使精子發(fā)生源源不斷進(jìn)行。Hermann等［14］利用scRNA-seq 技術(shù)平行比較、研究人和小鼠睪丸轉(zhuǎn)錄組特征，發(fā)現(xiàn)參與肝星狀細(xì)胞活化通路的基因包括BCL2、EDNRA、KLF6、PDGFRA 和TGF 在SSCs 亞群中表達(dá)逐漸上調(diào)。該通路的激活使靶細(xì)胞對相關(guān)誘導(dǎo)性細(xì)胞因子信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)［24］，表明從靜止的SSCs 到分化精原細(xì)胞的轉(zhuǎn)變涉及對細(xì)胞因子信號(hào)的反應(yīng)。Sohni 等［6］發(fā)現(xiàn)未分化精原細(xì)胞至分化精原細(xì)胞階段，促細(xì)胞增殖的相關(guān)基因CCND2、SPRY1 等表達(dá)上調(diào)，GO 注釋發(fā)現(xiàn)分化精原細(xì)胞特異表達(dá)基因富集于細(xì)胞增殖相關(guān)通路，與其增殖功能活躍相一致［25］。Guo等［26］對青春期前睪丸組織進(jìn)行scRNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)增殖調(diào)控基因Cyclins、CDKs、TOP2A、MKI67、KIT 在精原細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)激活素受體ACVR1B、BMPR1B、ACVR2B 表達(dá)于精原細(xì)胞，而在未分化精原細(xì)胞中表達(dá)激活素信號(hào)的相關(guān)抑制劑，這提示Activin信號(hào)在精原細(xì)胞增殖與分化過程中起到重要作用。利用GO 注釋與KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SOHLH2、NR6A1 和CTNNB1 可能參與SSCs 的增殖與分化過程。比較未分化精原細(xì)胞與分化精原細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)錄組水平，發(fā)現(xiàn)主要是增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如MKI67 等基因的上調(diào)。以上結(jié)果表明，增殖相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子在SSCs 增殖與分化過程中起重要作用，這在維持產(chǎn)生足夠數(shù)量的精子中起到重要作用。當(dāng)前，已鑒定出的增殖調(diào)控關(guān)鍵因子的作用及其機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 小結(jié)與展望

目前，scRNA-seq 技術(shù)研究人精原干細(xì)胞的技術(shù)瓶頸主要在于兩點(diǎn)。其一，scRNA-seq 技術(shù)的目標(biāo)樣本來源于經(jīng)過酶消化獲取的睪丸細(xì)胞，這種條件下，酶消化破壞了各細(xì)胞在睪丸生精小管中的空間結(jié)構(gòu)，僅能獲取單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平信息，無法判斷SSCs在空間位置上的轉(zhuǎn)錄組水平變化。另外，在使用兩步酶消化方法獲取睪丸細(xì)胞過程中，可能存在生精小管中的SSCs消化不全的問題，導(dǎo)致獲取的細(xì)胞不足以代表SSCs 的實(shí)際組成?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以有效解決當(dāng)前問題，空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以結(jié)合顯微成像和測序技術(shù)在獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)的同時(shí)最大程度地保留樣本的空間位置信息［27］，結(jié)合scRNA-seq 技術(shù)鑒定的不同SSCs亞群及轉(zhuǎn)錄組水平信息，可以有效描述不同SSCs亞群的空間組成及轉(zhuǎn)錄組水平變化。其二，scRNA-seq 技術(shù)是在轉(zhuǎn)錄組水平上描述精原干細(xì)胞，僅能比較不同SSCs亞群的轉(zhuǎn)錄組水平變化。然而，精子發(fā)生這一復(fù)雜過程受到多方面調(diào)控，由于技術(shù)限制，scRNA-seq技術(shù)無法描述不同SSCs亞群在代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控如microRNA 等水平上的變化?；趕cRNA-seq 技術(shù)，聯(lián)合多組學(xué)分析能有效描述精原干細(xì)胞在精子發(fā)生中的生物過程。

綜上所述，scRNA-seq 技術(shù)可高效捕獲睪丸內(nèi)單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行高通量測序分析，獲取其轉(zhuǎn)錄組水平信息，精細(xì)描述細(xì)胞類型，揭示細(xì)胞異質(zhì)性，推測其發(fā)育軌跡。近年，諸多研究鑒定不同SSCs 亞群，揭示其轉(zhuǎn)錄譜水平及功能變化，提供用于鑒定、分選SSCs 亞群的基因標(biāo)志物，為SSCs 自我更新、增殖與分化研究提供理論基礎(chǔ)。然而，scRNA-seq 技術(shù)是基于已消化的睪丸細(xì)胞，從而難以揭示睪丸空間異質(zhì)性。另外，個(gè)體之間存在遺傳差異，因而不同研究分析結(jié)果存在偏差。未來，對人睪丸scRNAseq數(shù)據(jù)集，進(jìn)行大樣本聯(lián)合分析具有重要價(jià)值，有助于區(qū)分樣本及細(xì)胞類型差異；進(jìn)一步聯(lián)合多組學(xué)（空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、DNA 甲基化組、組蛋白修飾等）分析，更有助于闡釋睪丸SSCs空間構(gòu)成及其轉(zhuǎn)錄組水平，在揭示SSCs增殖與分化調(diào)控機(jī)制并深入研究精子發(fā)生生物學(xué)過程中具有重要價(jià)值，可能為男性不育診療提供新策略。