基于SSR和SRAP標記小麥資源遺傳多樣性及農藝性狀分析

許娜麗， 余慧霞， 姚明明， 王彥青， 李清峰， 劉彩霞， 孫剛，陳佳靜， 龍姣卉， 王掌軍*

（1.寧夏大學農學院， 銀川 750021；2.信陽市農業(yè)科學院， 河南 信陽 064000）

小麥（Triticum aestivumL.）作為世界和我國重要糧食作物之一，是全球約35%～40%人口的主食，提供人類約21%的食物熱量和20%的蛋白質，其產量高低和品質優(yōu)劣直接關系國家糧食安全和人民生活水平[1-3]。目前，由于少量骨干親本的高頻利用和育種選擇，導致大量優(yōu)異基因流失，品種資源的遺傳多樣性日益狹窄。而小麥遺傳多樣性的開發(fā)是品種改良的基礎，對小麥育種起重要作用[4-5]。目前，小麥遺傳多樣性研究多基于表型和分子標記分析，表型性狀受基因顯隱性關系及環(huán)境條件的影響，造成其多樣性分析結果不穩(wěn)定；分子標記體現了DNA水平上的遺傳差異，能更深入、穩(wěn)定地分析小麥品種資源的遺傳多樣性[6]。目前，國內外學者利用簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、簡單重復間序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）、序列相關擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分子標記研究小麥的遺傳多樣性，分析了小麥品種資源的遺傳基礎和親緣關系[7-15]。王秋云等[16]利用SSR標記對引自國際玉米小麥改良中心（International Maize and Wheat Improvement Center，CIMMYT）的56份人工合成小麥進行分析，發(fā)現人工合成小麥較栽培品種具有更高的遺傳多樣性。張思妮等[17]基于102對SSR標記對128份國內外小麥進行分析，其多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）為0.248～0.897，平均0.724，表明小麥的遺傳多樣性較高。Wang等[18]利用62個SSR標記對238個國外小麥品種進行遺傳多樣性分析，平均每個SSR標記有19.37個等位基因，其PIC值為0.760，表現出較高的遺傳多樣性水平。Dong等[19]利用30個SRAP標記分析了15份以色列野生小麥的遺傳多樣性，其Nei’s多樣性指數（H）和Shannon指數（I）分別為0.198和0.295，表現出較低的多樣性水平。Hassan等[20]利用36對有多態(tài)性的SRAP標記對內蒙古地區(qū)的50份春小麥材料的多樣性進行研究，表明地理來源相同的春小麥品種之間遺傳差異較小，種植區(qū)域的環(huán)境（自然選擇）是影響春小麥親緣關系的重要因素。趙小慶等[21]利用17對SRAP標記對7個內蒙古春小麥品種進行分析，其PIC、有效等位基因數（Ne）、I分別為0.630、1.601、0.710，表明研究材料遺傳變異較大。小麥產業(yè)未來發(fā)展面臨提升質量、降低成本和環(huán)境保護3大挑戰(zhàn)。寧夏作為北方主要春麥區(qū)之一，本地品種資源相對匱乏，且親緣關系較近，遺傳多樣性日趨狹窄，這些已成為制約寧夏小麥新品種選育的瓶頸。因此，本研究基于課題組前期對251份小麥種質資源主要農藝與品質性狀遺傳多樣性的分析[22]，利用SSR和SRAP標記對其進行DNA水平上的遺傳多樣性分析，以期明確品種間的親緣關系和遺傳差異，結合不同類群品種的農藝與品質性狀表現，挖掘優(yōu)異育種親本，指導雜交組合配制，為寧夏小麥遺傳改良及新品種選育提供優(yōu)良基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以來自國內外的251份小麥品種資源（表1）為研究對象，均由寧夏大學小麥育種課題組提供。材料包括205份育成品種，其中寧夏51份，國內其他省（自治區(qū)、直轄市）151份，國外3份；46份地方品種，其中寧夏8份，國內其他?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）31份，國外7份。

表1 供試材料編號與名稱Table 1 Code and name of the test materials

表1 供試材料編號與名稱Table 1 Code and name of the test materials 續(xù)表Continued

表1 供試材料編號與名稱Table 1 Code and name of the test materials 續(xù)表Continued

于2020和2021年將251份小麥品種種植在寧夏大學教學實驗農場（38°13′3″N，106°14′12″E）。試驗地屬中溫帶干旱氣候區(qū)，海拔1 110 m，有效積溫3 300 ℃，平均氣溫8.5 ℃，年降水量180～200 mm，土壤為灌淤土，肥力中等，可揚黃自流灌溉。2年材料均種植在地力、水肥條件均一的同地段，每個材料種植5行，行長1.10 m，行距0.20 m，田間管理同大田。

1.2 農藝性狀考察

農藝性狀考察參照《小麥種質資源描述規(guī)范和數據標準》[23]，每個性狀設置15次重復。其中，株高、穗下莖長和穗長均采用卷尺測量；有效小穗數為每個單株上的總小穗數；不孕小穗數為各小花均不結實的小穗數目；結實小穗數為每穗均結實的小穗數。其中，結實小穗數與不孕小穗數的和為有效小穗數。穗粒數和穗粒重為每個株系隨機選取15個單穗統(tǒng)計粒數并稱重，取平均值；千粒重為1 000粒籽粒質量。經濟系數為經濟產量與生物學產量的比值，其中，生物學產量為收獲晾干后未脫粒前的植株質量，經濟產量為脫粒后的籽粒質量。

1.3 品質性狀測定

用瑞典DA7200型近紅外品質分析儀測定籽粒水分、粗蛋白和濕面筋含量及出粉率、吸水率、降落值、沉降值、硬度指數和容重共9個籽粒品質性狀，每個樣本分別取約30 g，5次重復，在國家小麥改良中心西北分中心（銀川）進行測定[24]。

1.4 分子標記分析

基因組DNA提取采用CTAB法[25]。SSR和SRAP標記均為已發(fā)表引物，其中能夠在群體中穩(wěn)定擴增的47對SSR和25對SRAP（Me-與Em-組合）引物信息詳見表2，以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR與SRAP引物編號及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers

表2 SSR與SRAP引物編號及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 續(xù)表Continued

表2 SSR與SRAP引物編號及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 續(xù)表Continued

PCR 反應體系為 10 μL，包含 10×Reaction Buffer 2 μL，dNTPs (2.5 mmol·L-1) 0.8 μL，上、下游引物 (10 μmol·L-1) 各 0.2 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.1 μL，模板 DNA (50 ng·μL-1) 1 μL，ddH2O 5.7 μL。SSR 標記的 PCR 程序為：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，34～40個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP標記的PCR 程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。擴增產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓為180 V，1.5 h左右，銀染后觀察拍照。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010對分子標記的擴增結果進行統(tǒng)計，相同遷移位置上出現條帶記為“1”，無條帶記為“0”。用PopGen 32軟件計算各多態(tài)性引物的有效等位基因數（Ne）、Shannon信息指數（I）、Nei’s多樣性指數（H）[26]。采用MEGA 5軟件中的非加權成對算術平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）進行聚類分析，繪制聚類圖[27]。多態(tài)性信息含量(PIC)[28]的計算公式如下。

式中，Pij表示標記i的第j個帶型出現的頻率；PIC值的大小反映多態(tài)性的高低，PIC值最大為1，表示非常高的多態(tài)性；最小值為0，表示無多態(tài)性。

2 結果與分析

2.1 小麥品種資源農藝與品質性狀分析

對251份小麥品種資源的10個農藝和9個品質性狀進行分析，結果如表3所示。251份材料中蘊含著豐富的遺傳變異。農藝性狀的變異系數為14.25%～41.77%，其中，分蘗數、穗粒重的變異系數較大，分別為41.77%、36.58%；小穗數、結實數的變異系數較小，分別為14.43%、14.25%。品質性狀變異系數為2.24%～15.42%，其中，沉降值、降落值、濕面筋的變異系數較大，分別為15.42%、9.23%、9.15%；出粉率、容重的變異系數較小，分別為3.18%、2.24%?？傮w來看，農藝性狀的變異系數明顯高于品質性狀的變異系數。

表3 251份小麥品種資源的農藝性狀與品質性狀Table 3 Agronomic traits and quality traits of 251 wheat cultivar resources

2.2 小麥品種資源遺傳多樣性分子標記分析

2.2.1 SSR與SRAP標記多態(tài)性引物篩選 選取提摩菲維小麥、中國春、蘇麥3號、甘育2號和寧春4號這5份農藝性狀存在顯著差異（P＜0.05）的小麥品種用于引物的篩選，結果如表4所示。747對SSR引物共篩選出153對，多態(tài)性比例為20.48%，其中能夠在群體中穩(wěn)定擴增的有47對；SRAP引物中，12條正向引物和64條反向引物相互組合共篩選出96對，多態(tài)性比例為12.73%，能夠在群體中穩(wěn)定擴增的有25對。

表4 多態(tài)性引物篩選數目和比例Table 4 Number and proportion of polymorphism primer screening

2.2.2 SSR與SRAP標記多態(tài)性信息量分析 利用能夠穩(wěn)定擴增的45對SSR引物對251份小麥品種資源進行多樣性分析，共檢測到234個等位變異，不同位點等位變異數為3～11，平均4.979。引物的有效等位基因數（Ne）、基因多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）分別為1.103～1.772、0.089～0.429、0.181～0.618，平均值分別為 1.474、0.289、0.445，其中，引物XbarcM156的Ne、H、I均最大，分別為1.772、0.429、0.618；多態(tài)性信息量（PIC）為0.097～0.862，平均0.652，引物Xbarc78的PIC最大（表5）。

25對穩(wěn)定擴增的SRAP引物在251份小麥品種資源中共檢測出342個等位變異，不同位點的等位變異數為6～21，平均13.680。SRAP引物的Ne、H、I分別為 1.152～1.734、0.125～0.403、0.235～0.584，平均值分別為 1.429、0.257、0.399，其中，Me5-Em62的Ne、H、I均最大，分別為1.734、0.403、0.584；PIC為0.651～0.932，均大于0.500，平均為0.826，屬于高多態(tài)性水平，引物組合Me7-Em44的PIC最大（表5）。

表5 251份小麥品種資源SSR與SRAP標記多態(tài)性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 續(xù)表Continued

表5 251份小麥品種資源SSR與SRAP標記多態(tài)性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 續(xù)表Continued

2.2.3 基于SSR與SRAP標記的小麥品種資源聚類及農藝品質性狀分析 利用2種標記共72對引物的擴增結果對251份小麥品種資源進行聚類分析，結果如圖1所示。將251份材料分為4個類群，其中，類群Ⅰ包括100份材料（C129～C230），主要為北方春麥區(qū)品種，其株高適宜，以寧夏、甘肅春性品種居多，分別為45、31份，其中，2份河南品種及1份四川品種被聚在此類群中；類群Ⅱ包括39份材料（C145～C157），主要為華北地區(qū)和中原地區(qū)的冬性品種；類群Ⅲ包括81份材料（C99～C126），其株高偏低，主要是以江蘇省為代表的長江中下游地區(qū)的弱冬性品種；類群Ⅳ包括31份材料（C19～C26），主要為國內外地方品種和人工合成種，其中，寧春20號、寧春21號、寧春35號為寧夏早期選育品種，這一類群的主要特點是株高較高，易倒伏，但品質性狀優(yōu)異。

圖1 基于SSR和SRAP標記的小麥品種資源聚類Fig. 1 Dendrogram based on SSR and SRAP marker of wheat cultivar resources

進一步分析4個類群的農藝與品質性狀，結果（表6和7）表明，類群Ⅰ的穗長最長，結實數、穗粒數、穗粒重、千粒重、出粉率、容重、硬度指數均最高，水分含量最低；類群Ⅱ的分蘗數、降落值均最高；類群Ⅲ的株高最矮，經濟系數最高；類群Ⅳ的穗下莖長、小穗數、粗蛋白含量、濕面筋含量、吸水率、沉降值均最高。對4個類群的農藝性狀和品質性狀進行差異性分析，結果發(fā)現，各類群間的農藝與品質性狀存在顯著或極顯著差異（P＜0.05和P＜0.01），尤其各個類群間在株高、穗下莖長、千粒重、粗蛋白含量上存在極顯著差異。

表6 4大類群的農藝性狀Table 6 Agronomic traits of 4 groups

表7 4大類群的品質性狀Table 7 Quality traits of 4 groups

3 討論

小麥新品種的培育對世界和我國糧食安全作出了重大貢獻。目前，大多育成品種所聚合的優(yōu)良基因位點較為相似，變異空間狹小，親緣關系較近，而且由于商業(yè)化育種，多數雜交組合的親本選配均圍繞高產品種，忽視了其他性狀，導致新培育的品種（系）間遺傳相似性不斷升高，品種資源的遺傳多樣性日趨狹窄[29-30]。拓寬小麥育成品種的遺傳多樣性迫在眉睫。研究表明，通過擴大引種來源[31]；重視對古老地方品種與農家品種中蘊含的優(yōu)異性狀[32]；充分挖掘小麥野生近緣植物中蘊藏的豐富基因源；加強對小麥野生近緣植物的保護力度以及利用遠緣雜交將近緣種（屬）的優(yōu)異基因導入小麥等措施對豐富小麥資源類型、拓寬遺傳基礎、創(chuàng)新品種資源具有重要現實意義[33]。本研究選取了251份小麥品種資源，有小麥近緣屬，如黑麥、大麥；有親緣種，如栽培一粒小麥、硬粒小麥、東方小麥等；有合成小麥，如‘小黑麥’‘小大麥’‘荊輝1號’等；還有國外小麥（‘素諾拉64’）及國內不同麥區(qū)的農家品種、地方品種及新育成品種，這些資源對于豐富寧夏小麥品種資源類型具有重要補充作用。

小麥遺傳多樣性的開發(fā)是改良現有品種的基礎。研究技術和手段對小麥遺傳多樣性評價的準確性有很大影響。表型性狀屬于數量性狀，受栽培措施、生態(tài)環(huán)境等影響，存在一定的局限性；而分子標記在基因水平上反映了不同品種資源之間的遺傳差異。已有大量研究利用不同類型分子標記分析了小麥遺傳多樣性，但研究結果卻不盡相同[27,34-35]。本研究采用了SSR和SRAP標記，這2種類型分子標記具有一定的互補作用，其中SSR標記數量豐富，覆蓋整個基因組，主要表現為3～5個堿基的差異；SRAP標記因個體品種開放閱讀框（open reading frames，ORF）序列長度差異不同，放大基因的開放閱讀框，與隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和ISSR相比，SRAP標記表現出更高的穩(wěn)定性和多態(tài)性[36]。本研究利用這2種標記分別對251份小麥品種資源的遺傳多樣性進行分析，其SSR標記的多態(tài)性信息量與Abbasabad等[37]研究結果基本一致，但低于Salehi等[38]的研究結果；SRAP標記多態(tài)性信息量顯著高于Hassan等[20]的研究結果，這可能由于供試材料在數目、類型和遺傳差異等不同所致。另外，本研究中2種標記的多態(tài)性信息量基本保持一致，因此，結果具有一定的可靠性。

依靠科技發(fā)掘優(yōu)良基因對栽培品種進行遺傳改良，是解決人類對糧食需求的根本途徑。本研究利用2種標記將小麥品種資源聚為4個類群，其中類群Ⅳ具有豐富的遺傳多樣性，與其他類群間表現出明顯的遺傳差異，這與胡立芹等[39]和鄭軍等[40]研究結果基本一致，而與王鳳濤等[41]研究結果存在差異，可能是由于材料的數量、來源及標記類型不同所致。對不同類群的農藝與品質性狀進行分析發(fā)現，各類群間的農藝與品質性狀存在顯著或極顯著差異，其中類群Ⅰ的穗粒數、穗粒重、千粒重均最高，可作為小麥產量性狀改良的親本加以利用；類群Ⅳ大多為地方品種，其粗蛋白和濕面筋含量較高，可用于改良小麥品質性狀。目前，寧夏審定的多數小麥品種與‘寧春4號’的親緣關系較近，遺傳背景日趨狹窄，嚴重限制了寧夏小麥產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[42]。本研究中的251份小麥品種資源之間遺傳多樣性較豐富，結合聚類和農藝、品質性狀分析結果，可選用綜合性狀優(yōu)異且有一定遺傳差異的材料作為育種親本，對寧夏小麥品種改良和拓寬小麥遺傳多樣性具有一定的現實意義。