新型復(fù)合水凝膠對鎘脅迫煙草幼苗的緩解效應(yīng)

劉云飛， 韋鳳杰， 夏茂林， 于兆錦， 夏昊， 衣春宇，常劍波， 姬小明*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南省生物炭工程技術(shù)研究中心，鄭州 450002； 2.中國煙草總公司河南省公司，鄭州 450018； 3.吉安市煙草公司峽江分公司，江西 吉安 331400； 4.河南省三門峽市煙草公司，河南 三門峽 472400）

土壤重金屬污染是影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要問題之一。中國土壤污染主要為土壤重金屬和類金屬污染，其中鎘（Cd）污染占比最高，超標(biāo)率達7.0%[1]。中國約有2 000萬hm2的耕地被重金屬（主要是鎘和鉛）污染，占總耕地面積的19.4%，Cd已經(jīng)被正式認定為中國土壤中最突出的無機污染物[2]。Cd容易被植物吸收且在植物體內(nèi)富集，阻止植物吸收養(yǎng)分，并阻礙植物葉片葉綠素合成，影響植物生長和發(fā)育[3]。Cd脅迫會抑制植物的抗氧化酶活性，從而降低植物活性氧的清除能力[4]。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，作為一種Cd的超富集植物，與其他作物相比，更易積累Cd[5]。煙草植株中的Cd累積到一定程度會破壞細胞氧化還原系統(tǒng)，導(dǎo)致各種抗氧化酶變性與失活，自由基大量積累，加速煙株衰老和死亡[6]。土壤中的Cd被農(nóng)作物吸收和積累，然后通過食物鏈進入人體，嚴重損害腎臟和骨骼[7]，而煙民抽吸煙草過程中，煙草中的Cd極易對煙民健康造成危害[8]。因此通過外源物阻控Cd從土壤到煙葉的傳遞過程，對減少煙草Cd積累和緩解Cd對煙草的脅迫具有重要意義。

研究表明，水凝膠具有豐富的官能團和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對Cd具有較強的吸附固定能力[9]，因此可作為土壤Cd污染的修復(fù)材料。生物炭具有豐富的芳香基團和致密孔隙，可以降低水體及植物體內(nèi)Cd含量，已被廣泛用于固定和鈍化重金屬[10]。生物炭基復(fù)合水凝膠的報道很少，將其應(yīng)用于煙草緩解Cd脅迫的研究也很少。因此本研究結(jié)合生物炭和水凝膠在吸附固定重金屬方面的優(yōu)勢，制備生物炭基復(fù)合水凝膠，進行生物炭基復(fù)合水凝膠對水溶液中Cd的吸附性能研究，并通過盆栽試驗研究了2種生物炭基復(fù)合水凝膠緩解Cd對煙草幼苗毒害的效果，以期為Cd污染處理及緩解Cd對煙草脅迫提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯酸（acrylic acid，AA），含量≥99.5%；過硫酸銨和N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺均購自Sigma-Aldrich公司，含量≥99.8%；四水合硝酸鎘（CdN2O6·4H2O），含量≥99.9%，購自上海羅恩化工科技有限公司；以上均為分析純。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），化學(xué)純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；花生殼生物炭（peanut shell biochar，B），由河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司提供。

1.2 改性生物炭及復(fù)合水凝膠的制備

1.2.1 改性生物炭制備 對Wibowo等[11]的方法稍作修改，將12 mol·L-1的硝酸和花生殼生物炭放入燒杯，在60 ℃條件下，轉(zhuǎn)速400 r·min-1攪拌6 h，氧化完成后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，得改性生物炭（modified biochar，MB）。于110℃烘箱中干燥至恒重，分別過20目篩和100目篩，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PVA/AA水凝膠的制備 取1.0 g PVA加入20 mL去離子水，95 ℃攪拌至完全溶解。取9 mL AA加入45 mL去離子水，以5 mol·L-1的KOH調(diào)pH至7~8之間，得AA溶液。向AA溶液中加入引發(fā)劑過硫酸銨和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺，加入PVA溶液，在60 ℃條件下，轉(zhuǎn)速400 r·min-1攪拌6 h，得PVA/AA復(fù)合水凝膠。

1.2.3 PVA/AA/B復(fù)合水凝膠的制備 如1.2.2所述反應(yīng)前加入1.0 g過100目篩的花生殼生物炭（B），超聲使生物炭均勻分散在反應(yīng)體系中，在 60 ℃條件下，轉(zhuǎn)速 400 r·min-1攪拌 6 h，制得PVA/AA/B復(fù)合水凝膠。

1.2.4 PVA/AA/MB復(fù)合水凝膠的制備 操作步驟同1.2.3，用過100目篩的改性生物炭（MB）代替花生殼生物炭（B）得PVA/AA/MB復(fù)合水凝膠。將PVA/AA、PVA/AA/B、PVA/AA/MB樣品在烘箱中60 ℃干燥至恒重，粉碎過20目篩。

1.3 復(fù)合水凝膠表征

采用Nicolet iS50型傅立葉紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR，美國Thermo公司生產(chǎn)）測試復(fù)合水凝膠吸附Cd前后的紅外光譜；S-4800型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM，日本Hitachi公司生產(chǎn)）對復(fù)合水凝膠的形貌進行表征。

1.4 復(fù)合水凝膠材料對水溶液中Cd的吸附試驗

1.4.1 不同材料對Cd的吸附能力測試 稱取等質(zhì)量（0.05 g）干燥后的B、MB、PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB樣品若干份分別置于塑料瓶中，加入100 mL 濃度為100 mg·L-1的Cd溶液，24 h后取5 mL溶液樣品，用Vista-MPX型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES，美國 Varian 公司生產(chǎn)）測定溶液中Cd的含量。用公式（1）計算各材料的平衡吸附量，用公式（2）計算各材料對溶液中Cd的去除率[12]。

式中，Qe是平衡吸附量（mg·g-1）；C0和Ce分別是溶液中Cd的初始濃度和最終濃度（mg·L-1）；V是Cd溶液的體積（L）；m是稱取材料的質(zhì)量（g）。

1.4.2 等溫吸附 稱取等質(zhì)量（0.05 g）干燥后的PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB樣品若干份，分別置于塑料瓶中，加入初始濃度為0、50、100、150、200和250 mg·L-1的100 mL Cd溶液。將溶液置于水浴恒溫振蕩器中，在25 ℃、150 r·min-1條件下震蕩24 h，取樣檢測方法同1.4.1。用Langmuir吸附等溫線模型（3）和Freundlich吸附等溫模型（4）對制備材料吸附Cd的平衡數(shù)據(jù)進行擬合[12]。

式中，Qm為理論飽和吸附量（mg·g-1）；KL為Langmuir吸附平衡常數(shù)（L·mg-1）；KF和n均為Freundlich吸附平衡常數(shù)。

1.4.3 吸附動力學(xué) 稱取等質(zhì)量（0.05 g）干燥后的PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB樣品若干份，分別置于塑料瓶中，加入100 mL濃度為100 mg·L-1的Cd溶液，將塑料瓶置于水浴恒溫振蕩器中，在25 ℃、150 r·min-1條件下震蕩，在預(yù)定的時間間隔取樣，取樣測定方法同1.4.1。

研究100 mg·L-1Cd溶液在25 ℃條件下對Cd的吸附動力學(xué)。吸附試驗數(shù)據(jù)用準一級動力學(xué)和準二級動力學(xué)方程進行擬合和分析[12]。

式中，Qe和Qt分別是達到吸附平衡和吸附時間t時的吸附量（mg·g-1）；K1是公式（5）的常數(shù)（min-1）；K2是公式（6）的常數(shù)（g·mg-1·min-1）。

1.5 緩解煙草Cd脅迫的應(yīng)用

1.5.1 試驗設(shè)計 盆栽試驗設(shè)置6個處理，CK：不添加材料；T1：添加 B；T2：添加 MB；T3：添加PVA/AA；T4：添加 PVA/AA/B；T5：添加 PVA/AA/MB。材料與土壤質(zhì)量按1.5∶1 000混合均勻，每個處理15株煙苗。

供試土壤為黃壤土，取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌科教園區(qū)（pH 7.3，有機質(zhì) 22.12 g·kg-1，堿解氮76.60 mg·kg-1，有 效 磷 11.70 mg·kg-1，速 效 鉀111.70 mg·kg-1，水溶性氯 24.80 mg·kg-1，有效態(tài)Cd 11.21 μg·kg-1），使用前風(fēng)干。供試煙草品種為‘中煙100’，從出現(xiàn)第4片真葉的煙草中篩選出長勢均勻的煙苗移栽到塑料盆中。干土中Cd的添加量為55 mg·kg-1，移栽后放在光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，光照強度4 000 lx，室內(nèi)溫度為（25±2）℃，光照時間為16 h·d-1，每隔5 d澆水1次。移栽20 d后對煙草幼苗進行取樣檢測。

1.5.2 測定內(nèi)容及方法 根系指標(biāo)測定：用EPSON Perfectio V800 Photo根系掃描儀（日本EPSON公司）掃描煙草根系，獲得根系圖片，利用根系分析軟件WinRHIZO（加拿大Regent公司）對煙草幼苗根系圖片進行分析。

SPAD值測定：使用SPAD-502Plus葉綠素儀（日本柯尼卡美能達公司）測定第3片真葉（從上往下數(shù)）的葉基部、葉中部和葉尖部SPAD值，取平均值。

抗氧化酶活性測定：植物葉片的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用試劑盒法測定[13]。

生物量測定：鮮重測定采用直接稱重法，干重測定將煙株殺青烘干后稱重。

土壤有效態(tài)Cd測定：CaCl2-DTPA-TEA浸提，采用ICP-OES測定Cd含量。

植株中Cd含量測定：稱取殺青樣品放入全自動消解儀進行消解，消解后的溶液采用ICP-OES測定Cd含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Excel進行數(shù)據(jù)處理，利用DPS進行顯著性差異分析，運用GraphPad Prism和origin 2019進行數(shù)據(jù)圖形及擬合曲線繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合水凝膠的表征

2.1.1 紅外光譜分析 如圖1所示，PVA/AA/B和PVA/AA/MB在3 419 cm-1處的O-H伸縮振動，1 717、1 542、1 403 cm-1處的-COOH和-COO-伸縮振動，與PVA/AA相比峰形相似但峰強度不同，說明了PVA/AA/B和PVA/AA/MB部分官能團與PVA/AA不完全一致，證明PVA/AA/B和PVA/AA/MB新型生物炭水凝膠的形成。

圖1 PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB的紅外光譜圖及吸附Cd+前后的紅外光譜對比Fig.1 FTIR diagram of PVA/AA， PVA/AA/B and PVA/AA/MB and FTIR comparison diagram before and after adsorption of Cd+

PVA/AA吸附Cd后與吸附Cd前相比，1 403 cm-1處的峰強度變?nèi)?；PVA/AA/B吸附Cd后與吸附Cd前相比，在1 170、1 050 cm-1處的峰強度變?nèi)?；PVA/AA/MB吸附Cd后與吸附Cd前相比，3 419 cm-1處的峰強度變?nèi)酢?種水凝膠吸附Cd前后紅外峰變化不同，說明吸附Cd后基團變化不同。

2.1.2 掃描電鏡分析 從圖2中可以看出，3種水凝膠材料具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與PVA/AA相比，PVA/AA/B和PVA/AA/MB孔洞變大且較為密集，PVA/AA/MB較明顯。這種大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增大了水凝膠與Cd有效接觸面積，有利于水凝膠對Cd的吸附。

圖2 PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of PVA/AA， PVA/AA/B and PVA/AA/MB

2.2 復(fù)合水凝膠對Cd的吸附效果分析

2.2.1 不同材料對Cd的吸附能力 如表1所示，不同材料對水溶液中Cd的平衡吸附量及去除率均為PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA＞MB＞B，PVA/AA/MB的平衡吸附量最大，為187.45 mg·g-1，去除率為93.72%，其次是PVA/AA/B，平衡吸附量為130.89 mg·g-1，去除率為65.44%。

表1 不同材料對水溶液中Cd的平衡吸附量及去除率Table 1 Equilibrium adsorption capacity and removal rate of Cd in aqueous solution by different materials

2.2.2 復(fù)合水凝膠的等溫吸附曲線 由圖3可知，隨著溶液中Cd平衡濃度的增大，PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd的平衡吸附量呈現(xiàn)先快后慢的增大趨勢，且PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA。由表 2可知，PVA/AA 的Langmuir模型R12較高，PVA/AA/B和PVA/AA/MB的Freundlich模型R22較高。說明Langmuir模型能更好地描述PVA/AA對Cd吸附過程，PVA/AA對Cd的吸附以單分子層吸附為主；Freundlich模型能更好地描述PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd吸附過程，PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd吸附方式更傾向于不均勻的多分子層吸附[14]，吸附過程可能是通過靜電相互作用、離子交換或組合機制進行[15]。Langmuir吸附等溫式中KL和Freundlich吸附等溫式中KF越大材料吸附重金屬能力越強[16]。KL和KF均是PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA，說明PVA/AA/MB對Cd吸附結(jié)合能力最強，其次為PVA/AA/B。PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd的最大吸附量分別為314.17和371.83 mg·g-1，分別是PVA/AA的1.16和1.37倍。

圖3 PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd的Freundlich等溫吸附曲線Fig. 3 Freundlich isothermal adsorption curves of Cd by PVA/AA， PVA/AA/B and PVA/AA/MB

表2 PVA/AA、PVA/AA/B、PVA/AA/MB吸附等溫線擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of adsorption isotherms for PVA/AA， PVA/AA/B and PVA/AA/MB

2.2.3 復(fù)合水凝膠的吸附動力學(xué)分析 圖4準一級動力學(xué)吸附曲線表明，PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB的Qt隨時間的推移均呈現(xiàn)先快后慢的增加趨勢。準一級動力學(xué)方程擬合曲線表明0～90 min為PVA/AA的快速反應(yīng)階段，90 min時PVA/AA的Qt為 46.33 mg·g-1，達到其最大吸附量的78.13%，90 min后為慢反應(yīng)階段，吸附速率減小，吸附逐漸趨于平衡。PVA/AA/B和PVA/AA/MB的快速反應(yīng)階段在 0～200 min， 200 min時PVA/AA/B和PVA/AA/MB的Qt分別為101.74和128.34 mg·g-1，分別達到其最大吸附量的75.47%和64.94%，200 min后為慢反應(yīng)階段?？焖俜磻?yīng)階段PVA/AA/B和PVA/AA/MB的吸附量均高于PVA/AA，其中PVA/AA/MB的吸附量較大。由表3可知，準一級動力學(xué)方程和準二級動力學(xué)方程均能較好地擬合PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd吸附過程，準一級動力學(xué)方程的R2值較大。

表3 PVA/AA、PVA/AA/B、PVA/AA/MB的吸附動力學(xué)擬合參數(shù)Table 3 Adsorption kinetics fitting parameters of PVA/AA， PVA/AA/B and PVA/AA/MB

圖4 PVA/AA、PVA/AA/B和PVA/AA/MB對鎘的準一級動力學(xué)曲線Fig. 4 Pseudo-first-order kinetic curves of Cd by PVA/AA，PVA/AA/B and PVA/AA/MB

2.4 不同處理對煙草幼苗生物量積累及根系發(fā)育的影響

如表4所示，與CK相比，各處理均顯著（P＜0.05）增加了Cd脅迫下煙草的鮮重和干重，T4和T5處理鮮重分別增加172.94%和231.32%，干重分別增加135.29%和188.24%。各處理均顯著（P＜0.05）增加了Cd脅迫下煙草的總根長、根表面積和根尖數(shù)。T3、T4和T5處理顯著（P＜0.05）增加了Cd脅迫下煙草的總根長、根表面積、根體積、平均根直徑和根尖數(shù)。與對照相比，T4和T5處理的總根長增加200.33%和221.01%，總根表面積分別增加292.66%和402.26%，根體積分別增加348.41%和527.60%，平均根直徑分別增加13.84%和20.75%，根尖數(shù)分別增加517.24%和606.90%。

表4 不同處理下生物量積累及根系指標(biāo)Table 4 Biomass accumulation and root indexes under different treatments

2.5 不同處理對煙草幼苗抗氧化酶活性的影響

與CK相比，各處理（除T1外）顯著（P＜0.05）提高了煙草幼苗的SOD活性，各處理均顯著（P＜0.05）提高了煙草幼苗的POD活性和CAT活性（圖5）。其中，以T5處理較為明顯，T5處理煙苗的POD活性、SOD活性和CAT活性分別提高97.99%、268.66%和167.76%（P＜0.05）。

圖5 不同處理下煙草幼苗抗氧化酶活性Fig.5 Antioxidant enzyme activities of tobacco seedlings under different treatments

2.6 不同處理下煙草幼苗SPAD值、土壤有效態(tài)Cd和植株Cd含量

由圖6可知，與CK相比各處理（除T1外）的SPAD值均顯著提高（P＜0.05），改善了Cd脅迫對煙草幼苗葉綠素的影響。T5處理的SPAD值最大，較CK顯著提高53.73%（P＜0.05）。

圖6 不同處理下葉片SPAD值、土壤有效態(tài)鎘和植株鎘含量Fig.6 Leaf SPAD value， soil available Cd and plant Cd contents under different treatments

各處理土壤有效態(tài)Cd的含量均顯著低于CK（P＜0.05），且各處理間土壤有效態(tài)Cd的含量均存在顯著性差異。與CK相比，T5處理的土壤有效態(tài)Cd含量降低最為明顯，其次是T4處理。T4和T5處理土壤的有效態(tài)Cd含量分別降低36.27%和65.18%。

各處理植株Cd含量均顯著低于CK處理（P＜0.05），以T5處理的植株Cd含量相對于CK降低較為明顯，T4處理和T5處理的植株Cd的含量分別降低54.47%和63.23%。

3 討論

重金屬以不同的形態(tài)存在于土壤中，只有有效態(tài)重金屬才能被植物吸收[17]，而植株內(nèi)Cd含量與土壤有效態(tài)Cd含量密切相關(guān)[18]。研究結(jié)果表明，添加 PVA/AA/MB、PVA/AA/B、PVA/AA、B 和MB均能顯著（P＜0.05）降低植煙土壤中有效態(tài)Cd與煙株Cd含量，效果表現(xiàn)為PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA＞MB＞B。其原因可能是 2種生物炭材料B和MB中具有-C=C-、-C≡C-、-C≡N和-OH等官能團[19]，能絡(luò)合Cd，而水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9]和豐富孔洞，且具有羧基、羥基、羰基等基團，易于吸附和固定Cd，故5種材料均能顯著（P＜0.05）降低植煙土壤中有效態(tài)Cd，減少煙株對Cd的吸收；MB效果優(yōu)于B，其原因可能是MB發(fā)生氧化反應(yīng)增加了芳香族化合物，可為MB提供更多的吸附位點，增加了MB 對Cd吸附能力[11]；PVA/AA/MB、PVA/AA/B、PVA/AA 3種水凝膠材料效果優(yōu)于B和MB，可能是水凝膠均具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能增大有效接觸面積，因此其吸附Cd能力遠大 于 生 物 炭 材 料[14]；PVA/AA/MB、PVA/AA/B、PVA/AA對Cd的吸附能力表現(xiàn)為PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA，可能是3種材料的孔徑大小及吸附位點不同導(dǎo)致的[20]。本研究也表明，5種材料對Cd的吸附能力表現(xiàn)為PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA＞MB＞B。

根系是植物生長過程中供應(yīng)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，能調(diào)節(jié)植物地上部分的生長，根系的形態(tài)特征對整個植物的生長尤為重要[21]。生物量是植物生長狀況的直觀表現(xiàn)，Guo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫直接抑制幼苗根系的生長，進而影響整個植株的長勢。本研究表明，5種材料的處理均能增加Cd脅迫下煙草幼苗的根長、根表面積、根體積、平均直徑、總根尖數(shù)和生物量，效果表現(xiàn)為PVA/AA/MB＞PVA/AA/B＞PVA/AA＞MB＞B。 上 述結(jié)果與材料在溶液中吸附Cd的能力一致，可能是材料對土壤Cd吸附減少了土壤中有效態(tài)Cd的含量，阻礙了煙株對Cd的吸收，進而促進Cd脅迫下煙草幼苗的生長發(fā)育，減輕Cd脅迫對煙草幼苗造成的不利影響。添加PVA/AA/MB與PVA/AA/B的處理效果較好，說明2種新型復(fù)合水凝膠均能較好緩解鎘脅迫對根系生長的抑制作用，增加煙草幼苗對Cd脅迫的耐受性。

抗氧化酶能清除植株逆境脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，以減輕逆境脅迫對植物造成的損傷[23]。SPAD值可直接反映植物葉片中的葉綠素含量[24]。Cd脅迫會破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，阻礙葉綠素的合成，影響煙草幼苗根系及葉片生長發(fā)育[25]。研究表明，5種外源材料均可提高Cd脅迫下煙草幼苗的抗氧化酶活性和SPAD值。其原因可能是外源材料對土壤Cd的吸附固定[26]，影響了煙草幼苗對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運，減輕Cd對煙草幼苗的脅迫，進而誘導(dǎo)煙草幼苗啟動抗氧化酶系統(tǒng)，降低了Cd脅迫對葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞[27]。3種水凝膠材料的效果優(yōu)于2種生物炭材料，可能與水凝膠對Cd的吸附能力大于2種生物炭有關(guān)。

綜上所述，2種新型復(fù)合水凝膠PVA/AA/B和PVA/AA/MB對Cd的吸附能力較強，PVA/AA/B和PVA/AA/MB處理減輕Cd對煙草幼苗的毒害效果較明顯，以PVA/AA/MB對Cd的吸附能力較強，減輕Cd對煙草幼苗的毒害效果較好。