接種根瘤菌對(duì)甘草主要活性成分含量的影響及多元統(tǒng)計(jì)分析

丁曉霞， 馬生軍*， 陳文峰， 張澳港， 于宏超， 依里汗木江·加帕爾

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院暨中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心，北京 100193）

由于采挖破壞嚴(yán)重導(dǎo)致我國(guó)甘草野生資源匱乏，每年需進(jìn)口大量甘草以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求[1]。因此，提高人工甘草藥材質(zhì)量、發(fā)展優(yōu)質(zhì)甘草栽培技術(shù)對(duì)于解決資源危機(jī)與實(shí)現(xiàn)甘草資源可持續(xù)利用具有重要意義。豆科植物-根瘤菌形成的共生體系不僅能夠減少化學(xué)氮肥的施用，還能提高作物產(chǎn)量[2-3]、維持和恢復(fù)土壤肥力。

豆科作為種子植物第3大科在自然界中廣泛分布，對(duì)豆科中藥植物有效成分和產(chǎn)量的提升一直是廣大研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。研究表明，在對(duì)豆科植物山豆根（Euchresta japonica）根瘤菌回接試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌處理的山豆根幼苗中活性成 分有所 提 升[5]；田 菁（Sesbania cannabina(Retz.) Poir.）莖瘤固氮根瘤菌處理可提高穿心蓮的活性成分含量[6]；根瘤菌可以提高豆科藥用植物苦參（Sophora flavescensAlt.）中的苦參堿和氧化苦參堿含量[7]。因此，本研究欲分析根瘤菌對(duì)甘草中主要活性成分含量的影響，以期為進(jìn)一步探究根瘤菌與甘草品質(zhì)形成的機(jī)理提供技術(shù)支持，也為研究根瘤菌與豆科藥用植物活性成分積累的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌種由課題組前期分離獲得[8-10]，分別為Rhizobium mongolense subsp.loessensestrainCCBAU 7190B、Agrobacterium tumefaciensIAM 13129 和Agrobacterium tumefaciensstrain CCBAU 65237，將其分別命名為70、77、78菌株。供試甘草包括烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch（.W）、光果甘草G. glabraL（.G）和脹果甘草G. inflataBat（.Z）。供試土為購(gòu)買(mǎi)于烏魯木齊市花卉市場(chǎng)的河沙。供試培養(yǎng)基為YMA培養(yǎng)基，配方為甘露醇10 g、酵母粉3 g、K2HPO40.25 g、KH2PO40.25 g、無(wú)水硫酸鎂0.1 g、NaCl 0.1 g、瓊脂粉18 g、去離子水1 000 mL，pH 6.8~7.2，滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將烏拉爾甘草、光果甘草、脹果甘草的種子分別用濃硫酸浸泡15 min，用蒸餾水沖洗干凈；然后用75%酒精消毒10 min后播種在室外試驗(yàn)田生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)1年后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的烏拉爾甘草、光果甘草、脹果甘草重新栽培于盆中，并將已活化培養(yǎng)的70、77、78根瘤菌菌液按照10 mL·株-1（675×10-6CFU·mL-1）澆灌接種于烏拉爾甘草（W）、光果甘草（G）、脹果甘草（Z）的地下部分。接種根瘤菌的甘草作為根瘤菌處理組，分別命名為T(mén)70、T77和T78，以未處理作為空白對(duì)照組（CK）。

1.2.2 測(cè)定方法 參照《中華人民共和國(guó)國(guó)藥典》[11]方法從甘草干燥地下部分中提取甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素的含量[12-13]，用乙腈溶解標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)波長(zhǎng)為254和370 nm，流動(dòng)相分別為乙腈（A）和0.01%磷酸水（B），按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度條件Table 1 Timetable for gradient of eluate

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用 WPS Excel 2021、Origin 2021和 SPSS Statistics 23.0進(jìn)行做圖、t檢驗(yàn)分析、相關(guān)性分析、聚類(lèi)分析和主成分分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

HPLC結(jié)果（圖1和2）表明，對(duì)照品溶液和待測(cè)樣品溶液中甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素均得到充分分離，且處理組樣品與對(duì)照品溶液中甘草苷、甘草酸、甘草素、異甘草苷和異甘草素的保留時(shí)間一致，保留時(shí)間均分別為11.234、28.698、23.242、19.316和31.322 min。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig. 1 Chromatograph of reference substance

圖2 樣品色譜圖Fig. 2 Chromatograph of samples

2.1.1 線性關(guān)系 分別精密吸取已經(jīng)制備好的甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素的對(duì)照品儲(chǔ)備液1、5、10、15、20 μL，測(cè)定色譜峰的峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。5種活動(dòng)成分線性回歸方程的R2值均大于0.999。

表2 活性成分的線性關(guān)系Table 2 Linear relationship of active ingredients

2.1.2 穩(wěn)定性 精密稱(chēng)取甘草藥材粉末，按“1.2.2”方法操作，分別在0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，每次連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到5種活性成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.82%~2.71%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表3）。

表3 活性成分的穩(wěn)定性Table 3 Stability test of active ingredients

2.1.3 精密性 取混合對(duì)照品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到5種活性成分的RSD為1.04%~2.65%，表明儀器精密性良好（表4）。

2.1.4 重復(fù)性 取甘草藥材粉末，精密稱(chēng)定6份，分別按“1.2.2”方法操作，進(jìn)樣，計(jì)算得5種活性成分的RSD為1.03%~2.43%，表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好（表4）。

2.1.5 加樣回收率 用加樣回收法，取甘草藥材粉末，精密稱(chēng)定5份，按“1.2.2”方法操作，分別加入適量的對(duì)照品，計(jì)算得到5種活性成分平均加樣回收率為97.60%~100.74%，RSD為0.95%~2.86%（表4）。

表4 活性成分的精密度、重復(fù)性及加樣回收率Table 4 Precision， repeatability and recovery of active ingredients

2.2 根瘤菌對(duì)甘草活性成分含量的影響

2.2.1 對(duì)甘草酸含量的影響 由圖3可知，根瘤菌處理對(duì)甘草中的甘草酸含量影響顯著。接種根瘤菌使烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草中甘草酸含量較CK顯著增加。對(duì)于烏拉爾甘草，3種菌株處理的甘草酸含量分別較CK增加122.26%、114.82%、307.76%，其中78菌株的效果顯著優(yōu)于70和77菌株。對(duì)于光果甘草，3種菌株處理的甘草酸含量分別較CK增加77.95%、46.58%、88.52%，其中70和78菌株的效果顯著優(yōu)于77菌株。對(duì)于脹果甘草，77和78菌株處理的甘草酸含量分別較CK增加114.64%、95.80%，其中77菌株的效果顯著優(yōu)于78菌株。

圖3 不同根瘤菌處理下甘草的甘草酸含量Fig. 3 Glycyrrhizic acid content in rhizobia treated by different rhizobias

2.2.2 對(duì)甘草苷含量的影響 由圖4可知，在接種根瘤菌后，烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草的甘草苷含量均顯著增加，除脹果甘草的70菌株處理外，其他處理均與CK差異顯著。對(duì)于烏拉爾甘草，3種菌株處理的甘草苷含量分別較CK顯著增加66.48%、10.64%、64.42%，其中70和78菌株的效果顯著優(yōu)于77菌株。對(duì)于光果甘草，3種菌株處理的甘草苷含量分別較CK顯著增加61.85%、88.84%、97.26%，其中77和78菌株的效果顯著優(yōu)于70菌株。對(duì)于脹果甘草，77和78菌株處理的甘草苷含量分別較CK增加121.25%、50.86%，其中77菌株的效果顯著優(yōu)于78菌株。

圖4 不同根瘤菌處理下甘草的甘草苷含量Fig. 4 Liquiritin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.3 對(duì)甘草素含量的影響 3種根瘤菌處理使烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草的甘草素含量較CK顯著增加（圖5）。對(duì)于烏拉爾甘草，3種菌株處理的甘草素含量較CK分別顯著增加175.92%、162.26%、164.86%，3種根瘤菌處理間差異不顯著。對(duì)于光果甘草，3種菌株處理的甘草素含量分別較CK增加406.34%、80.96%、505.85%，其中70和78菌株的效果顯著優(yōu)于77菌株。對(duì)于脹果甘草，3種菌株處理的甘草素含量分別較CK顯著增加365.00%、394.85%、321.25%，3種根瘤菌表現(xiàn)為77＞70＞78。由此表明，根瘤菌處理有利于甘草中甘草素的積累。

圖5 不同根瘤菌處理后甘草的甘草素含量Fig. 5 Liquiritigenin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.4 對(duì)異甘草苷含量的影響 由圖6可見(jiàn)，接種78菌株使烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草中異甘草苷含量顯著增加；70菌株處理可顯著增加脹果甘草中異甘草苷含量，但對(duì)烏拉爾甘草、光果甘草影響不顯著；77菌株處理使烏拉爾甘草和脹果甘草中異甘草苷含量顯著增加，但對(duì)光果甘草影響不顯著。對(duì)于烏拉爾甘草，77和78菌株處理的異甘草苷含量分別較CK顯著增加15.44%和20.75%，其中78菌株的效果顯著優(yōu)于77菌株。對(duì)于光果甘草，僅78菌株處理的異甘草苷含量較CK顯著增加42.15%。對(duì)于脹果甘草，70、77和78菌株處理的異甘草苷含量分別較CK顯著增加19.50%、%和43.00%，其中78菌株的效果顯著優(yōu)于70和77菌株。

圖6 不同根瘤菌處理后甘草的異甘草苷含量Fig. 6 Isoliquiritin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.5 對(duì)異甘草素含量的影響 由圖7可見(jiàn)，根瘤菌處理對(duì)3種甘草中異甘草素的積累有促進(jìn)作用，接種根瘤菌后，烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草中異甘草素含量均顯著增加。對(duì)于烏拉爾甘草，3種菌株處理的異甘草素含量分別較CK顯著增加46.75%、44.75%、160.93%，其中78菌株的效果顯著優(yōu)于70和77菌株。對(duì)于光果甘草，70、77和78菌株處理的異甘草素含量分別較CK顯著增加40.79%、23.16%和50.04%，其中70和78菌株的效果顯著優(yōu)于77菌株。對(duì)于脹果甘草，3種菌株處理的異甘草素含量分別較CK顯著增加37.35%、49.50%、27.38%，其中77菌株的效果顯著優(yōu)于70和78菌株。

圖7 不同根瘤菌處理后甘草的異甘草素含量Fig. 7 Isoliquiritigenin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.6 根瘤菌處理甘草中主要活性成分的多元統(tǒng)計(jì)分析 采用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Origan對(duì)不同處理甘草中主要活性成分含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果（圖8）表明，當(dāng)組間距離為0.6時(shí)可劃分為2類(lèi)，W-CK、G-CK、Z-CK、W-T77、Z-T70、Z-T77、G-T70聚為一類(lèi)，W-T70、G-T77、Z-T78、G-T78、W-T78聚為一類(lèi)；當(dāng)組間距離為0.4時(shí)可劃分為4類(lèi)，W-CK、G-CK、Z-CK 聚為一類(lèi)，W-T77、Z-T70、Z-T77、G-T70 聚為一類(lèi)，W-T70、G-T77、Z-T78、G-T78聚為一類(lèi)，W-T78單獨(dú)為一類(lèi)。

圖8 根瘤菌處理甘草中主要活性成分的聚類(lèi)分析Fig. 8 Cluster analysis of main active components in rhizobium treated licorice

采用Origan軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表5）表明，在處理組中，甘草苷與甘草素、異甘草素與甘草酸呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.813、0.833；異甘草苷與異甘草素、甘草酸呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.694和0.693。

表5 根瘤菌處理甘草中主要活性成分的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of main active components in rhizobia treated licorice

主成分分析能夠反映組內(nèi)聚集和組間分離趨勢(shì)[15]。采用Origan軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖9所示。第1主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為72.4%，第2主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為15.6%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)88.0%，說(shuō)明其能較全面地反映樣品間的差異。由圖9可知，甘草的12個(gè)處理組明顯被劃分為4類(lèi)。

圖9 根瘤菌處理甘草中主要活性成分的主成分分析Fig. 9 PCA of main active components in rhizobium treated licorice

3 討論

根瘤菌與植物共生可促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物特別是萜類(lèi)化合物的積累[16-17]。Xie等[18]發(fā)現(xiàn)，接種JX2、JX3菌株可明顯提高山豆根（Radix SophoraeTonkinensis）苦參堿和氧化苦參堿含量。唐美瓊等[5]研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌在微量元素的協(xié)同作用下可促進(jìn)黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.）生長(zhǎng)，提高其毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。因此，人們?cè)絹?lái)越重視利用根瘤菌來(lái)提高經(jīng)濟(jì)作物和中藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究表明，接種根瘤菌配合適當(dāng)?shù)乃止芾砜商岣吒什莞懈什菟岷透什蒈盏姆e累[19]。本研究表明，3種根瘤菌接種后能夠在不同程度上提高3種甘草中的甘草酸和甘草苷含量，其中70、77、78菌株處理使烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草中的甘草酸含量均較對(duì)照顯著增加；在77、78菌株處理下，烏拉爾甘草和脹果甘草中的甘草苷含量分別較對(duì)照顯著增加83.83%、97.26%和121.25%、50.86%，與Chen等[20]的研究結(jié)論相似。孟祥君等[21]發(fā)現(xiàn)岷山紅三葉（Trifolium pratense）在不施氮條件下接種根瘤菌可提高其異黃酮類(lèi)化合物含量。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種3種根瘤菌可促進(jìn)3種甘草中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量，即促進(jìn)甘草素、異甘草苷、異甘草素含量的積累。綜上所述，接種根瘤菌可顯著提高3種甘草中的甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素含量。本試驗(yàn)將根瘤菌接種于1年生甘草苗根部，其接種過(guò)程條件較為嚴(yán)苛，且作用周期長(zhǎng)，后續(xù)可針對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的甘草進(jìn)行接種研究，也可將菌種直接噴灑于甘草葉面研究其影響情況，以期達(dá)到提高甘草的產(chǎn)量與品質(zhì)、縮短采收期的效果。本研究?jī)H對(duì)干草的甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷和異甘草素含量進(jìn)行了測(cè)定，并未對(duì)其他活性成分進(jìn)行研究，后期可對(duì)甘草中酚類(lèi)、香豆素類(lèi)等物質(zhì)展開(kāi)研究。

本研究首次通過(guò)接種根瘤菌研究其對(duì)3種甘草中主要活性成分的影響，并采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，以接種不同根瘤菌對(duì)甘草中主要活性成分含量的影響篩選優(yōu)質(zhì)菌種，結(jié)果表明，3種根瘤菌均可促進(jìn)3種甘草中甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素含量的積累，其中78菌株的效果較佳。因此，在研究和促進(jìn)其他藥用植物生長(zhǎng)與有效成分合成時(shí)，可首先考慮通過(guò)根瘤菌改善，為提高甘草中活性物質(zhì)含量提供了新途徑。