水飛薊素通過(guò)共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的研究〔1〕

陳祎,楊太旺,王明生

(1.九江市第一人民醫(yī)院,江西 九江 332000;2.九江市中醫(yī)醫(yī)院,江西 九江 332002)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥,且伴隨著我國(guó)人口老齡化的加劇,糖尿病患者的日益增多,DN的發(fā)病率也逐年增加[1]。DN病理特征以腎小球?yàn)V過(guò)率增加、基底膜和系膜增厚以及晚期的腎小球硬化和腎小管纖維化為主,是終末期腎臟疾病的主要原因之一[2-4]。研究證實(shí)[5],持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致活性氧簇的過(guò)度產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的激活,引起氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病患者的血管和腎臟受損。目前,由于氧化應(yīng)激發(fā)生的相關(guān)通路復(fù)雜且靶點(diǎn)較多,所以DN發(fā)病的氧化應(yīng)激機(jī)制仍未闡明。天然黃酮木脂素類化合物水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊中提取出來(lái)的一種生物活性的物質(zhì)。研究表明[6],水飛薊素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒和抗腫瘤等作用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于藥用植物對(duì)腎臟的保護(hù)作用給予了更多關(guān)注。研究表明[7]水飛薊素對(duì)糖尿病和抗腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化也有預(yù)防和治療作用。本研究擬采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型探討水飛薊素通過(guò)共同抑制Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)和腫瘤壞死因子/活性氧簇/p38絲裂原活化蛋白激酶(TNF-α/ROS/P38MAPK)通路減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機(jī)制,為治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)、檸檬酸鹽緩沖液(福建飛凈)、水飛薊素(上海安博)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司)、AU640型全自動(dòng)生化分析儀(Ltd公司)、F6/10型勻漿機(jī)(上海凈信)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成)、引物(Sangon公司)。

1.2 STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的建立及分組

健康SD大鼠50 只,雌雄各25 只,8～12 周齡,體質(zhì)量170～200 g。無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境,光照、室溫、濕度符合要求,自由飲水,進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料,收集尿液檢測(cè)尿蛋白陰性,在九江學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

將50 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為建模組40 只和對(duì)照組10 只。建模組大鼠在隔夜禁食后給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周后,通過(guò)腹腔注射溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)中新鮮制備的STZ(30 mg/kg)誘發(fā)糖尿病,對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。4 周后測(cè)24 h尿白蛋白排泄率>20 mg且尿糖陽(yáng)性提示糖尿病腎病建模成功。建模成功后將建模大鼠40 只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,每組10 只,分別用0,100,300,900 μg/kg水飛薊素治療8 周。所有動(dòng)物均按照實(shí)驗(yàn)室指南進(jìn)行養(yǎng)殖。

1.3 生化分析

治療結(jié)束后24 h采集尾靜脈血,利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、β2微球蛋白(β2-MG)水平。收集24 h大鼠尿液,測(cè)定24 h尿蛋白(UTP)。

1.4 腎臟指數(shù)

腹腔注射麻醉,于冰上迅速摘取大鼠雙側(cè)腎臟組織,以預(yù)冷的PBS清洗干凈后,用濾紙吸干、稱重,計(jì)算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=雙腎重之和(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,稱取大鼠腎皮質(zhì)剪碎,放入勻漿機(jī),加入相應(yīng)量的生理鹽水或PBS,勻漿機(jī)30 HZ×1 min×3 次進(jìn)行勻漿后用高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min,取上清分裝,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定反映氧化應(yīng)激水平的MDA,T-AOC等氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)mRNA

測(cè)定TLR4,NF-κB,TNF-α和P38MAPK等mRNA的表達(dá):Trizol法提取腎臟組織中RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)合成,按比例加入cDNA、引物和染料,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s循環(huán)40 次擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt方程計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[7]。mRNA的數(shù)量用內(nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 水飛薊素對(duì)各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

低、中、高水飛薊素組體質(zhì)量均低于對(duì)照組,均高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低、中、高水飛薊素組腎臟指數(shù)均高于對(duì)照組,均低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較

2.2 水飛薊素對(duì)各組大鼠血糖及腎臟功能的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量水飛薊素組Scr,BUN水平均高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組FBG,Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 各組血糖及腎臟功能比較

2.3 水飛薊素對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均高于對(duì)照組,T-AOC水平均低于對(duì)照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組MDA水平均低于模型組(P<0.05),T-AOC水平均高于模型組(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4 水飛薊素對(duì)各組大鼠腎組織中mRNA表達(dá)水平的影響

模型組及低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05);低、中、高劑量水飛薊素組NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05);模型組及低、中劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05),高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低、中、高劑量水飛薊素組TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠腎組織中mRNA的表達(dá)水平比較

3 討 論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、遺傳因素和炎癥是參與DN發(fā)展的重要原因。目前臨床治療手段主要為早中期采用控制飲食、降糖藥、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑等藥物進(jìn)行治療,晚期治療方式為腎臟替代治療[8]。但目前的治療手段都不能改善終末期腎病患者的腎臟狀況,其生活質(zhì)量往往較差。水飛薊素是一種類黃酮化合物,具有免疫調(diào)節(jié)、改善氧化應(yīng)激等作用。Sheela等[9]利用STZ和煙酰胺誘導(dǎo)制備了DN大鼠模型,接受水飛薊素治療大鼠的血糖、糖化血紅蛋白和尿白蛋白水平顯著降低,組織病理學(xué)評(píng)估顯示病理?yè)p傷減少。有研究表明[10],水飛薊素可以降低糖尿病腎病患者尿蛋白,改善腎臟損傷,是糖尿病腎病潛在的治療藥物。但有關(guān)水飛薊素對(duì)DN氧化應(yīng)激影響的作用機(jī)制研究較少。本研究采用STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠動(dòng)物模型,將大鼠分為模型組、低劑量水飛薊素組、中劑量水飛薊素組及高劑量水飛薊素組,觀察水飛薊素對(duì)通過(guò)共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK信號(hào)通路,減輕糖尿病腎病大鼠腎臟損傷的機(jī)制,以期為治療DN提供新思路。Scr,BUN是臨床評(píng)價(jià)腎功能損傷的常規(guī)指標(biāo)。近年來(lái)研究表明[11-12],Cys-C,β2-MG在腎小球?yàn)V過(guò)功能下降早期即可變化,是反映腎小球?yàn)V過(guò)率的理想指標(biāo)。張玉梅等[13]研究發(fā)現(xiàn),Hcy,Cys-C,β2-MG水平與DN的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究中模型組大鼠Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平明顯高于對(duì)照組,不同劑量水飛薊素治療大鼠的Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型組,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,表明水飛薊素可明顯減輕DN大鼠的腎臟損傷。TLR4/NF-κB通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路,TLR4能誘導(dǎo)NF-κB活性增加,NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子的表達(dá),同時(shí)TNF-α可在DN中特異表達(dá),產(chǎn)生大量氧自由基,導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)受損[14]。過(guò)量的ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是DN發(fā)生的重要機(jī)制[15]。P38MAPK也可影響DN的進(jìn)展[16]。本研究中,模型組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)及MDA水平明顯高于對(duì)照組,不同劑量水飛薊素組大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表達(dá)及MDA水平均低于模型組,T-AOC水平高于模型組并呈一定程度的濃度依賴性,提示水飛薊素可調(diào)控TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路,可通過(guò)抑制其激活減輕氧化應(yīng)激,進(jìn)而減輕DN大鼠的腎臟損傷。

本研究的證據(jù)效力還存在一定不足,后續(xù)還需通過(guò)激活和抑制該通路進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,進(jìn)而對(duì)水飛薊素治療DN的藥理機(jī)制進(jìn)行更全面明確的闡釋。