非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊生產設備的UV法清潔驗證

朱家樂 姜慶偉 金學軍

摘要：為驗證清潔操作完成后生產設備表面非諾貝特酸的殘留量是否低于安全指標，建立了紫外可見分光光度法測定擦拭棉簽的提取溶液中非諾貝特酸的含量。使用286?nm檢測波長，1?cm吸收池，50%甲醇的溶劑。非諾貝特酸在0.95?～14.25?μg/mL?濃度范圍內線性關系良好。316不銹鋼板、有機玻璃和硅膠的取樣回收率分別為82.2％、75.8%和、76.9%，RSD分別為?9.47％、4.41%和、4.06%。方法回收率為101.5%，RSD為1.05%。該UV法可用于生產設備上非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊殘留物的清潔控制分析。

關鍵詞：非諾貝特酸??清潔驗證??紫外可見分光光度法??殘留物

【中圖分類號】：R917????【文獻標識碼】：A中圖分類號：R917

Validation?of?UV?Cleaning?of?Manufacturing?Equipment?of?Choline

Fenofibrate?Sustained-Release?Capsules

ZHU?Jiale?1??JIANG?Qingwei?2*?JIN?Xuejun?1

（1.College?of?Integration?Science，?Yanbian?University，?Yanji，?Ji’lin?Province，?13300’2?2??China?;

2.Jilin?Tianheng?Pharmaceutical?Co.，?Ltd.，?Meihekou，?Ji’lin?Province，?135000?China?）

Abstract：?In?order?to?verify?whether?the?residue?of?fenofibrate?acid?on?the?surface?of?manufacturing?equipment?is??lower?than?the?safety?index?after?the?cleaning?operation?is?completed，??Ultraviolet-visible?（UV）?spectrophotometry?is?established?to?determine?the?content?of?fenofibrate?acid?in?swab?extraction?solution.?A?solvent?with?286?nm?detection?wavelength，?1?cm?absorption?cell?and?50%?methanol?is?used.?Fenofibric?acid?shows?a?good?linearity?in?the?concentration?range?of?0.95?～?14.25?μg/mlmL.?The?extraction?recovery?of?316?stainless?steel?plate，?plexiglass?and?silica?gel?is?82.2%，?75.8%?and?76.9%，?and?RSD?is?9.47%，?4.41%?and?4.06%，?respectively.?The?recovery?of?the?method?is?101.5%?and?RSD?is?1.05%.?This?UV?method?can?be?used?for?the?analysis?of?cleaning?control?for?the?residue?of?Choline?Fenofibrate?Sustained-release?Capsules?on?manufacturing?equipment.

Key?Words：?Fenofibrate?acid;?Cleaning?verification;?Ultraviolet-visible?spectrophotometry;?Residue

非諾貝特膽堿（Choline?fenofibrate）是非諾貝特酸的膽堿鹽，在腸道內解離為游離的非諾貝特酸，不通過首過效應代謝。非諾貝特酸在胃腸道內有很好的吸收[1]。同時非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊的有效活性成分是非諾貝特酸。

非諾貝特酸化學式為2-（4-（4-氯苯甲酰）苯氧基）-2-甲基丙酸，相對分子質量為318.75，為白色或類白色結晶性粉末，無臭，無味，幾乎不溶于水，溶于甲醇，其化學結構見圖1。如圖1所示。

非諾貝特酸是一種合成的苯氧異丁酸衍生物，具有抗高血脂活性，是過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）激動劑。非諾貝特酸可使總甘油三酯（TG）水平降低25%～59%，?，使高密度脂蛋白-膽固醇?（HDL-C）?水平升高1%～34%，總膽固醇（TC）水平下降6%～27%[2]，?臨床醫(yī)學常用于TG升高，或以TG升高為主的混合型高脂血癥及低HDL-C的高脂血癥治療[3]。已上市的有45mg、和135?mg規(guī)格的口服制劑。

藥品的生產過程中，由于不同產品共用一條生產線，因此在更換產品時如不注意極易造成微量交叉污染，需要對生產條線重新進行清潔驗證，其前提是需要有合適的方法對目標化合物進行檢驗，即檢驗分析方法學驗證[4]。從目檢、化學檢的角度進行測試，驗證在使用該產品相關設備進行生產，生產結束后存放一定時間，銨設備清潔標準操作程序進行清潔，能夠將設備部件上藥物活性成分殘留量清潔至合格標準，以達到防止發(fā)生污染與交叉污染的目的，并證明此清潔程序具有穩(wěn)定性和重現(xiàn)性符合生產工藝和?GMP?的要求[5]。清潔驗證前需考察被生產設備材質、密封部位和最可能導致交叉污染的關鍵部位。取樣程序和殘留物的分析方法必須經過驗證，且有適當?shù)幕厥章省８鶕?jù)驗證結果建立清潔規(guī)程，以確保設備在清洗后藥物的殘留量符合生產工藝和?GMP?的要求[5]。

已報道的從血漿中檢測非諾貝特酸含量的方法有高效液相色譜（HPLC）法[6]，、液相色譜質譜聯(lián)用法，、液相色譜-紫外檢測（LC-UV）法[7]，和、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[8]等。，其中HPLC[9]和UV[10]是清潔驗證中最常用的兩種方法。借鑒非諾貝特在中國藥典[11]，、美國藥典[12]和歐洲藥典[13]中含量測定項下HPLC法檢測波長286?nm和非諾貝特酸在LC-UV法的檢測波長288?nm[14]，和與UV法具有靈敏度高，、設備普及，、耗時短，、操作簡單，、出錯率低和及節(jié)省試液等優(yōu)勢。，且還能滿足生產線清洗后取樣檢測要盡快出結果的要求。本該研究意以在開發(fā)出用UV紫外分光光度法在286?nm波長下，檢測出清潔驗證中殘留量非諾貝特酸的方法。

1建立快速檢驗生產設備表面非諾貝特酸殘留量的方法。

儀器、試藥與材料

1.1儀器

UV-26001紫外-可見分光光度計（島津儀器有限公司），、BP211D?型電子天平（?德國賽多利斯公司，精度為?0.01?mg）?，、KQ－500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率為?500?W，頻率為40?kHz）。

1.2試藥

非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊（吉林天衡藥業(yè)有限公司，批號20211001）。，非諾貝特酸對照品（純度為99.47%，北京天衡藥物研究院有限公司，批號：?200521）；，甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，批號?204512）；水為純化水。TX??715型棉簽（美國Itw?Texwipe?Philippines?公司，Alpha??Swab?with?long?handle，Clean?Tips??Swabs，批號?213811201811）。

1.3材料

10?cm×10?cm的316不銹鋼板，有機玻璃和硅膠。

2方法與結果

2.1色譜條件

檢測波長：為286?nm；吸收池：為1?cm；溶劑：為50%甲醇。

2.2?溶液的配制

2.2.1?對照品溶液

精密稱取非諾貝特酸對照品，加50%甲醇配制出0.19?mg/mlL的精密稱取非諾貝特酸對照品19?mg，置100?mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液加5?mL，置100?mL量瓶中，用50%甲醇配制出稀釋至刻度，搖勻。得9.5?μg/mL的對照品溶液。

2.2.2??供試品溶液

擦拭棉簽預先用水超聲（40?kHz）2次，每次30min，擦拭前將棉簽頭部水分盡量擠干。精密稱定20粒非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊內容物，研細，精密稱取細粉適量（約相當于非諾貝特酸19?mg），加50%甲醇，配制成9.5?μg/mL溶液（以非諾貝特酸計），離心，精密量取上清液40?mL，置于100?mL具塞試管中，將用空白棉簽擦拭過不同生產設備材質（316不銹鋼板，、有機玻璃，、硅膠）表面后，將的棉簽頭部剪下向下浸泡液面內，加塞，邊超聲邊振蕩邊超聲55?min左右，，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3?空白輔料貯備液

取空白輔料約28.4?mg（相當于鹽酸文拉法辛19mg），置25?mL量瓶中，加50%甲醇，，超聲5min，，p配制成1.136?mg/mlL溶液15mL，超聲5min，取出，放冷至室溫，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為空白輔料貯備液。

2.3棉簽擦拭方法

待不同生產設備表面涂布的溶液完全干燥后，用純化水潤濕藥簽，并將藥簽頭靠在溶劑瓶上擠壓以除去多余的溶劑，按擦拭棉簽用力在取樣表面上擦拭，按照“S”形擦拭取樣表面。保障取樣面積等同，用力均勻。用三3個棉簽取樣，保障取樣的完整性[15]。見下圖2具體如圖2所示。其擦拭面積100?cm2。擦拭取樣應始終固定一人，應盡可能采用固定的力度、擦拭速度和線路。取1個棉簽，用將棉簽頭按在取樣表面上，用力使其彎曲，平穩(wěn)而緩慢地按照圖2A所示擦拭取樣表面。在向前移動的同時將其從一邊移到另一邊。擦拭過程應覆蓋整個表面。翻轉棉簽，讓棉簽的另一面按照圖2B所示也進行擦拭。但與前次擦拭移動方向垂直。然后取另兩個棉簽分別重復擦拭一遍[15]。擦拭面積100?cm2。

2.4?專屬性試驗

將清潔劑棉簽預處理溶液（水）、空白預浸出溶溶劑液（50%甲醇）、空白棉簽浸出液（將預處理過的棉簽3根浸入50%甲醇40?mL中邊超聲邊震蕩5?min）、空白輔料溶液（將空白輔料貯備液加50%甲醇稀釋成0.0284?mg/mL溶液）、空白不同生產設備材質溶液（316不銹鋼板，有機玻璃，硅膠）溶液（用預處理過空白的棉簽擦拭空白不同設備材質，擦拭方法見“2.3”，然后將棉簽頭部剪下浸泡40?mL放入50%甲醇溶劑40?mL中邊超聲邊振蕩邊超聲5?min左右）、空白擦拭棉簽浸出液（將3根空白擦拭棉簽頭浸入40?mL溶劑中邊超聲邊震蕩5?min）及供試品溶液，分別進樣檢測（色譜條件見“2.1”），測得各溶液的吸收值A。非諾貝特酸化學性質較穩(wěn)定，在制備過程中基本無降解。供試品溶液的吸收值A與對照品溶液相比基本一致，其他溶液的吸收值A均不大于對照品溶液的2%。表明50%甲醇、水、空白棉簽、空白輔料及不同設備材質均不干擾非諾貝特酸的測定。

2.5?最高可接受殘留限度

根據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的要求，殘留限度的制定是由所涉及材料的性質來決定的。并且應是合乎邏輯的、實用的、可實現(xiàn)的和可驗證的。任何限度的制定都應該是科學合理的。

根據(jù)《藥品GMP指南》與《藥品生產驗證指南》推薦的兩種方式進行計算，分別為：生物學活性限度-最低日治療劑量的1/1000法和殘留物濃度限度的10×10-6法，非諾貝特酸膽堿的日劑量較大，通常為135?mg/d，換入產品的批量很大，采用最低日治療劑量的1/1000法和殘留物濃度限度的10×10-6法來分別計算，取其最小為最高可接受殘留限度。其中上游的產品為非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊與下游的產品為鹽酸文拉法辛緩釋膠囊。

2.5.1最低日治療劑量的1/1000法

清潔的目的是保證在使用下游產品時，不出現(xiàn)上游產品的生理作用?；谒幬锘钚缘臍埩粝薅葮藴手饕獮樗幬镒畹椭委焺┝康那Х种?，通常認為當藥物的攝入量低于其最低治療劑量的1/1000千分之一時不會給患者帶來不利影響[16]。下游產品批量越大被稀釋的倍數(shù)越大，風險越小。因此需要計算最大殘留限度L1/1000（，單位為μg/cm2），和最高可接受殘留量（Maximum?Acceptable?Carryover，MAC），計算公式為[17]：

2.5.2殘留物濃度限度的10×10-6法

上游產品使用前設備中殘留在設備中的物質活性成分濃度不得高于全部溶流入當前使用設備的解進入下游產品的中所致的濃度不得高于10×10-6，除了高活性、高敏感性藥品，該限度是足夠安全的。因此，有必要進一步考察該方法。L=10B/（（SA?F）（mg/cm2）。取安全因子F=10，則L=103B/SA（μg/cm2），結果及參數(shù)見表1。

以上兩種計算方法計算結果分別為：最低日治療劑量的1/1000法：0.716?mg/?cm2、殘留物濃度限度的10×10-6法：3.80?μg/cm2。應選用殘留量最小的計算結果作為最大清潔后單位面積的殘留限度，即3.80?μg/cm2。擦拭面積100?cm2，棉簽浸入溶液40?mlmL，故棉簽擦拭提取的最大允許清潔殘留濃度為9.50?μg/mL。

2.6線性試驗

精密量取適量的上述“2.2.1”對照品貯備液用50%甲醇依次稀釋成14.25?μg/mL、11.40?μg/mL、9.50?μg/mL、7.60?μg/mL、4.75?μg/mL、1.90和、0.95?μg/mL的系列濃度溶液，每個濃度平行進樣2次。其中，0.95?μg/mL對應的吸收值A為0.043?μg/mL，，14.25?μg/mL對應的吸收值A為0.691，以設縱坐標為吸收值Ay為縱坐標，橫坐標為濃度Cx為橫坐標，對數(shù)據(jù)畫進行線性回歸，得到線性回歸方程，得到Ay=0.0486Cx－0.0027，r=0.9954。r≥0.99，結果表明該線性實驗的非諾貝特酸在0.95～14.25?μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.7定量限試驗

精密量取適量的上述“2.2.1”對照品貯備液用50%甲醇依次稀釋成0.95?μg/mL溶液，重復配制6份，分別測定吸光度A，定量限溶液（n=6）濃度為對照品溶液的1/10。吸收值均大于對照品溶液的2%，RSD為0.83%。故定量限為0.95?μg/mL。

2.8棉簽回收率試驗

精密稱取非諾貝特酸對照品，加溶劑配制出0.76?mg/mlL的溶液約19mg，置于25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.5mL于滴于空白擦拭棉簽上，常溫吹干，將棉簽置于試管中，精密加入10mL?50%甲醇，密封，超聲5?分鐘min，搖勻，精密量取5?mL，置20?mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，，濾過，取續(xù)濾液。同法重復配制備6份。，棉簽回收率溶液（n=6）與對照品溶液，分別按“2.1”項下的色譜條件進樣檢測測定，按外標法計算棉簽回收率。結果表明棉簽回收率（n=6）為96.4%，RSD為4.42%

2.9方法回收率試驗

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液，分別加入空白輔料貯備液5?mL，用溶劑稀釋，?配制出非諾貝特酸0.007?6?mg/mlL、0.009?5?mg/mL?mg/ml和/0.011?4?mg/mL?mg/ml溶液4?mL、5?mL、6?mL各3份，份，分別置于100?mL量瓶中，分別加入空白輔料貯備液5?mL，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，每個濃度各配制3份，共制備9份，。取續(xù)濾液，與對照品溶液，分別測定吸光度A，按“2.1”項下的色譜條件進樣檢測，按外標法計算方法回收率溶液。結果表明方法回收率（n=9）為101.5％，RSD為1.15％。

2.10取樣回收率試驗

擦拭取樣是清潔驗證中使用最廣泛最常見的方法，適用于特定表面的殘留物分析[18]。棉簽擦拭的力度和方法影響取樣回收率，取樣回收率即棉簽擦拭法擦拭相不同設備材質表面殘留藥物成分的百分率。配制系列濃度非諾貝特酸溶液，即最高殘留物限度的50%、100%、150%，將已知濃度對照品溶液濃度的50%、100%、150%的非諾貝特酸溶液，溶液定量分別滴加在面積為100?cm2的不同生產設備材質表面。待自然干燥后，316不銹鋼板，有機玻璃，硅膠表面。用空白棉簽按“2.3”項下方式擦拭，并配制回收溶液，進樣檢測吸收值A，用外標法計算回收率。

精密稱取非諾貝特酸對照品約76?mg，置于50?mL量瓶中，加甲醇40?mL，振蕩溶解并定容，即配制成得1.52?mg/mL?0?μmg/ml的溶液。量取適量上述溶液，用甲醇依次稀釋至0.38?mg/mL?0、0.76?mg/mL?、0和1.140?μmg/mL。精密量取0.5?mL上述溶液各20?μL，取25次，共0.5?mL，分別均勻滴在100?cm2的316不銹鋼板，、有機玻璃，、硅膠材質上，每個濃度平行涂布3份，。待自然干燥后，按5×5方式排列。用潤濕的棉簽擦拭后，剪取棉簽頭浸泡在40?mL溶液，邊超聲置100?mL具塞試管中，加入40?mL浸出溶液，邊振蕩邊超聲5?min左右，分別進樣行檢測，每份平行檢測2次。

在4.75～14.25?μg/mL考察范圍內，得到3個不同濃度溶液，每個濃度平行配制3份，每份進樣2次。結果見表2。測得316不銹鋼板的平均回收率82.2%，RSD為9.47%；有機玻璃的平均回收率75.8%，RSD為4.41%；硅膠的平均回收率76.9%，RSD為4.06%；硅膠對非諾貝特酸吸附性比316不銹鋼板強，平均回收率低。

2.11樣品溶液穩(wěn)定性

取“2.2.1”項下對照品溶液和“2.2.2”項供試品溶液各一份，于避光，冷藏放置，分別于?0?h、4?h、8?h、12?h?取樣進行測定。結果顯示對照品溶液含量相對于0?h，變化分別為-0.4%、-0.5%和、-0.7%，表明12 h內穩(wěn)定可用。供試品溶液含量相對于0?h，變化分別為-0.5%、-0.7%和、-0.8%。均不大于2%，表明12?h內穩(wěn)定性良好。

3結論

結果表明，UV法適用于遠低于最高可接受殘留限度的生產設備上殘留的非諾貝特酸膽堿的定量測定，并具有高效性和靈敏度。棉簽擦拭法來提取回收藥物常用于常規(guī)清潔驗證。清潔驗證樣品中溶劑和輔料均不干擾測定，表明該方法具有專屬性，樣品制備簡單，可快速、高效地定量測定非諾貝特酸膽堿緩釋膠囊的殘留物。

紫外分光光度法操作簡便，適用于清潔后生產設備表面非諾貝特酸膽堿的常規(guī)分析，可作為生產現(xiàn)場清洗工序合格或不合格的評判方法。

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