基于UPLC-Q-TOF/MS技術的中藥防曬乳化學成分分析

李夢雪,孫國東,李玉姍,劉曉東,霍金海,王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036)

密蒙花為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序[1]343,是傳統(tǒng)的眼科用藥。藥用始見于《開寶本草》,謂其“主青盲膚翳,赤澀多眵淚,消目中赤脈,小兒麩痘及疳氣攻眼”。密蒙花主要分布于我國陜西、甘肅、云南、貴州以及華中和華南等地區(qū)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)密蒙花具有抑菌抗炎、抗氧化、醛糖還原酶抑制等多種藥理活性[2]。降香是豆科植物降香檀DalbergiaodoriferaT.Chen的樹干以及根的干燥心材[1]240。藥用始載于唐末李珣的《海藥本草》[3]。主要分布在海南、兩廣及福建等地區(qū)?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)其具有擴血管、調(diào)血脂、降血壓、抗血栓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等作用[4-5]。

研究表明密蒙花中含有黃酮類化合物、苯乙醇苷類、萜類、揮發(fā)油等多種化學成分。主要以黃酮和苯乙醇類為主要代表[6]。目前已從密蒙花中分離得到以蒙花苷為代表的28種黃酮類化合物以及35種苯乙醇苷類化合物,如毛蕊花糖苷、紅景天苷、松果菊苷、地黃苷、紫丁香苷等[6-7];賀銀菊[8]從其花蕾中揮發(fā)油中共鑒定出 26 個成分,其中酯類成分含量最高,其次是醇、酮等成分。研究表明降香化學成為極為復雜,主要包含揮發(fā)油類、倍半萜類、黃酮類、桂皮酰酚類及其他成分[9];其中黃酮類化合物已鑒別出122種,集中于黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮類、異黃烷類、二氫異黃酮類、新黃酮類。

本院中藥所采用提取純化后的降香、密蒙花提取物作為自制防曬乳劑的主要防曬成分,運用超高效液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術快速、準確地對中藥防曬乳進行成分分析,推斷其化學結(jié)構,為中藥防曬乳藥效物質(zhì)基礎、質(zhì)量控制的研究奠定基礎。

1 材料

中藥防曬乳:實驗室自制,以密蒙花、降香為原料經(jīng)提取分離、純化、冷凍干燥后作為防曬主要成分,經(jīng)O/W法制備成乳劑。

AB Sciex ExionLC AD超高效液相色譜儀:Sciex,美國;AB SCIEX Triple-TOFTM5600+質(zhì)譜儀:Sciex,USA;KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;BSA224S-CW型電子天平:Sartorius,Germany;FD-1D-80+冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;AB SCIEX Triple-TOFTM5600質(zhì)譜儀:美國賽克斯公司。

甲醇(分析純):西隴科學股份有限公司;乙腈(色譜純):德國Merck公司;甲酸(色譜純):美國Fisher公司;蒸餾水:廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 稱取中藥防曬乳0.5 g,精密稱定,置具塞刻度離心管中,精密加入3 mL飽和氯化鈉溶液,密塞,用力振搖使分散均勻后,加入8 mL乙腈,超聲處理(功率300 W,頻率100 kHz)20 min,于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min,再次精密加入2 mL乙腈,搖勻,吸上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),AQUITYUPL-CBEH C18VanGuard Pre-Column預柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫為40 ℃,流動相為0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min,5%～70%B;2～22 min,70%～100%B,保持1 min;23～23.1 min,100%～5%B,保持2 min),流速為0.3 mL/min,進樣量為5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),離子化模式為電噴霧正、負離子模式,離子噴霧電壓ESI+/ESI-為5 500 V/-4 500 V;離子源溫度為550 ℃,DP為80/-80 V,CE為35e V/-35e V,CES為15e V。霧化氣體為N2,霧化氣Gas1為379.2 kPa,霧化輔助氣Gas2為379.2 kPa,氣簾氣Cur Gas為241.3 kPa。TOF MS掃描范圍為80～1 500 DA,IDA設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描,Product Ion掃描范圍為50～1 500 DA,開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF 1.6 software;數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)為Peakview 2.0/ masterview 1.0 software。

2.4 數(shù)據(jù)分析 通過查閱密蒙花、降香國內(nèi)外相關文獻,結(jié)合 TCMSP 數(shù)據(jù)庫將中藥防曬乳中密蒙花、降香藥材化學成分信息進行匯總,包括中文或英文名稱、分子式、結(jié)構式、相對分子質(zhì)量、成分類型、CAS號等,形成的一個包含152 種化合物的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。將采集的正、負離子數(shù)據(jù)導入Peakview 2.0,進行目標篩查,選擇相對分子質(zhì)量的理論值與實際值誤差在1.0×10-5范圍內(nèi)的化合物進行結(jié)構推斷。推測各色譜峰對應化合物的分子式;使用 Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 Software(USA AB SCIEX)進行目標篩查,該數(shù)據(jù)中對照品的二級譜圖信息與樣品中的化合物進行自動匹配,確認推斷成分。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析 經(jīng)過色譜條件優(yōu)化,按“2.2”及“2.3”項下條件進行分析,供試品溶液在正、負離子模式下的色譜圖均得到了良好的分離效果及離子化效率,其BPC圖見圖1,化學成分見表1。

表1 基于UPLC-Q-TOF/MS技術分析中藥防曬乳的化學成分

圖1 中藥防曬乳化學成分總離子流圖

3.2 化合物的質(zhì)譜裂解特征分析

3.2.1 黃酮類化合物的分析鑒定 黃酮類化合物是密蒙花和降香中的特征性成分,本研究中共分析鑒別了31個黃酮類化合物。以化合物2(降香成分)為例,根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C15H12O4,tR為6.8 min,二級質(zhì)譜圖見圖2,ESI+模式下檢測到準分子離子為m/z 257[M+H]+,質(zhì)譜圖中存在的豐度最高的137[M+H-C8H8O]+碎片離子為黃酮類成分標志碎片,此碎片提示A環(huán)僅存在一個羥基,準分子離子優(yōu)先脫去羥基產(chǎn)生239[M+H-H2O]+碎片離子,根據(jù)137碎片離子的提示,且239碎片離子的豐度較小,因此推斷此化合物的另一個羥基位于B環(huán)的4’位,此碎片連續(xù)脫去羰基及B環(huán)產(chǎn)生211[M+H-H2O-CO]+及147[M+H-H2O-CO-C5H4]+碎片離子,最后在脫去一分子羰基后產(chǎn)生119[M+H-H2O-2CO-C5H4]+碎片離子,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關文獻[10]以及裂解碎片特征判斷該化合物可能甘草素,可能的裂解方式見圖3。

圖2 化合物2的二級質(zhì)譜圖

圖3 化合物2可能的裂解路線

化合物8分子式為C16H12O5,二級質(zhì)譜圖見圖4。ESI+模式下檢測到準分子離子為m/z 285[M+H]+,此碎片丟失15Da產(chǎn)生270碎片,提示結(jié)構中存在甲氧基,此碎片繼續(xù)丟失一分子水及兩分子CO中性碎片并發(fā)生重排后產(chǎn)生253[M+H-H2O]+、225[M+H-H2O-CO]+及197[M+H-H2O-2CO]+三個碎片離子,而也可以直接丟失C2O產(chǎn)生213碎片離子,而137[M+H-C9H8O2]+碎片離子的存在提示了A環(huán)中僅存在一個羥基,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關文獻以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為毛蕊異黃酮,可能的裂解方式見圖5。

圖4 化合物8的二級質(zhì)譜圖

圖5 化合物8可能的裂解路線

3.2.2 苯乙醇苷類化合物的分析鑒定 苯乙醇苷類化合物是密蒙花中的另一大特征性成分,在本次研究中共分析鑒別了4個苯乙醇苷類化合物;以化合物45(密蒙花成分)為例,根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C29H36O15,tR為4.5 min,二級質(zhì)譜圖見圖6,ESI-模式下準分子離子的質(zhì)荷比為m/z 623[M-H]-,脫掉端基的基團后得到碎片離子m/z 461[M-H-C9H6O3]-及端基中性碎片133[M-H-C21H30O13]-,再脫掉一個糖基得到碎片離子m/z 315[M+H-C9H6O3-C6H10O4]-,此碎片提示此結(jié)構為鼠李糖基團的存在,而此碎片繼續(xù)將端基脫去得到葡萄糖中性碎片179、161及113碎片離子,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關文獻[11]以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為毛蕊花糖苷,可能的裂解方式見圖7。

圖6 化合物45的二級質(zhì)譜圖

圖7 化合物45可能的裂解路線

化合物47分子式為C34H44O19,ESI-模式下檢測到準分子離子為m/z755[M-H]-,直接丟失C6H10O5產(chǎn)生593[M-H-C6H10O5]-碎片,此碎片繼續(xù)丟失C5H8O4后得到461[M-H-C6H10O5-C5H8O4]-碎片,也可直接丟失端基的C9H8O3得到429[M-H-C6H10O5-C5H8O4-C9H8O3]-碎片,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關文獻以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為連翹酯苷B,可能的裂解方式見圖9。

圖8 化合物47的二級質(zhì)譜圖

圖9 化合物47可能的裂解路線

4 討論

經(jīng)過前期試驗研究證實降香、密蒙花乙醇提取物在UVB和UVA區(qū)具有良好的紫外吸收能力,經(jīng)過分離純化后,作為中藥防曬乳劑的主要成分,具有良好的防曬作用[12]。

為了進一步從成分上探究防曬乳劑發(fā)揮防曬和抗氧化作用的原理。本次研究采用UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術對中藥防曬乳劑進行化學成分分析。優(yōu)化了提取溶劑和提取方式,確定以乙腈作為提取溶劑,超聲30 min的條件下獲得的化合物最多。共推斷出48個化合物,包括31個黃酮類化合物、4個苯乙醇苷類成分、3個萜類成分、2個木脂素類成分、2個醌類成分、2個苯丙素類成分、2個其他化合物。為密蒙花、降香藥材的進一步深入研究奠定了一定基礎,也為中藥防曬乳的質(zhì)量控制和未知物的定性篩查提供理論參考和技術支持,為化妝品的質(zhì)量安全提供保障。

本實驗建立了中藥防曬乳的 UPLC-QTOF-MS /MS 高效快速分析的方法,全面地分析了其包含的化學成分,分離效果更好,檢測更全面,利于更多化合物檢出。結(jié)合 Peakview1.2 軟件進行精確相對分子質(zhì)量篩選分析,通過比較一級精確荷質(zhì)比結(jié)合二級質(zhì)譜掃描得到具有較高準確率和分辨率的質(zhì)譜圖,獲得更多準確的碎片信息;結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律、化學對照品質(zhì)譜信息、相關文獻資料等,對中藥防曬乳中可能存在的功效性成分進行了驗證。

本研究獲得的化學成分中大多集中于黃酮類成分和苯乙醇苷類成分,黃酮類化合物是在200～400 nm區(qū)域內(nèi)存在兩個主要的紫外吸收帶,具有較強的紫外吸收能力。本實驗獲得的蘆丁、蒙花苷等黃酮類成分是本研究制得的中藥防曬乳劑主要成分,是其具有吸收紫外線的重要物質(zhì)基礎。通過吸收紫外線的光能轉(zhuǎn)化為熱能和無害的光放射出來,有效阻止紫外線對皮膚的損傷。

經(jīng)化學成分鑒定和文獻研究證實制備的中藥防曬乳劑除具有吸收紫外線的特征,多種成分還具有抗氧化和抗炎作用,可以起到預防光老化和改善皮膚炎癥的作用。本研究為中藥抗氧化和抗炎成分的檢測和具有開發(fā)價值活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了一種新方法。