丹皮酚對腫瘤壞死因子α誘導人星形膠質細胞神經(jīng)損傷模型的保護機制研究

秦劭晨,王愛梅,萬曉波

(1山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院·山西 太原 030024;2太原市中醫(yī)醫(yī)院·山西 太原 030009)

偏頭痛作為一種普遍而復雜的神經(jīng)性疾病,主要癥狀為單側或雙側頭部的搏動樣疼痛,反復發(fā)作,遷延不愈,常伴有惡心、嘔吐和畏光等癥狀[1]。偏頭痛在發(fā)生發(fā)展過程中會誘發(fā)嚴重的中樞炎癥反應[2]。補陽還五湯具有益氣補血、活血通絡的效果,對于氣虛血瘀偏頭痛患者具有良好的臨床療效[3],但其具體作用機制尚不明確。作為補陽還五湯中佐藥之一的赤芍有效成分之一丹皮酚(Paeonol,Pae),具有鎮(zhèn)痛、抗炎、保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用[4],但在偏頭痛中的作用機制尚不明確。本研究采用腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激人星形膠質細胞,構建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,研究Pae對體外炎癥性神經(jīng)損傷模型的保護作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人星形膠質細胞株(HA1800)購自中科院細胞庫。

1.2 實驗藥物與試劑 Pae:上海吉至生化科技公司,貨號:C64600-50mg;地塞米松(DEX):上海麥克林生化科技公司,D917754。TNF-α:北京科興生物科技公司;NO、 MDA、LDH和SOD試劑盒:南京建成生物工程研究公司;TRIZOL:碧云天生物公司;引物:英濰捷基生物工程有限公司設計合成。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒:中國上海貝博生物科技公司;IL-1β、IL-18ELISA試劑盒:美國SAB公司;NLRP3和caspase-1ELISA試劑盒:美國Abcam公司;PrimeScriptTMRT reagent kit, TB Green?Premix Ex TaqTMII:Takara生物公司。DMEM培養(yǎng)基:中國Macklin公司;胎牛血清(FBS):澳大利亞Moregate公司。

1.3 實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱:美國Eppendorf公司;倒置顯微鏡:日本尼康公司;BT25S電子分析天平:德國Sartorius科技有限公司;PIKOREAL 96熒光定量PCR儀:美國Thermo Scientific公司;SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機:德國Kendro Labrotary公司;Varioskan LUX多功能酶標儀:美國Thermo Fisher公司; Attune CytPix成像型流式細胞儀:美國Thermo Fisher公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 取對數(shù)生長期的HA1800細胞,分為正常組(NC)、模型組(TNF-α 10 μg/L)、Pae各濃度組和陽性藥對照組(DEX,10μmol/L)。

2.2 觀察指標

2.2.1 CCK8檢測Pae對HA1800細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的HA1800細胞接種于96孔板中(密度:5 000個/孔),12 h后去除培養(yǎng)上清加入終濃度為1.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L的Pae刺激24 h后,加入CCK8孵育30 min,450 nm波長酶標儀檢測各孔光密度(OD)值。所有實驗重復不少于3次,取平均值。

2.2.2 分光光度法檢測細胞上清液NO、MDA、LDH和SOD水平 取對數(shù)生長期的HA1800細胞種于6孔板中(密度:2×105個/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,正常組加入DMEM,除正常組外,各組均加入TNF-α(10 μg/L)刺激24 h,給藥組加入Pae(50 μmol/L)作用24 h,陽性對照組加入Dex(10 μmol/L)作用24 h,收集細胞上清液,根據(jù)試劑盒說明書操作。所有實驗重復不少于3次,取平均值。

2.2.3 ELISA檢測細胞上清液IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1水平 將HA1800細胞種于12孔板中(密度:5×104個/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,細胞造模給藥方法參照2.2.2,收集細胞后加入Tirzol裂解液,提取RNA,-80℃凍存?zhèn)溆?。收集細胞上清?根據(jù)試劑盒說明書操作。所有實驗重復不少于3次,取平均值。

2.2.4 RT-PCR檢測細胞IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1的mRNA 表達 取2.2.3備用的RNA,根據(jù)TAKARA逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。Gene Bank數(shù)據(jù)庫中檢索引物,由英濰捷基生物工程有限公司設計合成。所有引物序列見表1。按照PCR擴增試劑盒說明書擴增cDNA。PCR反應體系的總體積為18μL。以95℃預變性5 min,95℃變性10 s,60℃退火30 s,95℃延伸15 s,共42個循環(huán)為反應條件。計算結果用GAPDH標化目的基因的相對表達,通過2-ΔΔCt對目的基因進行定量。

表1 PCR引物序列

2.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HA1800細胞種于6孔板中(密度:2×105個/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,細胞造模給藥方法參照2.2.2。給藥結束后收集各孔細胞用預冷PBS離心洗滌,取400 μL 1× Annexin V結合液重懸細胞,細胞濃度2×105個/mL。5 μL Annexin V-FITC染色液加入細胞懸液,輕輕震蕩混勻,在2～8 ℃避光環(huán)境孵育15 min。加入PI染色液(10 μL)輕輕震蕩混勻,在2～8℃避光環(huán)境孵育5 min。最后,流式細胞儀檢測凋亡率。

3 結果

3.1 Pae對HA1800細胞活力的影響 各濃度的Pae作用于HA1800細胞,濃度在25.00～100.00 μmol/L對HA1800細胞均有明顯增殖作用,其中50.00 μmol/L、100.00 μmol/L的Pea對HA1800細胞增殖作用最明顯(P<0.01),結果見表2。

表2 各濃度Pae對星形膠質細胞活力的影響

3.2 Pae對TNF-α誘導的HA1800細胞活力的影響 見表3。

表3 各濃度Pae對TNF-α誘導的HA1800細胞活力的影響

3.3 Pae對TNF-α誘導HA1800細胞神經(jīng)損傷模型NO、MDA、LDH、SOD表達的影響 見表4。

表4 各組細胞上清液NO、MDA、LDH、SOD測定結果比較

3.4 Pae對TNF-α誘導的HA1800細胞神經(jīng)損傷模型IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表達水平的影響 見表5～表6。

表5 各組HA1800 細胞IL-1βmRNA、IL-18 mRNA、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達的比較

表6 各組HA1800 細胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1含量比較

3.5 Pae對TNF-α誘導HA1800細胞神經(jīng)損傷模型細胞凋亡的影響 見表7。

表7 各組HA1800 細胞凋亡率比較

4 討論

偏頭痛作為一種神經(jīng)性炎癥疾病,其發(fā)病機制復雜,癥狀反復遷延難愈,補陽還五湯對于氣虛血瘀型偏頭痛患者具有良好的臨床療效[5],其佐藥赤芍具有活血通絡的作用,Pae作為赤芍的有效成分,有良好的抗炎、抗氧化等藥理作用[6],本研究采用TNF-α刺激HA1800細胞的構建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,探討Pae對于HA1800細胞的炎癥性神經(jīng)損傷狀態(tài)下的保護作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質細胞有星形膠質細胞和小膠質細胞,與神經(jīng)元密切連接的星形膠質細胞,可支持和營養(yǎng)神經(jīng)元;同時,因其與腦血管廣泛接觸,還可調節(jié)大腦血流量[7],由此,星形膠質細胞在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)炎癥環(huán)境下可激活大腦中的神經(jīng)膠質細胞,釋放出炎性細胞因子激活神經(jīng)元,這些炎癥因子成為參與神經(jīng)性疼痛的介質,引起痛覺反應[8]。因此,炎癥環(huán)境下的星形膠質細胞與偏頭痛關系密切。

有研究提出三叉神經(jīng)-內耳神經(jīng)血管的功能失調學說,指出刺激三叉神經(jīng)節(jié)和纖維使內耳血流增加的同時肥大細胞活化,最后釋放炎性介質、神經(jīng)致敏物質等,產(chǎn)生炎癥反應,從而刺激痛覺纖維產(chǎn)生疼痛并傳入中樞,引起偏頭痛[9]。近年來神經(jīng)性偏頭痛中的炎癥反應受到越來越多的關注,IL-1β、IL-18、NLRP3等炎癥介質的釋放可引發(fā)神經(jīng)損傷的同時加重疼痛[10]。

細胞焦亡是一種不同于凋亡和壞死性凋亡的程序化炎癥性細胞死亡過程,表現(xiàn)為細胞腫脹、膜起泡、DNA斷裂和最終細胞裂解,然而,焦亡細胞核通常保持完整,這與中觀察到的細胞核破壞現(xiàn)象不同[11]。NLRP3炎癥小體的激活導致caspase-1活化,caspase-1活化后一方面切割gasdermin(GSDMD),形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段,誘導細胞膜穿孔,細胞破裂,釋放內容物,引起炎癥反應;另一方面,活化的caspase-1可切割IL-1β前體、IL-18前體,形成成熟的IL-1β和IL-18,釋放到細胞外,招募炎癥細胞聚集,擴大炎癥反應,最終發(fā)生細胞焦亡[12-13]。而炎癥反應與偏頭痛又有密切聯(lián)系,因此,本研究采用TNF-α刺激HA1800細胞,構建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,研究Pae對體外炎癥性神經(jīng)損傷模型的保護作用。結果發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激HA1800細胞,造成體外炎癥性神經(jīng)損傷后,出現(xiàn)IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表達水平上調,細胞活力被抑制,凋亡率上升,經(jīng)Pae干預后IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表達水平明顯下調,細胞活力有所改善,凋亡率下調。提示,Pae可能通過抑制HA1800細胞焦亡從而起到抑制神經(jīng)炎癥改善偏頭痛的作用。

體內氧化應激(oxidative stress,OS)會導致炎癥性疾病的加劇[14]。有研究表明,氧化應激水平增高會加劇神經(jīng)炎癥,而神經(jīng)炎癥與偏頭痛密切相關[15]。此外,大量研究結果提示偏頭痛患者外周血中氧化應激水平增高[16],然而目前關于氧化應激與偏頭痛相關的具體機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激HA1800細胞,造成體外炎癥性神經(jīng)損傷后,NO、MDA、LDH水平上調,SOD水平下調,Pae干預后,NO、MDA、LDH水平下調,SOD水平上調,提示Pae可改善TNF-α誘導的星形膠質細胞氧化應激狀態(tài)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在TNF-α刺激的HA1800細胞體外炎癥性神經(jīng)損傷模型中,Pae對可下調IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1等細胞焦亡相關的炎癥介質的過度分泌,改善氧化應激反應,提示Pae可能通過抑制星形膠質細胞焦亡狀態(tài)從而抑制神經(jīng)炎癥改善偏頭痛的作用。Pae是補陽還五湯的主要有效成分,補陽還五湯對于偏頭痛患者有良好的臨床療效,推測在偏頭痛患者中補陽還五湯可通過其有效成分Pae抑制星形膠質細胞焦亡,減輕炎癥反應,從而達到改善神經(jīng)炎癥緩解偏頭痛的作用,但其具體作用機制還需進一步深入研究。