人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡增強(qiáng)纖維化肝臟再生能力

雷耘果 姚嘉 鄭俊 陸桐宇 張杰濱 蕭家麒 劉亞松 陳海填 趙雪剛 楊興業(yè)

肝移植是治療終末期肝病的最有效手段，但是在龐大的等待移植患者人數(shù)的背景下，供肝短缺的問題持續(xù)困擾著移植界，隨著肝移植的不斷發(fā)展，活體肝移植及劈離式肝移植術(shù)逐漸走向成熟，這些尖端的肝移植技術(shù)大大緩解了供肝不足的情況，給眾多終末期肝病患者帶來了福音[1-2]。然而，由于終末期肝病患者常發(fā)生不可預(yù)測(cè)的肝性腦病，消化道大出血等突發(fā)事件，需要緊急器官移植以挽救患者生命，為了擴(kuò)大供者來源，邊緣供肝或劈離式供肝不可避免地成為選項(xiàng)之一，這其中不乏輕度纖維化的供肝[3]。此前國內(nèi)有研究報(bào)道使用邊緣供肝進(jìn)行全肝移植，與非邊緣供肝相比術(shù)后肝腎功能和生存情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。目前使用邊緣供肝進(jìn)行肝移植的療效鮮有報(bào)道，尤其是輕度纖維化的供肝，其療效如何以及促進(jìn)邊緣供肝移植后更好地發(fā)揮作用，避免小肝綜合征發(fā)生的方法仍然未知。

另一方面，慢性肝損傷通常會(huì)導(dǎo)致肝臟炎癥和肝纖維化，甚至發(fā)展為肝癌，研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[5-7]。目前臨床上接受肝切除術(shù)的患者多伴有肝纖維化，我國肝癌患者中，80%以上合并肝硬化或肝纖維化等基礎(chǔ)肝病，行肝癌切除后如何更好促進(jìn)肝功能恢復(fù)仍然是目前外科需要解決的問題。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種能夠刺激肝細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，既往研究表明其在肝再生、肝纖維化等方面具有重要的臨床意義[8-10]，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)HSC 可以分泌HGF 到胞外發(fā)揮相關(guān)生理作用[11]。

作為細(xì)胞治療的主力軍，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、促進(jìn)血管新生等作用，而近年來越來越多的研究證實(shí)MSC 來源的細(xì)胞外囊泡（MSC-derived extracellular vesicle，MSC-EV）是MSC 發(fā)揮生物學(xué)功能的重要方式[12-15]。本文旨在探討纖維化肝臟在部分肝切除后與正常肝臟部分肝切除后的再生能力比較有否變化，并探究MSC-EV 在纖維化肝臟部分肝切術(shù)后肝再生中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取10～12 周的健康雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)純系C57BL/6 小鼠24 只，體質(zhì)量25～30 g，該小鼠購于廣東藥康生物科技有限公司。人肝臟星狀細(xì)胞系LX-2 由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝病實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng)。本實(shí)驗(yàn)研究方案已經(jīng)通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.1.2 試 劑 增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、β-actin、α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ki67 抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司，HGF 抗體購于美國Signalway Antibody LLC 公司，流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)抗體[藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-Cy7-CD105，別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）-人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR 和APC-CD34]及蛋白質(zhì)印跡法二抗購于英國Abcam 公司，Dir 染料購于深圳市文樂生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）相關(guān)試劑購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β 購于廣州妙博生物科技有限公司，四氯化碳（CCl4）及橄欖油購于廣州碩譜生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立及標(biāo)本采集

1.2.1 小鼠肝臟纖維化部分肝切除模型建立和分組所有小鼠根據(jù)耳標(biāo)編號(hào)隨機(jī)分為正常肝臟70%肝切除組（Oil+PHx 組），肝纖維化70%肝切除組（CCl4+PHx 組），肝纖維化70%肝切除+MSC-EV 治療組（CCl4+PHx+MSC-EV 組），每組8 只，部分肝切除方法按照以往文獻(xiàn)所述方法[16]。Oil+PHx 組使用橄欖油進(jìn)行腹腔注射（注射量5 μL/g，每周2 次，注射2 周）；其余兩組使用CCl4和橄欖油按照1 ∶4 體積比配制后進(jìn)行腹腔注射（注射量和時(shí)間同上）[17-18]。注射2 周后3 組動(dòng)物進(jìn)行70%肝部分切除術(shù)[16,19-20]，CCl4+PHx+MSC-EV 組在關(guān)腹前經(jīng)腔靜脈注射MSCEV，術(shù)后2 d 取材。

1.2.2 標(biāo)本采集 使用戊巴比妥鈉麻醉后經(jīng)眼球取小鼠外周血，室溫靜置約30 min，后使用離心機(jī)1 000 ×g離心15 min，取上層血清。處死小鼠，剪開小鼠下腔靜脈，使用生理鹽水經(jīng)心臟進(jìn)行驅(qū)血，后摘取部分肝臟浸泡于4%多聚甲醛固定后使用石蠟包埋并制作切片；另一部分經(jīng)過液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞模型建立與分組

1.3.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞外囊泡的制備與鑒定 新鮮臍帶標(biāo)本取自于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的孕產(chǎn)婦，標(biāo)本獲取前均簽署知情同意書。從新鮮臍帶標(biāo)本中提取人臍帶MSC（human umbilical cord MSC，hUC-MSC），并采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面免疫表型鑒定（CD105、CD35、HLA-DR）。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%后分別更換成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而對(duì)照組使用常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。約14 d 后分別進(jìn)行油紅O 或茜素紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝影。

從hUC-MSC 中提取hUC-MSC-EV，并進(jìn)行標(biāo)志物[CD81、CD9、CD63、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucoseregulated protein，GRP）94]檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)胞分組與處理 將培養(yǎng)穩(wěn)定，狀態(tài)良好的LX-2細(xì)胞均勻分為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 組、TGF-β 組、TGF-β+MSC-EV 組，培養(yǎng)于12 孔板中，細(xì)胞密度約50%。PBS 組為正常培養(yǎng)的LX-2 細(xì)胞，無其他特殊處理；TGF-β 組為活化的LX-2 細(xì)胞，每孔TGF-β 的量為10 ng/mL[21-22]，誘導(dǎo)48 h 后換取新鮮完全培養(yǎng)基；TGF-β+MSC-EV 組處理方法同TGF-β 組，TGF-β 誘導(dǎo)48 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基，每孔加入60 μg MSC-EV。以上各組均于48 h后收集細(xì)胞蛋白、RNA 及上清液，以備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組小鼠血清的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平及LX-2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液HGF 表達(dá)水平。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 提取各組小鼠肝組織和各組LX-2 細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行電泳。將電泳蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，脫脂奶粉封閉1 h，使用前述抗體分別孵育過夜，后使用二抗室溫孵育1 h，檢測(cè)各組小鼠肝組織的PCNA、HGF、α-SMA 蛋白表達(dá)，檢測(cè)各組LX-2 細(xì)胞HGF、α-SMA 蛋白表達(dá)情況。

1.4.3 蘇木素-伊紅染色 肝組織石蠟切片脫蠟水洗后，放入蘇木素染液染3～5 min，分化液分化后，伊紅染色5 min，水洗后乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.4 天狼星紅染色 肝組織石蠟切片脫蠟后水洗，將切片放入天狼星紅染液中染色8 min，無水乙醇脫水后二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.4.5 免疫組織化學(xué)染色 肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水洗、抗原修復(fù)后滴加1∶200 比例稀釋的Ki67、α-SMA 一抗4 ℃過夜孵育。次日浸洗后滴加二抗，37 ℃孵育30 min。浸洗后使用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）（1∶50）進(jìn)行顯色。浸洗后蘇木素染核1 min，浸洗后吹干、封片。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 采用Trizol總RNA 提取試劑提取細(xì)胞樣本總RNA，測(cè)量細(xì)胞樣本RNA 濃度，進(jìn)行互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后擴(kuò)增。每個(gè)樣本重復(fù)3 次試驗(yàn)并記錄Ct 值，計(jì)算目的基因[Collagen Ⅰ、成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HGF]信使RNA（messenger RNA，mRMA）的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.7 LX-2 細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn) 待LX-2 細(xì)胞融合度達(dá)到50%，加入PKH-26 染料預(yù)染的MSC-EV 共孵育2 d，浸洗后4%多聚甲醛溶液固定10 min；浸洗后室溫通透；浸洗后滴加正常山羊血清室溫封閉30 min；α-SMA一抗4 ℃孵育過夜；清洗后滴加稀釋好的熒光二抗，避光室溫孵育1 h；清洗后1 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光孵育5 min；清洗后封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC 分離及hUC-MSC-EV 鑒定

光學(xué)顯微鏡下可見分離的hUC-MSC 生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分布均勻（圖1A）；成骨成脂實(shí)驗(yàn)顯示該hUCMSC 有良好的向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能（圖1B、C）。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，hUC-MSC 高表達(dá)CD105，低表達(dá)CD34 和HLA-DR（圖1D～F）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示hUC-MSC-EV 較hUC-MSC 高表達(dá)CD81、CD63 及CD9，而低表達(dá)GRP94（圖1G）。

圖1 hUC-MSC 細(xì)胞及hUC-MSC-EV 鑒定Figure 1 Identification of hUC-MSC and hUC-MSC-EV

2.2 小鼠肝部分切除術(shù)后各組血清AST、ALT、LDH 水平變化

與Oil+PHx 組比較，CCl4+PHx 組小鼠血清AST、ALT、LDH 水平均升高；與CCl4+PHx 組比較，CCl4+PHx+MSC-EV 組小鼠血清AST、ALT、LDH 水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖2）。

圖2 小鼠肝部分切除術(shù)后各組血清AST、ALT、LDH 水平變化Figure 2 Changes of serum AST,ALT and LDH of mice among each group after partial hepatectomy

2.3 MSC-EV 減輕肝纖維化程度

肝臟大體標(biāo)本及HE 染色結(jié)果顯示，CCl4+PHx組纖維化較Oil+PHx 組明顯，CCl4+PHx+MSC-EV 組纖維化程度較CCl4+PHx 組減輕，肝損傷修復(fù)較好（圖3A）。

天狼星紅染色及α-SMA 染色結(jié)果顯示，與Oil+PHx 組比較，CCl4+PHx 組陽性區(qū)域面積增大；與CCl4+PHx 組比較，CCl4+PHx+MSC-EV 組陽性區(qū)域面積縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖3A～C）。

與Oil+PHx 組 比 較，CCl4+PHx 組α-SMA蛋白表達(dá)水平升高；與CCl4+PHx 組比較，CCl4+PHx+MSC-EV 組α-SMA 蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖3D、E）。

圖3 各組小鼠部分肝切除術(shù)后纖維化相關(guān)指標(biāo)比較Figure 3 Comparison of fibrosis related indexes of mice among each group after partial hepatectomy

2.4 MSC-EV 促進(jìn)肝再生

免疫組織化學(xué)染色顯示，CCl4+PHx 組Ki67 表達(dá)量較Oil+PHx 低，CCl4+PHx+MSC-EV 組Ki67 表達(dá)量較CCl4+PHx 組上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖4A）。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，CCl4+PHx 組PCNA 蛋白表達(dá)量較Oil+PHx 組低，CCl4+PHx+MSC-EV 組PCNA 蛋白表達(dá)量較CCl4+PHx 組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖4B）。

圖4 各組小鼠部分肝切除術(shù)后增殖相關(guān)指標(biāo)比較Figure 4 Comparison of proliferation-related indexes of mice among each group after partial hepatectomy

2.5 MSC-EV 促進(jìn)活化的HSC 分泌HGF

LX-2 細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LX-2 細(xì)胞攝取了大量MSC-EV（圖5A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，與PBS組比較，TGF-β 組LX-2 細(xì)胞內(nèi)Collagen ⅠmRNA 表達(dá)升高；與TGF-β 組比較，TGF-β+MSC-EV 組LX-2細(xì)胞內(nèi)Collagen ⅠmRNA 表達(dá)下降（均為P＜0.05，圖5B）。各組FGF、EGF、VEGF mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05，圖5C～E）；PBS 組與TGF-β 組HGF mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TGF-β+MSC-EV 組LX-2 細(xì)胞內(nèi)HGF mRNA 表達(dá)較TGF-β 組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5F）。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與PBS 組比較，TGF-β組α-SMA 蛋白表達(dá)水平升高；與TGF-β 組比較，TGF-β+MSC-EV 組HGF 蛋白表達(dá)水平升高，α-SMA蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖5G～I(xiàn)）。

ELISA結(jié)果顯示，TGF-β組細(xì)胞上清液HGF蛋白水平較PBS 組下降，TGF-β+MSC-EV 組細(xì)胞上清液HGF蛋白水平較TGF-β 組升高（均為P＜0.05，圖5J）。

圖5 各組細(xì)胞生長(zhǎng)因子比較Figure 5 Comparison of cell growth factor among each group

2.6 MSC-EV 對(duì)肝臟HGF 表達(dá)的影響

CCl4+PHx 組HGF 蛋白表達(dá)水平較Oil+PHx組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CCl4+PHx+MSC-EV 組HGF 蛋白表達(dá)水平較CCl4+PHx 組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組小鼠肝臟HGF 表達(dá)情況Figure 6 HGF expression in liver of mice among each group

3 討論

肝臟具備獨(dú)特的損傷后再生能力，是再生能力最強(qiáng)的器官，肝再生對(duì)于肝臟外科常見手術(shù)及肝移植術(shù)后肝功能迅速恢復(fù)有較強(qiáng)的研究?jī)r(jià)值[23-24]。肝再生的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，Hu 等[25]發(fā)現(xiàn)MSC 可以通過調(diào)控免疫細(xì)胞促進(jìn)肝再生。最近有研究報(bào)道，過氧化物酶體增殖物激活受體α 可以通過Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）-TEA 轉(zhuǎn)錄因子（TEA domain transcription factor，TEAD）通路調(diào)節(jié)肝再生[26]。此外，有學(xué)者提出激活的枯否細(xì)胞可以通過分泌GRP78 促進(jìn)肝再生并提高致死小鼠模型的存活率[27]。本研究通過免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)印跡法等測(cè)定各組小鼠增殖相關(guān)蛋白PCNA、Ki67 的變化，發(fā)現(xiàn)纖維化肝臟部分肝切除后增殖能力較正常肝臟部分肝切除組下降，而注射MSC-EV 后纖維化肝臟增殖能力獲得了明顯提升。

HSC 是肝臟中的一個(gè)小細(xì)胞群，其在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展以及肝損傷后肝再生的啟動(dòng)和終止發(fā)揮重要的作用[28-32]。研究發(fā)現(xiàn)MSC-EV 可以通過miR-141-3p/PTEN/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路抑制肝纖維化中HSC 的活化進(jìn)而減輕肝纖維化[33]。類似研究發(fā)現(xiàn)，扁桃體來源的MSC-EV 可以通過miR-486-5p 減輕HSC 的活化和肝纖維化[34]。另一方面，衰老的HSC 可以通過白細(xì)胞介素-6 和CXC 趨化因子受體2（CXC chemokine receptor 2，CXCR2）配體促進(jìn)肝再生[35]。以上研究充分表明HSC 在肝纖維化及肝再生中扮演著重要的角色，本研究使用TGF-β 活化LX-2 細(xì)胞，并與MSC-EV 共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LX-2 細(xì)胞內(nèi)Collagen Ⅰ mRNA 水平降低，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到CCl4+PHx+MSC-EV 組纖維化相關(guān)蛋白α-SMA 表達(dá)降低，表明MSC-EV 治療后肝臟纖維化程度減輕。LX-2 細(xì)胞活化及MSC-EV 治療前后，各組EGF、FGF、VEGF 等生長(zhǎng)因子mRNA 水平無明顯變化，而CCl4+PHx+MSC-EV 組HGF 呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，表明MSC-EV 可以通過促進(jìn)活化的HSC 細(xì)胞分泌HGF，進(jìn)而促進(jìn)肝再生。細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)中在共聚焦顯微鏡下觀察到了HSC 攝取MSC-EV，然而MSC-EV 作用于HSC 的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)纖維化肝臟的自然再生能力較正常肝臟再生能力差，而纖維化肝臟的HSC 分泌HGF 減少可能是導(dǎo)致這一結(jié)果的重要原因，MSC-EV 可能通過促進(jìn)纖維化肝臟中的HSC 分泌HGF，進(jìn)而促進(jìn)肝再生。這一研究結(jié)果可以為今后的肝再生研究提供新的思路，并為MSCEV 的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。