克氏原螯蝦腸道菌群的結構、功能及其影響因素

石 玉，馮光志，何立超

（ 1.武漢設計工程學院 食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205；2.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkia），俗稱小龍蝦，20世紀20年代由日本引入我國[1]，到20世紀70年代，克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)開始飛速發(fā)展，逐漸從簡單的養(yǎng)殖加工發(fā)展成為集育苗、養(yǎng)殖、加工、銷售，以及餐飲、休閑旅游和文化等為一體的綜合性產(chǎn)業(yè)。2021年，我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積2 600萬畝、產(chǎn)量263.36萬t，同比分別增長19.01%和10.02%，克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值為4 221.95億元，同比增長22.43%[2]。

目前，對克氏原螯蝦的研究主要集中于行為學[3-4]、種群結構[5]與分布[6]及疾病[7-8]與免疫[9-11]等，有關營養(yǎng)與飼料的研究主要集中在脂肪[12-13]、蛋白質[14]等方面。隨著我國小龍蝦產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，相關的科學研究已顯得較為滯后，難以解決規(guī)?；B(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的一些新問題，主要包括克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中的健康監(jiān)測、疾病預防、免疫力增強和迫切需求的高效利用飼料等。隨著研究的逐漸深入，科研工作者們發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)動物的生長代謝、營養(yǎng)吸收和免疫抗病都與腸道微生物的作用密不可分，腸道微生物種群多樣性和結構組成是影響宿主健康的重要因素[15-16]。

關于克氏原螯蝦腸道微生物的相關研究還處于起步階段，對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響因素進行研究，可以通過調節(jié)腸道菌群結構來改善克氏原螯蝦的健康狀況，增強免疫力。研究克氏原螯蝦腸道菌群的物種組成、特性和功能，有助于了解這些物種在宿主生長發(fā)育過程中的作用以及演替規(guī)律，有助于了解宿主與菌群間的相互關系。通過對克氏原螯蝦腸道中功能益生菌進行篩選，并利用這些微生物制備微生物制劑，開發(fā)克氏原螯蝦專屬的高效利用飼料，也有利于解決克氏原螯蝦規(guī)?；B(yǎng)殖過程中的飼料瓶頸問題。本文總結了克氏原螯蝦腸道微生物的研究方法、腸道微生物群落的構建及其演替規(guī)律、腸道微生物的相關功能，重點綜述了影響腸道微生物結構的因素（食物、生長環(huán)境、發(fā)育階段、性別及疾病），為克氏原螯蝦規(guī)?；】叼B(yǎng)殖和腸道微生物的進一步研究和利用提供參考。

1 克氏原螯蝦腸道微生物的研究方法

近些年，腸道微生物的研究已成為熱點之一，推動了腸道微生物研究方法的不斷革新，從傳統(tǒng)培養(yǎng)的檢測方法發(fā)展成基于16S rDNA的分子檢測方法，演化出變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端片段長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP）等指紋圖譜技術，伴隨測序技術的快速發(fā)展，高通量測序技術，又稱“二代測序”逐漸成為腸道微生物研究的主流方法。

第二代測序技術，其核心優(yōu)勢在于可以一次性對上百萬條DNA分子并行測序，并且檢測結果更加準確、測序時間更短，實驗成本更低。在二代測序技術出現(xiàn)后，相繼出現(xiàn)了多種平臺，其中Illumina測序平臺（Solexa公司）和454焦磷酸測序平臺（Roche公司）應用較為廣泛。利用Illumina測序平臺在腸道微生物多樣性研究中的基本流程為基因提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及純化基因序列、上機測序和信息數(shù)據(jù)分析，該技術已成為研究微生物群落多樣性的首選[17]，在植物內生細菌[18-19]、腸道微生物[20-22]、環(huán)境工程[23-24]、農(nóng)作物育種技術[25]等領域都有應用。

第二代測序技術雖然測序通量高，但是序列讀長變短，并且需要通過PCR擴增來完成測序，從而降低了測序的準確性，因此，第三代測序技術誕生。與第二代測序技術相比，第三代測序技術具有超長的序列讀取長度、運行速度快、且不需要經(jīng)過PCR擴增，避免了堿基替換及偏置等錯誤出現(xiàn)，提高了測序的準確性，具有廣闊的應用前景?？偠灾?，隨著測序需求的不斷增加，高通量測序技術還將繼續(xù)革新和發(fā)展，朝著測序更精準、操作更簡化、生物信息學分析更自動化的方向推進。

2 克氏原螯蝦腸道微生物群落的結構及其演替規(guī)律

腸道微生物作為動物體最龐大、最復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，本身及其代謝產(chǎn)物不僅能調節(jié)動物體健康，在水產(chǎn)動物營養(yǎng)吸收、生長代謝和免疫抗病等方面發(fā)揮著重要作用，伴隨著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，克氏原螯蝦腸道微生物近些年也成為研究的熱點。馮光志等[26]采用純培養(yǎng)法，從克氏原螯蝦腸道篩選產(chǎn)木聚糖酶細菌，并對克氏原螯蝦腸道細菌進行了16S高通量測序，表明克氏原螯蝦腸道內細菌資源豐富，在屬水平上，克氏原螯蝦腸道細菌主要是桿狀念珠菌屬（Candidatus Bacilloplasma）、擬桿菌屬（Bacteroides）、弧菌屬（Vibrio）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、營發(fā)酵單胞菌屬（Dysgonomonas）、泰勒菌3（Tyzzerella 3）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella），芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌在木質纖維素降解過程中發(fā)揮一定功能。SHUI Y等[27]研究了克氏原螯蝦-水稻一體化栽培模式下養(yǎng)殖的克氏原螯蝦腸道細菌群落組成多樣性。結果顯示，優(yōu)勢菌群在門水平上為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroides）。賈麗娟等[28]研究了武漢地區(qū)、永州地區(qū)、韶關地區(qū)稻蝦綜合種養(yǎng)系統(tǒng)的微生物群落結構。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物的優(yōu)勢菌門種類沒有變化，但是，優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的相對豐度會改變。謝夢琪等[29]研究表明，不同生長階段的克氏原螯蝦腸道微生物群落多樣性、豐度及功能都有顯著差異，成蝦腸道菌群多樣性比幼蝦降低，多種代謝功能升高。由此可見，不同生長階段克氏原螯蝦腸道微生物含有相對固定的菌群結構，在成熟階段，菌群結構更趨于穩(wěn)定。這為研究菌群在腸道內行使的生理功能，以及菌群與宿主的共生關系提供了可能。目前，關于克氏原螯蝦腸道微生物的研究，在腸道細菌方面研究的較多，而腸道中同樣也寄居著大量的真菌。它們與腸道中的細菌一起構成腸道內功能強大的微生態(tài)系統(tǒng)。真菌消化酶產(chǎn)量較細菌更大，然而，對克氏原螯蝦腸道內真菌的研究還鮮見報道。

3 影響克氏原螯蝦腸道微生物結構的因素

克氏原螯蝦腸道菌群結構的相關研究逐步揭開了克氏原螯蝦腸道微生物的面紗。然而，克氏原螯蝦腸道微生物的組成受食物、生長環(huán)境、發(fā)育階段、性別乃至疾病等多種因素的影響。

3.1 食物對腸道微生物結構的影響

宿主自身不能或未消化分解的食物，最終都成了腸道微生物的佳肴。同樣，這些不同來源的食物也會反過來影響腸道內微生物的種類和豐度。對人類腸道微生物的研究發(fā)現(xiàn)，不同國度不同飲食習慣的人腸道菌群差異顯著[30-32]。不同食物來源的克氏原螯蝦腸道微生物菌群同樣也存在較大差異。

大量研究聚焦在克氏原螯蝦對蛋白質、脂質、維生素、微量元素等營養(yǎng)素需求及飼料開發(fā)方面。楊偉杰等[33]研究不同生長階段克氏原螯蝦對飼料中蛋白質水平的需求，表明不同生長階段的克氏原鰲蝦對飼料蛋白水平的需求存在明顯差異。彭迪等[34]探討脂肪水平分別為1.98%（對照組）、4.12%、5.84%、7.89%、10.48%和11.89%的6組半精制飼料對克氏原鰲蝦生長性能的影響，顯示克氏原螯蝦親蝦對脂肪需要量為7.60%～7.89%。張詩雨等[35]研究殼寡糖對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響，實驗組的Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05），在飼料中添加適量的殼寡糖可以提高克氏原螯蝦消化酶活性，改善腸道菌群結構。劉永濤等[36]分別投喂5種不同飼料（玉米、大豆、添加了復方黃芪多糖蛋白質含量≥26%的飼料、蛋白質含量≥26%的飼料、蛋白質含量≥28%的飼料），研究克氏原鰲蝦的生長性能、非特異性免疫，表明添加了復方黃芪多糖蛋白含量≥26%的飼料優(yōu)于其他飼料。賴婷等[37]研究較極端條件下克氏原鰲蝦的腸道菌群變化，對克氏原螯蝦饑餓脅迫28 d，發(fā)現(xiàn)饑餓第7天腸道微生物多樣性高于第0、14、28天，其菌群組成結構在不同水平的物種豐度上均發(fā)生顯著變化。隨著研究的逐漸深入，科研工作者研究發(fā)現(xiàn)[38-40]，在飼料中添加微生物制劑，可以顯著改善克氏原鰲蝦腸道菌群結構，提高免疫力。田立立等[38]在克氏原螯蝦飼料中添加乳酸菌，研究克氏原螯蝦菌群結構變化，表明飼料中添加乳酸菌能改變克氏原螯蝦腸道菌群結構，改善非特異性免疫機能。ZHANG Z T等[39]研究發(fā)酵或非發(fā)酵飼料對克氏原螯蝦腸道菌群組成的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料飼喂的克氏原螯蝦腸道中擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度顯著高于非發(fā)酵飼料，表明發(fā)酵飼料對腸道微生物群的功能（如多糖降解）具有重要作用。晏明瑤等[40]研究不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦腸道形態(tài)結構、消化能力的影響，發(fā)現(xiàn)與硬顆粒飼料相比，生物發(fā)酵飼料可以提高幼蝦腸道消化吸收面積，提高消化酶活力和消化能力，促進幼蝦生長，這與克氏原螯蝦腸道微生物結構的演變密切相關。

在所有影響腸道微生物結構的因素中，食物是最容易發(fā)生改變和調節(jié)的因素，因此，通過調整食物來調節(jié)腸道微生物的結構，改善克氏原螯蝦的健康狀況具有較大的應用前景，在克氏原螯蝦飼料中添加益生菌制劑[41]，能夠改善腸道菌群結構，抵御有害病菌，預防疾病。

3.2 環(huán)境因素對腸道微生物結構的影響

克氏原螯蝦的腸道菌群部分來自環(huán)境。生長環(huán)境的不同，必然會引起腸道微生物菌群結構的變化。WANG Y等[42]探討了池塘養(yǎng)殖和水稻共養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道微生物群落與周圍環(huán)境之間的生態(tài)相互作用，發(fā)現(xiàn)水、沉積物與克氏原螯蝦腸道的微生物組成有顯著差異，而兩種養(yǎng)殖模式的微生物組成無顯著差異。李飛等[43]分析池塘和稻田養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道的微生物多樣性。結果顯示，池塘和稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦腸道微生物在物種組成、多樣性上都存在明顯差異。池塘模式下腸道微生物多樣性較低，認為是兩種模式下克氏原螯蝦生長環(huán)境不同所致，但兩種模式下腸道內的優(yōu)勢菌群相似。CHEN X等[44]分析池塘和稻田養(yǎng)殖模式下的克氏原螯蝦腸道微生物，發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)境中細菌和古菌群落的相對豐度差異顯著，而真菌和病毒群落的相對豐度差異不顯著。不同的生長環(huán)境，克氏原螯蝦腸道微生物菌群結構存在差異，與其生長環(huán)境存在一定的相關性，如池塘和稻田兩種養(yǎng)殖模式下，稻田種植和管理為克氏原螯蝦提供了豐富和多樣的餌料、微生物和水質環(huán)境。

相同環(huán)境下生長的克氏原螯蝦腸道微生物結構的差異與許多因素有關。李雪紅等[45]對克氏原螯蝦尾肉、養(yǎng)殖水體及周圍土壤進行基因序列測序，分析克氏原螯蝦蝦肉與其生長環(huán)境之間的相關性，發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦、土壤和水體中有相對固定的優(yōu)勢菌群，克氏原螯蝦的養(yǎng)殖環(huán)境與克氏原螯蝦蝦肉間微生物聯(lián)系密切。葉建勇等[46]對克氏原螯蝦腸道、養(yǎng)殖水體、池塘底泥及飼料進行基因序列測序，分析腸道與外界養(yǎng)殖環(huán)境之間的相關性，結果表明克氏原螯蝦腸道菌群多樣性在較大程度上受到外界環(huán)境細菌的影響，特別是底泥中的細菌，但同時也有一定的保守性，可能是腸道原著細菌影響。王飛飛等[47]研究稻蝦模式下克氏原螯蝦腸道、肝胰腺、鰓及其養(yǎng)殖池塘水體、底泥中菌群多樣性，結果表明克氏原螯蝦腸道、肝胰腺、鰓與其養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結構存在著一定的相關性，但各樣品優(yōu)勢菌群差異較大。由此可見，克氏原螯蝦腸道菌群結構受其生長環(huán)境中的土壤、水體、池塘底泥及飼料等因素的影響，但腸道菌群也具有保守性，維持著相對固定的優(yōu)勢菌群。

3.3 發(fā)育階段對腸道微生物結構的影響

生物體在剛出生時腸道內并沒有微生物，腸道中的微生物都是在后天的生命活動中慢慢累積，逐漸形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。不同年齡和發(fā)育階段，腸道內微生物結構也會有差別。謝夢琪等[29]研究了不同生長階段對克氏原螯蝦腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)成蝦腸道菌群多樣性低于幼蝦，多種代謝功能升高。ZHANG Z T等[39]研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦在發(fā)育過程中腸道菌群組成的alpha多樣性下降，腸道微生物群具有高度可比性，且有發(fā)育依賴性。XIE M Q等[48]分析實驗室培養(yǎng)的1齡、2齡、3齡、幼蝦和克氏原螯蝦成蝦腸道樣本，在幼蟲發(fā)育早期，腸道菌群的結構相似，隨著生長發(fā)育，腸道菌群的組成和功能也發(fā)生了變化，alpha多樣性隨下降。腸道微生物多樣性常作為宿主健康的生物指標[49]，克氏原螯蝦幼蝦生物多樣性高于成蝦，一個可能的原因是克氏原螯蝦在幼蝦階段時，胃腸道發(fā)育尚不健全，免疫系統(tǒng)也還不完善，幼蝦的腸道菌群更易受到外界環(huán)境的影響，水體和淤泥中的微生物更容易進入到幼蝦腸道，而隨著幼蝦的發(fā)育成熟，成蝦的腸道菌群結構趨于穩(wěn)定，對外來微生物也具有選擇性。由此可見，克氏原螯蝦的發(fā)育階段影響其腸道微生物的菌群結構，腸道內的微生物又行使特殊的功能，服務于克氏原螯蝦的生長發(fā)育。腸道微生物的演替過程與克氏原螯蝦的生命活動息息相關，弄清克氏原螯蝦腸道內微生物的演替規(guī)律，有助于揭示腸道微生物在克氏原螯蝦生長過程中的作用。

3.4 性別對腸道微生物的影響

性別對于腸道微生物的影響常具有不確定性。一些研究表明，不同性別動物腸道微生物菌群結構不同。許剛等[50]研究了5齡家蠶第3天雄、雌幼蟲中腸道微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)雌蠶與雄蠶腸道微生物類群的組成和所占比率存在明顯差異。韓學平等[51]研究環(huán)湖牦牛瘤胃微生物區(qū)系特征和性別之間的差異，發(fā)現(xiàn)性別顯著影響牦牛瘤胃微生物區(qū)系的組成，尤其是在屬水平上差異較大。人類腸道微生物同樣存在性別差異，女性腸道微生物多樣性高于男性[52]。一種觀點認為，腸道微生物受宿主性激素調節(jié)，宿主分泌的激素水平不同，腸道微生物多樣性不同。也有些研究顯示，性別與腸道微生物菌群結構沒有顯著性差異。何永果等[53]研究表明，成年大熊貓性別對腸道菌群沒有影響。謝夢琪等[29]探討了性別對克氏原螯蝦腸道菌群的影響，表明不同性別克氏原螯蝦腸道菌群的多樣性和功能均沒有顯著差異，但各優(yōu)勢菌群在個體間的豐度差異較大。然而，性別對克氏原螯蝦腸道微生物的影響，在克氏原螯蝦生長的各個階段可能有所不同。在克氏原螯蝦生長的特定階段，其腸道微生物也可能表現(xiàn)出差異，而行使特殊功能，這方面的研究還需要繼續(xù)進行。研究性別在不同發(fā)育階段對克氏原螯蝦腸道微生物的影響，有利于揭示腸道微生物的功能與宿主發(fā)育的關系。

3.5 疾病對腸道微生物的影響

克氏原螯蝦腸道中數(shù)量巨大、種類多樣的微生物復雜生態(tài)系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中，一旦平衡被打破，腸道中的致病菌就可能導致克氏原螯蝦患病。目前，已報道的克氏原螯蝦致病的病原主要有白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilia）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和弗氏檸檬酸桿菌（Cit robcter freundii）等[54]。陳一銘等[55]揭示感染了白斑綜合征病毒克氏原螯蝦腸道菌群的變化，結果說明白斑綜合征病毒或可通過干擾腸道穩(wěn)態(tài)致病。XIONG J等[56]研究表明，腸道菌群的變化與蝦病的嚴重程度密切相關。張立強等[57]通過Illumina高通量測序技術探索了健康與患病克氏原螯蝦腸道微生物菌群結構和多樣性的差異。結果表明，患病克氏原螯蝦腸道微生物中變形菌門的占比顯著上升，生物多樣性顯著下降。吳金鳳等[58]研究發(fā)病對蝦與健康對蝦細菌的群落結構和多樣性，并嘗試挑選指示物種，利用對蝦的腸道細菌差異來指示其健康狀況，具有一定的實際意義。除了藥物治療外，投喂益生菌制劑調節(jié)腸道菌群結構，篩選能夠代表克氏原螯蝦健康的指示物種，對于防御克氏原螯蝦疾病具有積極作用。

克氏原螯蝦腸道微生物菌群結構會受到許多因素影響而發(fā)生演變，它們又有相對固定的優(yōu)勢菌群，具有一定的保守性。可以嘗試通過改變這些影響因素，優(yōu)化克氏原螯蝦腸道菌群結構，保障克氏原螯蝦的健康和預防疾病?？耸显r腸道微生物影響因素及菌群結構變化見表1。

4 克氏原螯蝦腸道微生物的生理功能

腸道微生物作為宿主后天獲得的非常重要的“器官”，與宿主正常的生理過程息息相關，在促進食物消化、免疫調節(jié)、改善腸屏障、抵御病菌等方面都發(fā)揮重要功能和關鍵作用[59-61]。目前，人體腸道微生物功能的相關研究較多，但仍然有很多功能和作用機制沒有解開。

克氏原螯蝦腸道微生物在生命活動中發(fā)揮著重要作用。馮光志等[62]從克氏原螯蝦腸道中篩選到產(chǎn)纖維素酶細菌，高通量測序結果表明，該菌基因組含有許多碳水化合物相關酶基因，有較高的纖維素降解能力，表明克氏原螯蝦腸道細菌在輔助克氏原螯蝦降解纖維素過程中發(fā)揮一定作用。XU Y等[63]在克氏原螯蝦日糧中添加釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)各組間免疫相關基因Crustin2的表達相似，而溶菌酶和酚氧化酶的表達水平在處理組中顯著升高，Prophenoloxidase的表達量最高，顯著提高了克氏原螯蝦對弗氏檸檬酸桿菌的抗性水平。FOYSAL M J等[64]探討在魚粉基礎飼料中添加丁酸梭菌對克氏原螯蝦生長、腸道菌群和免疫性能的影響，表明丁酸梭菌飼料可顯著降低克氏原螯蝦病原菌弧菌和氣單胞菌的豐度，調節(jié)了模擬弧菌誘導的免疫應答基因的表達水平。CHEN X等[44]分析池塘和稻蝦養(yǎng)殖模式下克氏原螯蝦腸道的基因信息，發(fā)現(xiàn)稻蝦養(yǎng)殖模式下與人類疾病和免疫相關的基因豐度降低，腸道菌群對養(yǎng)殖環(huán)境的變化更為敏感，一個可能的原因是水稻種植的復雜生態(tài)環(huán)境，以及食物中減少了配合飼料，影響了克氏原螯蝦消化道微生物的增殖。研究克氏原螯蝦腸道微生物菌群關系，以及在克氏原螯蝦生命活動中發(fā)揮的作用，調節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)，對克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)具有十分重要的意義。

目前，克氏原螯蝦腸道微生物的很多相關功能和作用機制還不清楚，隨著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展和不斷深入研究，克氏原螯蝦腸道微生物的功能研究將成為未來克氏原螯蝦研究的熱點。

5 結語

腸道微生物作為克氏原螯蝦的重要微生態(tài)“器官”，與克氏原螯蝦的健康息息相關，在長期的共同演化過程中，腸道微生物與克氏原螯蝦逐漸達到了動態(tài)平衡，在克氏原螯蝦的生命活動中發(fā)揮重要作用。弄清克氏原螯蝦腸道菌群結構，對于揭示克氏原螯蝦腸道微生物功能具有重要意義。然而，克氏原螯蝦腸道微生物受到克氏原螯蝦食物、生長環(huán)境、發(fā)育階段、性別乃至疾病等多種因素的影響。研究這些影響克氏原螯蝦腸道菌群改變的因素，通過調整這些影響因素，優(yōu)化克氏原螯蝦腸道菌群結構，改善克氏原螯蝦的健康狀況，具有較大的應用前景。