必需氨基酸調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的研究進(jìn)展

楊 靜 邢媛媛 孫 梅 李大彪

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018)

牛奶具有特殊的營(yíng)養(yǎng)特性,是人類飲食中必需營(yíng)養(yǎng)素的重要來(lái)源。乳蛋白作為乳中重要的營(yíng)養(yǎng)成分,能提供人體所需的必需氨基酸(essential amino acid,EAA),其含量的高低是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。乳蛋白的合成和分泌包括乳腺對(duì)氨基酸的攝取、乳蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、翻譯后蛋白質(zhì)的修飾以及最后分泌到乳汁中等一系列復(fù)雜的程序[1]。牛奶中90%以上的乳蛋白是由乳腺攝取血液中的游離氨基酸后從頭合成的,充足的氨基酸供給和平衡的氨基酸模式是提高乳蛋白合成的關(guān)鍵。然而,生產(chǎn)者為了提高乳蛋白含量,通常在飼糧中添加過(guò)量的氨基酸,過(guò)度的氨基酸供給不但提高了生產(chǎn)成本,而且造成了環(huán)境污染。因此,如何通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控使乳蛋白的合成和氨基酸的利用率達(dá)到優(yōu)化成為當(dāng)前動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)開(kāi)展了大量關(guān)于必需氨基酸(EAA)對(duì)乳蛋白合成影響的研究,得出EAA主要通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mechanistic target of rapamycin target protein complex 1,mTORC1)和一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2 kinase,GCN2)2條關(guān)鍵信號(hào)通路調(diào)控BMECs乳蛋白的合成[2]。mTORC1主要靠感受養(yǎng)分和生長(zhǎng)因子含量的波動(dòng)發(fā)揮作用,當(dāng)氨基酸水平充足時(shí)會(huì)激活mTORC1信號(hào)通路,進(jìn)而通過(guò)mTORC1的磷酸化調(diào)控乳蛋白的合成[3]。GCN2主要感受氨基酸缺乏,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸不足時(shí),空載tRNA的增加會(huì)激活GCN2,進(jìn)而引起真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)51位點(diǎn)的絲氨酸(Ser)磷酸化,使體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的合成降低[4]。本文主要綜述了國(guó)內(nèi)外關(guān)于蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)、支鏈氨基酸(branched chain amino acids,BCAAs)、精氨酸(Arg)和EAA平衡模式對(duì)BMECs乳蛋白合成的影響及其潛在的信號(hào)通路機(jī)制,旨在為深入研究BMECs乳蛋白合成機(jī)理和提高泌乳奶牛氨基酸轉(zhuǎn)化為乳蛋白的效率提供理論依據(jù)。

1 Met對(duì)BMECs乳蛋白合成的調(diào)控

Met作為含硫氨基酸,是所有動(dòng)物乳蛋白合成的EAA,也是奶牛的限制性氨基酸之一。有研究報(bào)道,當(dāng)培養(yǎng)基中Met濃度為0.52 mmol/L時(shí)可顯著提高BMECs中κ-酪蛋白3(CSN3)和αs1-酪蛋白(CSN1S1)的基因表達(dá)豐度[5-6]。飼糧中添加適量的Met可以提高奶牛乳蛋白產(chǎn)量[7],牛乳腺上皮細(xì)胞系(bovine mammary epithelial cell line,MAC-T)中缺乏Met會(huì)降低酪蛋白合成率[8]。趙艷麗等[6]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中Met濃度為0.78 mmol/L時(shí),CSN1S1和CSN3的基因表達(dá)受到抑制。此外,當(dāng)Met濃度為0.9和1.2 mmol/L時(shí),BMECs中酪蛋白表達(dá)下調(diào)[9]。這可能是因?yàn)檫^(guò)量的Met轉(zhuǎn)化為具有高度細(xì)胞毒性的同型半胱氨酸或甲硫基丙醛,進(jìn)而抑制乳蛋白的合成[10]。

Met可以通過(guò)調(diào)節(jié)BMECs的活力進(jìn)而影響酪蛋白的合成,提高乳腺上皮細(xì)胞的活力在一定程度上可以促進(jìn)乳蛋白的合成,而乳腺上皮細(xì)胞的凋亡則對(duì)乳蛋白的合成有一定的抑制作用。Duan等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Met濃度為0.6 mmol/L時(shí)BMECs的活力最高,同時(shí)β-酪蛋白的蛋白表達(dá)量達(dá)到最大,而當(dāng)Met濃度為1.2 mmol/L時(shí)BMECs活力下降,同時(shí)酪蛋白合成受到抑制。

Met除了作為乳蛋白合成的底物外,還可以通過(guò)激活乳蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)BMECs中酪蛋白的合成[12]。Jeon等[13]研究發(fā)現(xiàn),0.6 mmol/L Met作用MAC-T 72 h會(huì)通過(guò)提高mTOR的下游信號(hào)分子核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)的mRNA表達(dá)量來(lái)促進(jìn)β-酪蛋白合成。代文婷[14]研究發(fā)現(xiàn),與0.6 mmol/L Met組相比,無(wú)Met培養(yǎng)基通過(guò)激活GCN2信號(hào)通路抑制了BMECs酪蛋白的合成。

此外,Met可以調(diào)控氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(amino acid transporters,ATT)的表達(dá)進(jìn)而影響酪蛋白的合成[11,15]。Qi等[9]研究表明,在培養(yǎng)基中添加0.6 mmol/L Met可通過(guò)刺激鈉偶聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(sodium coupled neutral amino acid transporter 2,SNAT2)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路提高BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn),0.6 mmol/L Met可通過(guò)提高L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Ltype amino acid transporter,LAT1)和4F2重鏈(4F2 heavy chain,4F2hc)的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMECs中β-酪蛋白的合成,4F2hc是LAT1表達(dá)必需的一種細(xì)胞表面糖蛋白,用于LAT1的功能性表達(dá)和二聚體復(fù)合物的形成[11]。

2 Lys對(duì)BMECs乳蛋白合成的調(diào)控

Lys作為一種EAA,是飼喂玉米基礎(chǔ)飼糧的奶牛合成乳蛋白的主要限制性氨基酸[16]。BMECs中14C標(biāo)記的Lys代謝試驗(yàn)表明,90%左右的Lys用于蛋白質(zhì)合成,4%的Lys氧化生成二氧化碳,6%的Lys可以在乳腺中代謝分解,為非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)的生物合成提供氮源[17]。因此,Lys的充足供給是保證乳蛋白產(chǎn)量的必要條件。Awawdeh[7]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)瘤胃賴氨酸(rumen-protected Lys,RPL)可顯著提高荷斯坦奶牛乳蛋白含量。還有研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加1 mmol/L Lys可通過(guò)促進(jìn)BMECs中蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)進(jìn)而提高乳蛋白的合成[17]。

除了作為乳蛋白合成的底物,Lys也是影響乳蛋白合成的關(guān)鍵細(xì)胞因子,能夠通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路調(diào)控BMECs乳蛋白合成[18]。高海娜等[19]研究發(fā)現(xiàn),0.5和2.0 mmol/L Lys 顯著促進(jìn)了BMECs中CSN1S1和CSN2的基因表達(dá),同時(shí)提高了mTOR信號(hào)通路中mTOR和S6K1的基因表達(dá)量。此外,有研究表明0.7 mmol/L Lys可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性促進(jìn)細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)的表達(dá),進(jìn)而激活BMECs中mTOR信號(hào)通路促進(jìn)β-酪蛋白合成[18]。畢微微[20]研究發(fā)現(xiàn),添加100 μg/mL Lys-Lys二肽上調(diào)了BMECs內(nèi)mTOR信號(hào)通路中與乳蛋白翻譯相關(guān)的mTOR和S6K1的基因表達(dá),但下調(diào)了真核細(xì)胞翻譯啟始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1,4EBP1)的基因表達(dá)。

此外,Lys還能調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞ATT的表達(dá),ATT可以感知胞內(nèi)氨基酸水平的變化,介導(dǎo)氨基酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活,進(jìn)一步調(diào)控乳蛋白的合成。以BMECs為模型的體外研究發(fā)現(xiàn),1.0 mmol/LL-Lys不僅可提高鈉離子(Na+)和氯離子(Cl-)依賴性的中性 B0,+氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(B0,+amino acid transporter,ATB0,+)的基因和蛋白表達(dá)量,還可上調(diào)mTOR和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化水平,進(jìn)而激活mTOR和Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/STAT5信號(hào)通路,提高BMECs中β-酪蛋白的合成[17]。

3 BCAAs對(duì)BMECs乳蛋白合成的調(diào)控

BCAAs包括亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val),占奶牛乳腺總氨基酸供給量的40%左右,其對(duì)奶牛乳腺乳蛋白的合成具有重要調(diào)節(jié)作用[21-22]。Kim等[23]在BMECs中添加0.6 mmol/L Val促進(jìn)了BMECs中β-酪蛋白的合成。董賢文[24]研究發(fā)現(xiàn),提高M(jìn)AC-T中Ile的供給量可以促進(jìn)α-s1酪蛋白的基因表達(dá)。作為乳蛋白合成的底物,適量添加BCAAs可以改善細(xì)胞環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)水平,過(guò)量則會(huì)造成氨基酸之間的拮抗與不平衡[21]。Qiu等[25]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Leu濃度低于0.75 mmol/L時(shí),它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、β-酪蛋白和α-酪蛋白的合成,且呈劑量依賴性。當(dāng)Leu濃度逐漸升高(>0.75 mmol/L)時(shí),Leu對(duì)乳蛋白合成的刺激作用逐漸減弱。同時(shí),Ile也有相似的試驗(yàn)結(jié)果,王哲[26]研究發(fā)現(xiàn),高濃度(1.0和1.25 mmol/L)的Ile對(duì)乳蛋白合成有抑制作用。

除了作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外,BCAAs可以通過(guò)特定的信號(hào)通路調(diào)節(jié)BMECs乳蛋白合成,特別是PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/mTOR信號(hào)通路[27-28]。Leu可以獨(dú)立調(diào)節(jié)牛乳腺組織 mTOR信號(hào)通路和蛋白質(zhì)合成[29]。Zhao等[30]研究表明,在BMECs中添加1.8 mmol/L Leu通過(guò)上調(diào)mTOR、4EBP1和S6K1的蛋白表達(dá)及磷酸化水平,進(jìn)而促進(jìn)了CSN1S1、CSN2和CSN3的基因表達(dá)以及酪蛋白合成。Dong等[31]將Val濃度從142 μg/mL增加到156 μg/mL促進(jìn)了BMECs乳蛋白的合成,這與AKT、S6K1和mTORC1的磷酸化水平提高有關(guān)。與此相反,BCAAs缺乏會(huì)通過(guò)抑制單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 50-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/mTOR信號(hào)通路降低BMECs中酪蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯[32]。Doelman等[33]研究發(fā)現(xiàn),BCAAs缺乏會(huì)促進(jìn)eIF2Bε和eIF2α的表達(dá)從而抑制mTOR的活性,引起奶牛乳腺中酪蛋白合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)和酪蛋白含量的降低。

4 Arg對(duì)BMECs乳蛋白合成的調(diào)控

Arg作為一種功能性氨基酸,其不僅是蛋白質(zhì)合成的前體物質(zhì),在動(dòng)物乳腺中還可以通過(guò)Arg代謝途徑調(diào)控乳蛋白的合成。Arg在乳腺細(xì)胞中通過(guò)精氨酸-鳥(niǎo)氨酸代謝途徑調(diào)控細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)以及合成[34]。有研究表明,泌乳期荷斯坦奶牛乳蛋白合成的增加可能是因?yàn)槿橄俳M織中精氨酸酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性顯著上調(diào)以及多胺類物質(zhì)生成增多引起的[35]。精氨酸-鳥(niǎo)氨酸-多胺是調(diào)控酪蛋白合成的關(guān)鍵代謝通路,丁洛陽(yáng)[36]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), BMECs中精氨酸-鳥(niǎo)氨酸-多胺代謝通路受到抑制后,BMECs的增殖和細(xì)胞中酪蛋白合成同時(shí)受到顯著抑制。

Arg還可以通過(guò)提高S6K1和4EBP1等信號(hào)分子的磷酸化水平進(jìn)而激活mTOR信號(hào)通路調(diào)控奶牛乳蛋白合成。曹越等[37]研究發(fā)現(xiàn),2.80 mmol/L Arg通過(guò)上調(diào)mTOR 信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子AKT、mTOR、S6K1和4EBP1的基因表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)BMECs中CSN1S1和CSN3的mRNA表達(dá)以及αs1-酪蛋白蛋白表達(dá)。此外,Arg濃度為556 mg/L時(shí)可通過(guò)激活JAK2/STAT5和mTOR信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)CSN1S1、CSN2和CSN3的基因表達(dá)和酪蛋白合成[38]。然而,Hu等[39]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)BMECs中Arg濃度為175 μg/mL時(shí)會(huì)抑制AMPK/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而降低α-酪蛋白的蛋白表達(dá)。Arg還能通過(guò)調(diào)控microRNA (miRNA)的表達(dá)進(jìn)而影響酪蛋白合成,Zhang等[40]通過(guò)體外BMECs培養(yǎng)和體內(nèi)灌注試驗(yàn)得出,Arg可以通過(guò)上調(diào)miR-743a和miR-712的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)酪蛋白的合成。

5 EAA平衡模式對(duì)BMECs中乳蛋白合成的調(diào)控

合成乳蛋白所需的氨基酸大部分來(lái)自于血液,但乳腺對(duì)氨基酸的攝取率相對(duì)較低,只有動(dòng)脈中氨基酸總量的22%[41]。在生產(chǎn)實(shí)踐中,為了提高乳蛋白含量通常會(huì)在飼糧中添加過(guò)量的氨基酸,但這會(huì)導(dǎo)致成本增加以及環(huán)境污染[42]。

據(jù)報(bào)道,飼糧中添加適宜比例的Met和Lys可顯著提高粗蛋白質(zhì)利用率和產(chǎn)奶量[43]。Nan等[5]研究發(fā)現(xiàn),Lys∶Met為2.9∶1.0是促進(jìn)體外培養(yǎng)的BMECs酪蛋白表達(dá)的最佳比例。Lys與其他氨基酸的比例也會(huì)影響B(tài)MECs乳蛋白的合成。Gao等[44]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Lys、His、Met和Leu的比例為6∶5∶1∶7時(shí)可以顯著促進(jìn)BMECs中酪蛋白的合成。然而,提高M(jìn)et供給量,使Lys與Met比例不平衡時(shí)會(huì)抑制BMECs中酪蛋白合成[45]。因此,與增加飼糧中EAA的絕對(duì)含量相比,適宜的氨基酸比例是提高乳蛋白含量的更可行方式[46]。

一方面,平衡的EAA模式可以激活mTOR信號(hào)通路并提高其下游信號(hào)分子的蛋白表達(dá)和磷酸化水平促進(jìn)BMECs中β-酪蛋白合成[44]。Nan等[5]研究表明,Lys和Met處于平衡模式時(shí)通過(guò)提高mTORC1的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)以及磷酸化水平進(jìn)而促進(jìn)BMECs中酪蛋白合成。然而,提高M(jìn)et供給量,使Lys和Met的比例失衡會(huì)抑制BMECs中β-酪蛋白合成,mTORC1和AMPK的蛋白表達(dá)和磷酸化水平也相應(yīng)降低[39,45]。同時(shí),EAA還會(huì)通過(guò)GCN2信號(hào)通路調(diào)控乳蛋白合成。Edick等[47]研究發(fā)現(xiàn),在Arg、Leu和Lys缺乏的EAA失衡培養(yǎng)基中GCN2被激活,進(jìn)而引起eIF2α的磷酸化,磷酸化的eIF2α?xí)种苖RNA的翻譯,最終導(dǎo)致BMECs中乳蛋白的合成量顯著降低。

另一方面,平衡的EAA模式還可通過(guò)增加乳腺對(duì)氨基酸的攝取和ATT的表達(dá)來(lái)提高乳蛋白產(chǎn)量[48-49]。Dong等[45]研究發(fā)現(xiàn),EAA比例失衡時(shí)會(huì)降低乳腺對(duì)EAA的攝取,下調(diào)編碼SNAT2的基因溶質(zhì)載體家族38成員2(SLC38A2)的表達(dá)進(jìn)而抑制BMECs中β-酪蛋白合成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Lys和Met比例平衡時(shí),提高蘇氨酸(Thr)、Ile、Val、和 Leu的濃度會(huì)提高編碼4F2hc的基因溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMECs中β-酪蛋白和αs1-酪蛋白合成[31]。

6 小 結(jié)

BMECs是乳腺合成乳蛋白的基本功能單位,乳蛋白的合成是一個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程。EAA作為重要的乳成分前體物,其不僅是乳蛋白合成的重要底物,還可以作為信號(hào)分子調(diào)控乳蛋白合成。目前,在EAA調(diào)控BMECs內(nèi)乳蛋白合成方面的研究已取得一些進(jìn)展,我們已知EAA一方面可以作為底物影響乳蛋白合成,另一方面還能作為細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)通過(guò)影響細(xì)胞增殖、mTORC1、GCN2相關(guān)信號(hào)通路、ATT表達(dá)以及miRNA表達(dá)來(lái)調(diào)控BMECs中乳蛋白合成。然而,由于多種EAA之間存在協(xié)同或拮抗作用,對(duì)于EAA調(diào)控BMECs內(nèi)乳蛋白合成的復(fù)雜機(jī)制我們還知之甚少,仍需要結(jié)合現(xiàn)代生物分子學(xué)技術(shù),依靠代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)手段從吸收代謝、基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能蛋白活性等層面進(jìn)行深入研究。隨著對(duì)氨基酸調(diào)控BMECs乳蛋白合成調(diào)控機(jī)制的深入了解,將有助于奶牛氨基酸精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)的實(shí)施,為進(jìn)一步優(yōu)化泌乳奶牛飼糧氨基酸供給模式及降低生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)。