CAFs聯(lián)合LVD對早期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值*

黃曉嵐,魏文斐,陳曉靜,王梓慈,郭楚鴻,陳佩玉,王 薇

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣州 510120;2.珠海市人民醫(yī)院,珠海 519000)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph node metastasis,LNM)是宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)的主要轉(zhuǎn)移途徑,是影響臨床治療與預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2018年宮頸癌FIGO指南將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影像學(xué)和病理學(xué)檢查納入臨床分期標(biāo)準(zhǔn)并指導(dǎo)臨床治療[1]。術(shù)前影像學(xué)檢查可評估淋巴結(jié)受累情況,但具有難以發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶及鑒別良惡性淋巴結(jié)、敏感度與特異性差異較大等局限性[2]。目前尚無可靠的工具及綜合性判斷指標(biāo)可精確預(yù)測CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)在癌癥進(jìn)展和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中具有重要作用,其中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cells,LECs)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞 (cancer-associated fibroblasts,CAFs)是TME中的重要組成成分。淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD)及CAFs浸潤的增加與腫瘤惡性侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),并在某些研究中被當(dāng)作一些實(shí)體腫瘤預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)[3-4]。然而,關(guān)于CSCC中CAFs和LVD之間的關(guān)系及其在預(yù)測LNM的作用研究較少,兩者對LNM的預(yù)測價(jià)值還需進(jìn)一步研討。本研究通過回顧分析早期CSCC中CAFs密度和LVD單獨(dú)及聯(lián)合檢測在預(yù)測LNM中的應(yīng)用價(jià)值,并探討術(shù)前檢測活檢標(biāo)本病理標(biāo)志物對LNM預(yù)測的可行性,以期在術(shù)前輔助影像學(xué)檢查,更好地評估及預(yù)測早期CSCC淋巴結(jié)狀態(tài),為個(gè)體化治療方案的建立提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年至2017年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的132例行根治性子宮切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)的Ⅰb1～Ⅱa2期(2009年FIGO分期)CSCC患者,石蠟包埋組織標(biāo)本包括92例手術(shù)切除標(biāo)本(32例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,60例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)及40例活檢組織標(biāo)本(10例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,30例不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移),同時(shí)收集與整理相關(guān)臨床病理資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),并符合《赫爾辛基原則宣言》所規(guī)定的原則,標(biāo)本采集均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 抗α-SMA抗體(Abcam公司,ab5694),抗D2-40抗體(ZM-0465)、Tris/EDTA修復(fù)液(pH=9.0)、抗小鼠/兔HRP聚合物檢測試劑盒(PV-6000)、DAB顯色試劑(北京中杉金橋),PBS、枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液粉劑(廣州鼎國);四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(Opal 4-color IHC Kit)(Perkin Elmer公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化檢測 石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟水化、高壓抗原修復(fù)(α-SMA采用枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0,D2-40采用EDTA pH 9.0),3% H2O2室溫孵育15min,山羊血清室溫封閉30min。棄羊血清,一抗(anti α-SMA,1∶800;D2-40工作液)4℃孵育過夜。PBS緩沖液清洗,相應(yīng)二抗37℃孵育30min。DAB鏡下顯色、蘇木素染核、常規(guī)脫水、透明,干燥后中性樹脂膠封片。光學(xué)顯微鏡采集照片。所有染色切片均由兩位不了解患者臨床狀況的病理學(xué)家獨(dú)立評估。

1.3.2 多重免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)、山羊血清封閉條件同免疫組化步驟,一抗(D2-40工作液)37℃孵育1h,相應(yīng)二抗37℃孵育10min,避光室溫孵育Opal熒光素(Opal520)10min,避光重復(fù)抗原修復(fù),一抗(anti α-SMA,1:800)避光37℃孵育1h,二抗避光37℃孵育10min,避光室溫孵育Opal熒光素(Opal570)10min,DAPI避光染核5min,抗熒光淬滅劑封片。正置激光共聚焦顯微鏡(LSM 880)采集照片。

1.4 免疫組化結(jié)果的判定

1.4.1 CAFs判定 光學(xué)顯微鏡于低倍鏡(×40)下觀察免疫組化染色切片,α-SMA(CAFs標(biāo)志物)陽性表達(dá)位于間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì),呈棕黃色顆粒,選取陽性表達(dá)細(xì)胞的密集區(qū)域,即“熱區(qū)”,在高倍鏡(high power lens,HP)(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野,使用Image J軟件(版本1.4.3.67)對陽性染色面積百分比進(jìn)行測量,每個(gè)視野取3次測量平均值,最終得到每例患者的CAFs密度值(α-SMA%)(不包括血管)[5]。根據(jù)中位數(shù)對所有樣本進(jìn)行分組:大于或等于中位數(shù)(18.65%/400×)者為CAFs高密度組(CAFs高),小于中位數(shù)者為CAFs低密度組(CAFs低)。

1.4.2 LVD判定 低倍鏡(×40,×100)下觀察免疫組化染色切片,D2-40陽性表達(dá)位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜,呈棕黃色顆粒。陽性細(xì)胞圍成的腔隙為淋巴管,低倍鏡下選取“熱區(qū)”,再于高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野,計(jì)數(shù)各視野中淋巴管數(shù),取其平均數(shù),最終得到每例患者的LVD值(個(gè)/HP)。對所有樣本進(jìn)行分組:大于或等于中位數(shù)者(7.35個(gè)/200×)為高密度組(LVD高),小于中位數(shù)者為低密度組(LVD低)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件(IBM公司)分析數(shù)據(jù),Graphpad Prism 8.3.0繪圖。Kolmogorov-Smirnov單樣本檢驗(yàn)法驗(yàn)證正態(tài)分布;呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25,P75)表示;采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組間結(jié)果的差異;Spearman相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性;應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析組間差異;logistic回歸分析建立logistic回歸模型,ROC曲線的曲線下面積(area under curve,AUC)評價(jià)各指標(biāo)的診斷效能。α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05(雙尾)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CSCC中α-SMA和D2-40表達(dá)分布及CAFs密度與LVD的相關(guān)性 多重免疫熒光染色結(jié)果顯示,α-SMA+CAFs密度高的組織中D2-40+淋巴管數(shù)量增多(圖1)。根據(jù)中位數(shù)分組代表性圖見圖1。免疫組化結(jié)果顯示,LVD高組的CAFs密度顯著高于LVD低組(χ2=19.183,P=0.000) (表1),CAFs密度與LVD呈正相關(guān)(Spearman's rho=0.597,P<0.001)(圖2E)。

圖1 CAFs和淋巴管的多重免疫熒光染色和分組代表性圖(×200,×400)早期CSCC手術(shù)標(biāo)本組織中α-SMA+CAFs(紅色)、D2-40+LVs(綠色)、細(xì)胞核(藍(lán)色)的多重免疫熒光染色,白色箭頭代表圍成腔隙的淋巴管。CAFs高/LVD高:α-SMA+CAFs≥18.65%/400×,D2-40+LVs≥7.35個(gè)/200×;CAFs低/LVD低:α-SMA+CAFs<18.65%/400×,D2-40+LVs<7.35個(gè)/200×

表1 CAFs密度和LVD的相關(guān)性 (Pearson's χ2 test)

2.2 CAFs密度或LVD在早期CSCC不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)分析 免疫組化染色切片(圖2A)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(圖2C、D)結(jié)果顯示,LNM組中CAFs密度與LVD高于non-LNM組(P<0.001)。

2.3 CAFs密度與LVD作為單一因素和聯(lián)合因素在早期CSCC組織中臨床病理參數(shù)分析 Fisher檢驗(yàn)結(jié)果顯示,早期CSCC組織中,CAFs密度和LVD均與LNM、淋巴脈管浸潤(lymphovascular invasion,LVI)(P<0.05)密切相關(guān),而與年齡、FIGO分期、腫瘤直徑、分化程度無顯著相關(guān)(P>0.05)(表2)。CAFs與LVD聯(lián)合表達(dá)水平與LNM(P=0.000)及LVI(P=0.004)顯著相關(guān),而與年齡、FIGO分期、腫瘤直徑及分化程度無關(guān)(P>0.05)(表3)。高表達(dá)和低表達(dá)CAFs的LNM率分別為 63.04%(29/46)、6.52%(3/46);高表達(dá)和低表達(dá)LVD的LNM率分別為59.57%(28/47)、8.89%(4/45),兩者同時(shí)高表達(dá)的LNM率為76.47%(26/34),同時(shí)低表達(dá)為3.03%(1/33)。單獨(dú)檢測CAFs密度、LVD以及聯(lián)合檢測的陽性預(yù)測值(PPV)分別為63.04%、59.57%、76.47%,陰性預(yù)測值(NPV)分別為93.48%、91.11%、96.97%。

表2 92例早期CSCC患者CAFs密度和LVD與臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

表3 CAFs聯(lián)合LVD與臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

2.4 單獨(dú)或聯(lián)合檢測早期CSCC組織中CAFs密度和LVD對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值 以LNM為因變量,CAFs密度、LVD為自變量,建立logistic回歸方程(表4)。ROC曲線(圖3)結(jié)果顯示,CAFs密度和LVD的cut-off值分別為19.81%/400×和9.12/200×?xí)r,“CAFs+LVD”聯(lián)合檢測方案的AUC(0.958)均大于單獨(dú)檢測CAFs密度(0.926)和LVD(0.904)的AUC,且具有最佳準(zhǔn)確性(90.22%)(表4)。40例早期CSCC患者的活檢標(biāo)本檢測結(jié)果顯示,CAFs密度與LVD呈正相關(guān)(Spearman's rho= 0.487,P<0.001)(圖2H),LNM組中CAFs密度與LVD均高于non-LNM組(P<0.001)(圖2F、G)。以根治術(shù)后的病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn),CAFs密度≥19.81%/400×、LVD≥9.12/200×(cut-off值)為陽性,小于cut-off值為陰性,CAFs密度與LVD聯(lián)合檢測中任一項(xiàng)為陽性即視為檢測陽性,二者均為陰性視為檢測陰性。以cut-off值診斷40例患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為9例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為1例,檢出率為90.0%(9/10),宮頸活檢標(biāo)本的預(yù)測與術(shù)后病理診斷LNM的總符合率為97.5%(39/40),兩法一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.931(表5)。

圖3 單獨(dú)或聯(lián)合檢測患者CAFs、LVD的ROC曲線

表4 聯(lián)合各參數(shù)對早期CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能比較

表5 活檢標(biāo)本預(yù)測與術(shù)后病理診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的總符合率

3 討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸鱗癌復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一。早期宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約為13.9%～38.1%,近2/3的患者可能因過度切除淋巴結(jié)而引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥[6-7]。此外,目前研究中并沒有足夠的證據(jù)支持,接受了根治術(shù)后的患者完成輔助同步放化療后進(jìn)行額外的化療能明顯改善生存預(yù)后[8]。FIGO 2018宮頸癌分期指南中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影像學(xué)及病理學(xué)檢查結(jié)果對臨床分期和主要治療方案的決策具有重要參考意義[1]。然而,在選擇接受手術(shù)的臨床分期Ⅰb1和Ⅰb2的患者中,FDG-PET檢測鱗癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性比腺癌幾乎高出一半,但總體敏感性仍低于50%[9]。即使影像學(xué)檢查對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測具有較高的特異性,但較高的假陰性率使影像學(xué)陰性的高?；颊卟荒芡耆懦[匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致部分患者無法接受充分治療[10-11]。因此,若能在術(shù)前精確評估淋巴結(jié)狀態(tài),或能改善患者生存質(zhì)量。

淋巴管基膜不連續(xù)、通透性大等結(jié)構(gòu)特征與淋巴管的重塑易使組織液中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入毛細(xì)淋巴管[12]。LVD作為評估淋巴管生成情況的重要指標(biāo),有助于評估口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及腫瘤預(yù)后[4,13-14]。盛圓等[15]研究報(bào)道,LVD預(yù)測早期胃癌LNM的AUC值為0.835(95%CI為0.758～0.912),其cut-off值為14個(gè)/200×,敏感度與特異度分別為63.40%、90.0%。本研究發(fā)現(xiàn),LVD與早期CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LVI顯著相關(guān),且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中LVD更高。ROC曲線顯示,LVD單獨(dú)檢測的AUC為0.904,cut-off值為9.12個(gè)/200×,敏感度、特異度和準(zhǔn)確性分別為71.90%、98.30%和88.04%,提示LVD對早期CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有良好的預(yù)測價(jià)值。

盡管已有研究評估了LVD在宮頸癌中的重要性,但對于預(yù)測宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的意義尚存爭議。Gombos等研究提出,LVD的增加與早期宮頸鱗癌的侵襲行為及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.0095),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤周LVD中位數(shù)達(dá)10個(gè)[16]。而Tantari等評估了早期宮頸癌(包括腺癌與鱗癌)中淋巴管生成和增殖的標(biāo)記物(Ki67、D2-40、CD31和VEGF-C),結(jié)果顯示這些標(biāo)志物均不能預(yù)測盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.43)或腫瘤復(fù)發(fā)(P=1.00),因此強(qiáng)調(diào),早期宮頸癌的淋巴管擴(kuò)散與腫瘤周圍預(yù)先存在的淋巴管相關(guān)而不需新增的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[17]。關(guān)于腫瘤周圍淋巴管在腫瘤進(jìn)展中作用的矛盾結(jié)果可能是由于患者的選擇、方法學(xué)中標(biāo)記物的選擇和(或)分析中包括的腫瘤類型的差異[14]。這可能反映了腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的機(jī)制,在不同類型或解剖位置的腫瘤中可能有顯著差異?？紤]到腺癌與鱗癌有著不同的生物學(xué)行為特征,本研究關(guān)注于宮頸鱗癌的TME對腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響,以尋找可靠的聯(lián)合預(yù)測因子。淋巴管的生成與重塑受到TME中多種細(xì)胞因子、趨化因子、機(jī)械刺激等因素的調(diào)節(jié)[18-19]。CAFs作為TME中的主要基質(zhì)成分,能分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子重塑細(xì)胞外基質(zhì),在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的同時(shí)還參與淋巴管的調(diào)節(jié),在膽管癌、頭頸癌的研究中發(fā)現(xiàn),CAFs能誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)淋巴管生成增加和淋巴管內(nèi)皮屏障受損,并且CAFs浸潤豐度增多與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20-21]。CAFs能通過破壞淋巴內(nèi)皮的完整性以促進(jìn)CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[22]。本研究中,CAFs密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和LVI顯著相關(guān),進(jìn)一步提示宮頸鱗癌中CAFs可能通過聯(lián)合腫瘤新生淋巴管共同調(diào)控淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)程。

目前關(guān)于CAFs與LVD預(yù)測CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究尚少,也因缺乏統(tǒng)一評判標(biāo)準(zhǔn),兩者與CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尚未明確。據(jù)Chen等報(bào)道,肺腺癌中CAFs密度與LVD增加密切相關(guān)(χ2=16.355,P=0.000),CAFs密度和LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),均可作為預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)[23]。本研究同樣證實(shí)了CAFs密度與LVD呈正相關(guān)(Spearman's rho=0.597,P<0.001),二者聯(lián)合表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.000)。此外,ROC曲線聯(lián)合分析結(jié)果表明,相較于單一檢測,CAFs密度、LVD的聯(lián)合檢測在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷中有更好的預(yù)測效果。

目前預(yù)測腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究多基于影像組學(xué)特征、血清或術(shù)后標(biāo)本腫瘤標(biāo)志物(如SCC-Ag、p16等)與臨床病理特征的結(jié)合,對宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷有一定的價(jià)值,但尚存在較高的假陽性率和假陰性率,其準(zhǔn)確性仍需大樣本數(shù)據(jù)證實(shí)。本研究除了結(jié)合手術(shù)標(biāo)本的生物標(biāo)志物和臨床病理特征進(jìn)行分析,還探討了術(shù)前活檢標(biāo)本對于預(yù)測隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可行性。既往由于缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、組織取樣不足等因素,研究者們利用活檢組織進(jìn)行臨床診斷具有一定的局限性。然而,越來越多的研究在探索活檢標(biāo)本對疾病診斷及預(yù)后價(jià)值等方面得到意想不到的結(jié)果。Rivera-Colon等及于靜等研究認(rèn)為,宮頸活檢組織的腫瘤病理學(xué)特征有助于預(yù)測腫瘤淋巴浸潤和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[24-25]。一項(xiàng)多中心研究中,Wang等對794例宮頸腺癌標(biāo)本進(jìn)行腫瘤細(xì)胞核分級(TNG)與壞死腫瘤碎片(NTD)的觀察,TNG與NTD的預(yù)測敏感性可達(dá)82%及89%,特異性分別為89.5%、71.5% ,這或許能在活檢階段識(shí)別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)患者,有利于實(shí)施個(gè)性化、侵略性更小的治療[26]。本研究回顧分析早期CSCC患者宮頸活檢標(biāo)本中CAFs密度與LVD的情況,利用ROC曲線cut-off值判斷LNM與術(shù)后病理診斷LNM的總符合率達(dá)97.5%,診出率為90%,漏診率為10%,表明術(shù)前活檢標(biāo)本中CAFs密度和LVD聯(lián)合檢測對早期CSCC患者LNM具有一定的評估價(jià)值。

綜上所述,α-SMA+CAFs和D2-40+LVs表達(dá)水平與早期CSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),聯(lián)合檢測CAFs密度及LVD可能有助于提高術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢出率,為患者個(gè)體化治療方案的建立提供參考依據(jù),從而改善患者臨床預(yù)后。