高錳酸鉀脫色法在惡性黑色素瘤HE 染色和免疫組化染色中的應(yīng)用

劉鑫鵬，顧安康，李鵬，賈文娟，王紫陽(yáng)，張理濤

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）是一種有免疫原性的由黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展受到多種因素影響。MM 在皮膚癌癥中所占比例雖然不足5%，但是在皮膚腫瘤相關(guān)死亡病例中所占比例高達(dá)80%[1]。在病理科的日常工作中，MM 由于黑色素顆粒的存在，致使HE 染色和免疫組化標(biāo)記時(shí)，正常的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)被遮蓋，同時(shí)由于黑色素顆粒在切片中顯示為淺黃色至棕黑色，與免疫組化DAB 顯色劑顯色后顏色相近，若不進(jìn)行脫色素處理，容易對(duì)切片的判讀產(chǎn)生影響，因此在染色前進(jìn)行脫色素處理是一個(gè)必要的措施。本文探討不同濃度高錳酸鉀脫色法在染色中的應(yīng)用價(jià)值，以篩選更適合的脫色素濃度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004—2013 年期間天津市腫瘤醫(yī)院病理科8 例明確診斷為MM 患者的皮膚組織標(biāo)本。所有組織均經(jīng)過(guò)10%中性甲醛固定并包埋成蠟塊，每個(gè)蠟塊連續(xù)切片10 張撈至黏附載玻片，厚度為4 μm，70 ℃烤箱1.5 h 備用。

1.2 主要試劑 0.10%、0.25%及0.50%高錳酸鉀溶液（將0.2 g、0.5 g 及1.0 g 高錳酸鉀粉末分別溶于200 mL 蒸餾水中配制成，天津市化學(xué)試劑一廠），2%草酸水溶液（將4 g 草酸粉末溶于200 mL 蒸餾水中配制成，天津市化學(xué)試劑一廠），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），蘇木素[福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]，伊紅（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），EDTA修復(fù)液（pH8.0，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），S-100 一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），通用型酶標(biāo)二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB 顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 脫色素方法 切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗，入PBS 平衡5 min×2 后取出分為3 組。①分別浸入0.10%、0.25%、0.50%高錳酸鉀溶液中，10 min后取出2%草酸漂白30 s 并觀察，3 組切片色素依然存在，但殘留色素隨著高錳酸鉀溶液濃度的增加而減少。②將所有切片再分別浸入高錳酸鉀溶液中10 min 后2%草酸漂白30 s 并觀察，發(fā)現(xiàn)0.25%和0.50%濃度組色素完全消失，而0.10%濃度組中的色素除組織本身色素較少的完全消失外，色素仍有部分殘留，見(jiàn)圖1。③取出所有切片，流水沖洗1 min至蒸餾水，入PBS 平衡5 min×2，后續(xù)分別行HE 染色和免疫組化染色。

圖1 色素多與色素少標(biāo)本切片經(jīng)不同濃度高錳酸鉀溶液脫色20 min 后對(duì)照

1.3.2 HE 染色 所有蠟塊各4 張切片常規(guī)脫蠟至水，①選取其中一張切片，不行脫色素處理，直接常規(guī)HE 染色；②選取另外3 張切片，分別以不同濃度高錳酸鉀溶液進(jìn)行脫色素處理，后續(xù)同常規(guī)HE 染色步驟。

1.3.3 免疫組化染色 為進(jìn)一步探討脫色素處理在免疫組化方面的應(yīng)用價(jià)值，將切片常規(guī)脫蠟至水，①選取其中一張切片，不行脫色素處理，直接常規(guī)免疫組化染色，以做對(duì)照；②選取另外3 張切片，先進(jìn)行抗原修復(fù)，再分別以不同濃度高錳酸鉀溶液進(jìn)行脫色素處理，后續(xù)同常規(guī)免疫組化染色步驟。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果 對(duì)未進(jìn)行脫色素處理的切片行常規(guī)HE 染色，鏡下顯示有大量棕黑色色素沉積，見(jiàn)圖2。經(jīng)不同濃度脫色素處理的切片亦行HE 染色，鏡下顯示0.25%和0.50%濃度組黑色素均消失，0.10%濃度組還有殘留部分黑色素顆粒。但0.50%濃度組在染色的過(guò)程中，切片或發(fā)生組織周邊卷曲翹起或發(fā)生嚴(yán)重脫片，致使無(wú)法對(duì)切片進(jìn)行準(zhǔn)確判讀。0.25%濃度組染色后切片的組織結(jié)構(gòu)清晰完整、無(wú)脫片或卷曲現(xiàn)象出現(xiàn)，視野干凈無(wú)黑色素顆粒，見(jiàn)圖3。

圖2 未脫色素切片（HE 染色×100）

圖3 脫色素后切片（HE 染色×100）

2.2 免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果與常規(guī)HE 染色結(jié)果有相似性。觀察未進(jìn)行脫色素處理的免疫組化切片，發(fā)現(xiàn)有棕黃色或棕黑色色素顆粒沉積，見(jiàn)圖4，對(duì)正確判讀結(jié)果有一定的影響。而經(jīng)過(guò)脫色素處理的切片中：①0.50%濃度組在進(jìn)行免疫組化的過(guò)程中即出現(xiàn)嚴(yán)重脫片或卷曲現(xiàn)象，甚至部分組織無(wú)法后續(xù)操作，無(wú)法進(jìn)行判讀；②0.25%組幾乎未出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，陽(yáng)性定位基本準(zhǔn)確，脫色效果尚可，見(jiàn)圖5、表1；③0.10%濃度組因色素較多組織中殘留部分黑色素顆粒，可能會(huì)影響結(jié)果的判讀，從而造成假陽(yáng)性。

表1 不同濃度高錳酸鉀溶液脫色素結(jié)果對(duì)比

圖4 未脫色素切片（S-100 染色×40）

圖5 脫色素后切片（S-100 染色×40）

3 討論

黑色素顆粒存在于MM 中，顏色可由淺黃色至棕黑色，且不易去除，對(duì)其常規(guī)處理HE 染色或者免疫組化染色后，依然存在于組織中，會(huì)對(duì)病理診斷產(chǎn)生影響。黑色素有強(qiáng)還原性，可以與強(qiáng)氧化劑高錳酸鉀反應(yīng)，達(dá)到脫色的目的[2]。較好的脫色素法應(yīng)兼具脫色后保持組織本身完整的組織細(xì)胞形態(tài)、脫色素完全、不影響抗原抗體的結(jié)合。截止目前，既往報(bào)道的脫色素方法很多，諸如：高錳酸鉀脫色法[3-4]、酸化高錳酸鉀法[5]、過(guò)氧化氫法[6-7]、雙重氧化法[8]等，但是在病理科的平時(shí)工作中，較為常用的方法依然是高錳酸鉀脫色法，此法優(yōu)點(diǎn)在于相對(duì)于過(guò)氧化氫法較快速，相對(duì)于酸化高錳酸鉀法更溫和。

從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看，0.25%高錳酸鉀溶液脫色素總體效果優(yōu)于0.10%濃度組和0.50%濃度組，相對(duì)0.50%濃度組更加溫和，不易出現(xiàn)脫片，能獲得結(jié)構(gòu)完整無(wú)色素顆粒的切片。但是，與既往報(bào)道相比，本研究還發(fā)現(xiàn)0.10%濃度組在脫色素的過(guò)程中，如果組織標(biāo)本本身含有的色素較少，此濃度在20 min 終止脫色時(shí)，也可以達(dá)到使色素完全脫去的目的，同時(shí)因?yàn)樗脻舛冉档?，也可能?huì)減少?gòu)?qiáng)氧化劑對(duì)抗原的影響[3-4]。

S-100 在正常的黑色素細(xì)胞、神經(jīng)鞘細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞，以及這些細(xì)胞來(lái)源的腫瘤均可陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)也是MM十分敏感的標(biāo)志物，陽(yáng)性率可達(dá)95%以上，在病理診斷中為經(jīng)常使用的抗體之一[9]。本研究利用不同濃度對(duì)切片脫色素并行S-100 免疫組化染色，0.25%濃度組可以獲得組織完整結(jié)構(gòu)清晰的切片，并且免疫組化定位基本準(zhǔn)確，對(duì)抗原幾乎無(wú)影響。而0.50%濃度組會(huì)出現(xiàn)卷曲或嚴(yán)重脫片現(xiàn)象，0.10%濃度組可能會(huì)含有未脫凈的黑色素顆粒，從而影響判讀。

綜上所述，0.25%高錳酸鉀脫色法適用于大部分含有黑色素的組織切片，若組織標(biāo)本本身含有的色素較少且顏色較淺，也可選用0.10%高錳酸鉀溶液進(jìn)行氧化處理。