美白祛斑精華液體外活性及人體功效評價研究

劉俊杰，史曉璇，王艷，王蘭，楊珍，張秀君，李雪，趙心明，王鵬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301600；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；4.天津尚美化妝品有限公司，天津 300380）

筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將有強酪氨酸酶抑制作用的化合物和有強抗氧化作用的化合物進行復(fù)配會產(chǎn)生協(xié)同抑制酪氨酸酶的作用，比如白藜蘆醇與氧化白藜蘆醇復(fù)配減少皮膚由中波紫外線（UVB）導(dǎo)致的黑色素的生成，光甘草定和氧化白藜蘆醇復(fù)配協(xié)同治療黃褐斑[1-3]。

本文所研究的美白祛斑精華液即是在上述研究基礎(chǔ)上，從中藥中篩選出有協(xié)同抑制酪氨酸酶和抑制黑色素生成的組分中藥，進行復(fù)配制備而成的產(chǎn)品，其中光果甘草提取物中的主要成分為光甘草定[4]，桑根皮提取物中的主要成分為白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇[5]。本文就該產(chǎn)品的體外活性及美白祛斑效果和安全性進行研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑和設(shè)備 TECAN 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 科技公司）、AL204 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、VX-200 渦旋混勻器（Labnet International 公司）、恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）、智能孵化箱（德州市德城區(qū)永興孵化設(shè)備廠）、人體防曬指數(shù)（SPF）測試系統(tǒng)Solar Light 601（北京鼎勝拓達科技有限公司）、色差儀CR400（廣州卓諧儀器設(shè)備有限公司）、皮膚黑色素和紅色素測試探頭Mexameter?MX18（德國Courage+Khazaka electronic GmbH）、皮膚色卡（美國PANTONE 公司）。

無水乙醇（朝陽赫成化學(xué)試劑有限公司）、二甲基亞砜（賽默飛世爾科技公司）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京化成工業(yè)株式會社）、2，2'-聯(lián)氨-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，南京奧多福尼生物科技有限公司）、左旋多巴（純度≥99%，上海生工生物工程股份有限公司）、酪氨酸酶（北京索萊寶科技有限公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8，北京索萊寶科技有限公司）、過硫酸鉀（純度≥99%，上海阿拉丁公司）、生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%，石家莊四藥有限公司）、0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（上海麥克林生化科技股份有限公司）、凈界之花美白祛斑精華液[（國妝持字G20220016），杭州比竹科技有限公司]，該精華液中含有2.0%白藜蘆醇、0.8%光甘草定、0.2%紅參提取物、0.2%紅景天根提取物、0.2%光果甘草提取物、0.2%桑根皮提取物、0.2%水飛薊提取物、3.0%甘油、0.04%四氫胡椒堿、3.0%植烷三醇、3.0%1，3-丙二醇、其余為丁二醇和去離子水。

1.1.2 實驗雞胚 無特定病原（SPF）級別蘆花雞受精雞胚（新興大華農(nóng)禽蛋有限公司），購得的受精雞蛋消毒后置于智能孵化箱中，溫度（37.8±0.5）℃，相對濕度（60±5）%，每隔2 h 轉(zhuǎn)蛋1 次，7 d 齡照蛋，棄去未受精、無活性或有缺陷的雞胚。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化實驗

1.2.1.1 清除DPPH 自由基能力測定 參考羌宇等[6]的方法，加以改進。精密稱取DPPH 粉末2.0 mg，用50 mL 無水乙醇溶解，得到DPPH 溶液。樣品溶液的配制：取精華液適量，用無水乙醇溶液稀釋成一系列濃度梯度備用。在96 孔板中加入100 μL DPPH溶液，再加入不同濃度的待測樣品溶液，37 ℃恒溫搖床避光孵育30 min，使用酶標(biāo)儀在517 nm 波長處測定吸光度，平行測定4 次。加樣情況，見表1。

表1 DPPH 自由基清除實驗所需溶液及用量

DPPH 自由基清除率根據(jù)以下公式1 計算：

式中A 為空白組的吸光度；B 為樣品組的吸光度；C 為對照組的吸光度。

1.2.1.2 清除ABTS 自由基能力測定 參考Dong等[7]和莫鏡池等[8]的方法。精確稱定192 mg ABTS 自由基粉末溶于50 mL 蒸餾水中得到7 mmol/L ABTS自由基溶液；準(zhǔn)確稱取33 mg 過硫酸鉀溶于50 mL蒸餾水中得到2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液。將等體積比的7 mmol/L ABTS 自由基溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合均勻，放置黑暗處反應(yīng)12 h 得到ABTS 自由基儲存液。用50%乙醇水溶液稀釋ABTS儲存液，在734 nm 的波長下檢測吸光度，使吸光度達到0.700±0.002 時得到ABTS 自由基工作液。樣品溶液的配制：取精華液適量，用50%乙醇水溶液稀釋成一系列梯度濃度備用。在96 孔板中加入100 μL ABTS 溶液，再加入不同濃度的待測樣品溶液，37 ℃恒溫搖床避光孵育10 min，使用酶標(biāo)儀在734 nm 波長處測定吸光度，平行測定4 次。加樣情況，見表2。

表2 ABTS 自由基清除能力測定所需溶液及用量

ABTS 自由基清除率根據(jù)以下公式2 計算：

式中A 為空白組的吸光度；B 為樣品組的吸光度；C 為對照組的吸光度。

1.2.2 酪氨酸酶活性抑制實驗 參考Wang 等[3]的實驗方法。精確稱取80 mg 左旋多巴粉末溶解于40 mL PBS（pH=6.8）中，避光超聲10 min 即得左旋多巴溶液；精確稱取酪氨酸酶粉末50 KU，加PBS定容至250 mL 棕色容量瓶中，即得活性為200 U/mL的溶液；樣品溶液的配制：取精華液適量，用PBS 稀釋成一系列濃度梯度備用。

向96 孔板中依次加入PBS、40 μL 不同濃度的待測樣品溶液，40 μL 左旋多巴溶液，37 ℃恒溫搖床避光孵育10 min，加入40 μL 酪氨酸酶溶液，繼續(xù)孵育20 min，使用酶標(biāo)儀在475 nm 波長處測定吸光度，平行測定4 次。加樣情況，見表3。

表3 酪氨酸酶活性抑制實驗所需溶液及用量

酪氨酸酶抑制率根據(jù)以下公式3 計算：

式中A、B、C、D 分別表示A、B、C、D 組反應(yīng)液在475 nm 下的吸光度。

1.2.3 雞胚胎絨毛尿囊膜實驗（HET-CAM）評價眼部刺激性[9]受精雞胚孵化至第9 天進行實驗，分組為陰性對照組[質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%氯化鈉溶液、刺激評分（Irritation score，IS）值為0]、陽性對照組（0.1 mol/L 氫氧化鈉）和美白祛斑精華液組。陰性對照組和陽性對照組分別設(shè)置1 只雞胚，美白祛斑精華液組設(shè)置6 只雞胚。

照蛋檢查氣室位置，用鑷子剝?nèi)馐业皻?，暴露出白色卵殼膜，滴?.9%NaCl 溶液潤濕蛋膜顯露血管，剝?nèi)サ澳?，露出尿囊膜（CAM）。肉眼觀察CAM 的完整性及有無出血點的變化。如果有出血點或CAM 破損則剔除，不能用于進一步的測試。受試物均為透明液體，實驗采用反應(yīng)時間法。取0.3 mL 精華液，直接滴在CAM 表面，觀察CAM 反應(yīng)并記錄作用后5 min 內(nèi)每種毒性效應(yīng)出現(xiàn)的時間。刺激性分類：IS<1，無刺激性；1≤IS<5，輕刺激性；5≤IS<9，中度刺激性；IS≥10，強刺激性/腐蝕性。

IS 值采用反應(yīng)時間法進行試驗，計算公式4如下

式中：sec H（出血時間）：CAM 上觀察到開始發(fā)生出血的平均時間，單位為秒（s）；sec L（血管融解時間）：CAM 上觀察到開始發(fā)生血管融解的平均時間，單位為秒（s）；sec C（凝血時間）：CAM 上觀察到開始發(fā)生凝血的平均時間，單位為秒（s）。

1.2.4 臨床功效測試

1.2.4.1 研究對象 選取33 例志愿者[測試部位膚色用來衡量皮膚亮度的指標(biāo)個體類型角（ITA°）值在20°～41°]知情同意后入選。其中1 例因個人原因退出測試，最終有效數(shù)據(jù)32 例，男5 例，女27 例，年齡18～60 歲，平均（28.4±10.4）歲，符合志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60 歲；②配合度較好，溝通能力較好，按要求使用產(chǎn)品并完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或者哺乳期女性；②對化妝品有過敏或者高度敏感風(fēng)險者；③受試部位有急性炎性反應(yīng)、免疫缺陷或其他皮膚病者；④近2 個月內(nèi)參加藥物臨床試驗者或其他化妝品功效評價者；⑤6 個月內(nèi)接受過任何形式的皮膚治療，試驗期間可能長期暴露于紫外線下（如旅游、度假）導(dǎo)致日曬增加者；⑥試驗期間受試部位應(yīng)用抗炎藥物，全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑類藥物者；⑦不能嚴(yán)格遵守試驗要求、配合試驗者。

1.2.4.2 環(huán)境條件 測試過程中，在溫度為（21±1）℃，相對濕度為（50±10）%RH 的條件下進行視覺評估和儀器測試。視覺評估在恒定光照（色溫5 500～6 500 K熒光管或LED 燈）下進行。在評估和測試之前，受試者需要適應(yīng)這個環(huán)境至少30 min。

1.2.4.3 測試方法 采用隨機、開放臨床試驗設(shè)計，使用紫外線誘導(dǎo)人體皮膚黑化模型祛斑美白功效測試法，該方法是《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）在2021 年5 月1 日修訂后新增的人體功效評價檢驗方法中化妝品祛斑美白功效測試方法的第一法[10]。

具體操作如下：首先應(yīng)確定每個志愿者背部皮膚在一定的光源和距離下接受光照后24 h 產(chǎn)生肉眼剛可觀察到的最小紅斑量（MED）。然后，在試驗部位選定各測試區(qū)域，用日光模擬儀在同一照射點以0.75 倍MED 劑量照射1 次/d，連續(xù)照射4 d。照射結(jié)束后4 d 是皮膚黑化期，沒有任何治療。照射后第5 天，剔除ITA°值在所有測試區(qū)域平均值中>5的區(qū)域。

以色差儀測試L*a*b 顏色空間數(shù)值計算ITA°值，計算公式見式5。

按照隨機表在黑化試驗小區(qū)內(nèi)施藥。每個黑化測試區(qū)面積應(yīng)≥0.5 cm2。按照隨機表對應(yīng)測試區(qū)進行美白祛斑精華液的涂抹，涂樣面積應(yīng)≥6 cm2，涂樣量為（2.00±0.05）mg/cm2。每個測試區(qū)之間的間隔應(yīng)≥1.0 cm。涂抹2 次/d，連續(xù)使用28 d，涂抹間隔時間不少于4 h/次。受試者連續(xù)應(yīng)用4 周，并在應(yīng)用后1、2、3 和4 周對皮膚顏色進行視覺評估和儀器測試，并記錄數(shù)據(jù)。分組如下：①美白祛斑精華液組；②陰性對照組，黑化區(qū)空白對照；③陽性對照組，7%抗壞血酸（維生素C）制品（4 ℃冷藏，鋁管避光保存）。

ITA°：皮膚色差儀測得，ITA °值越大，皮膚越明亮。

黑色素含量（MI）：黑色素探頭測得，MI 值越大，皮膚黑色素含量越多。

視覺評估：皮膚色卡肉眼觀察所得。

1.2.4.4 判斷依據(jù) 試驗產(chǎn)品涂抹前后任一時間點的顏色視覺評分差值或ITA°差值或MI 差值與陰性對照相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），或經(jīng)回歸系數(shù)分析后總體判斷試驗產(chǎn)品皮膚變黑情況與陰性對照相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），則判定試驗產(chǎn)品有祛斑美白功效，否則判定試驗產(chǎn)品無祛斑美白功效。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布的要求。自身前后比較采用配對t 檢驗，不符合正態(tài)分布的要求則采用兩兩相關(guān)樣本秩和檢驗；等級資料使用前后的比較采用兩兩相關(guān)樣本秩和檢驗；對照區(qū)和測試區(qū)之間的比較采用獨立樣本t 檢驗或秩和檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 美白祛斑精華液體外抗氧化能力 DPPH 自由基清除實驗和ABTS 自由基清除實驗被廣泛應(yīng)用于抗氧化能力的測定。精華液清除DPPH 自由基的實驗結(jié)果如圖1A 所示，精華液清除DPPH 自由基的半抑制濃度（IC50）值是0.955 mg/mL，精華液清除ABTS 自由基的實驗結(jié)果如圖1B 所示，其清除ABTS 自由基的IC50值是0.480 mg/mL，由此說明美白祛斑精華液有較好的體外抗氧化活性。

圖1 精華液清除自由基能力

2.2 抑制酪氨酸酶活性 酪氨酸酶是調(diào)控黑色素生成的限速酶，抑制酪氨酸酶是減少黑色素產(chǎn)生的主要策略之一，精華液抑制酪氨酸酶的實驗結(jié)果見圖2。精華液抑制酪氨酸酶的IC50值是0.603 mg/mL，表現(xiàn)出較強的酪氨酸酶抑制能力。當(dāng)施用濃度>2.500 mg/mL 時，抑制酪氨酸酶活性的能力趨于平衡。

圖2 精華液酪氨酸酶活性抑制能力

2.3 HET-CAM 結(jié)果 根據(jù)反應(yīng)時間法計算，陽性對照組在加入0.1 mol/L 氫氧化鈉5 s 后出現(xiàn)出血現(xiàn)象，后陸續(xù)出現(xiàn)凝血和血管融解的現(xiàn)象，屬于強刺激性；美白祛斑精華液組和陰性對照組的IS 值均為0.07，屬于無刺激。在美白祛斑精華液作用于CAM的5 min 中，未觀察到血管出血、凝血和血管融解的現(xiàn)象。由此表明美白祛斑精華液無眼部刺激性，實驗結(jié)果見圖3、表4。

表4 HET-CAM 檢測各組溶液的刺激評分結(jié)果

圖3 HET-CAM 結(jié)果

2.4 美白祛斑精華液臨床功效測試結(jié)果

2.4.1 美白祛斑精華液使用前后視覺膚色評估差值 使用產(chǎn)品不同時間后皮膚明亮度測試結(jié)果見表5。美白祛斑精華液組和陽性對照組的視覺膚色評分在使用后第1，2，3，4 周，相較于陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。美白祛斑精華液組第4周相較于黑化后的膚色改善了5.72%，陽性對照組改善了4.50%。

表5 不同試驗時期膚色視覺評分差值 （±s）

測試時間 n 陰性對照組 美白祛斑精華液組 陽性對照組測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32 0±0 0 0±0 0 -0.03±0.18 -0.39 0.03±0.18 0.41 0.16±0.37 2.08 0.13±0.34 1.72 0.25±0.44 3.28 0.31±0.47 4.03 0.22±0.42 2.91 0.31±0.48 4.07 0.44±0.56 5.72 0.34±0.54 4.50

2.4.2 美白祛斑精華液使用前后臉頰皮膚明亮度變化 使用美白祛斑精華液不同時間點ITA°值差值（△ITA°值）結(jié)果，見表6?！鱅TA°值越大，說明皮膚透亮度變化越大，志愿者在使用美白祛斑精華液后，皮膚明亮度呈持續(xù)增長趨勢。使用產(chǎn)品1 周后，皮膚明亮度增加30.31%（P<0.001），堅持使用4 周后，皮膚明亮度比使用前顯著增長97.12%（P<0.001）；陽性對照組相較于陰性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。陽性對照組第4 周△ITA°值相較于第0周提升了79.90%，說明美白祛斑精華液可顯著提升皮膚明亮度。

表6 不同試驗時期皮膚△ITA°值 （±s）

表6 不同試驗時期皮膚△ITA°值 （±s）

注：與陰性對照組相比較，***P<0.001。

測試時間 n 陰性對照組 美白祛斑精華液組 陽性對照組測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32-1.22±1.13 -12.67 2.69±1.53*** 30.31 2.06±1.50*** 22.51-1.03±1.35 -10.70 4.34±1.91*** 48.90 3.94±2.06*** 43.06-0.66±1.64 -6.85 6.66±2.28*** 75.04 5.84±2.38*** 63.82-0.41±1.36 -4.26 8.62±2.34*** 97.12 7.31±2.75*** 79.90

2.4.3 美白祛斑精華液使用前后臉頰皮膚黑色素含量變化 使用美白祛斑精華液后不同時間皮膚MI 值測試結(jié)果見表7。堅持使用4 周后，與陰性對照組相比較，美白祛斑精華液組黑色素含量減少了14.46%（P=0.007），陽性對照組減少了19.06%（P<0.001）。說明美白祛斑精華液使用4 周后能有效降低皮膚黑色素含量。

表7 不同試驗時期皮膚△MI 值 （±s）

表7 不同試驗時期皮膚△MI 值 （±s）

注：與陰性對照組相比較，**P<0.01，***P<0.001。

測試時間 n 陰性對照組 美白祛斑精華液組 陽性對照組測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%） 測定值 變化率（%）1 周2 周3 周4 周32 32 32 32 0.81±15.74 0.49 2.47±18.87 1.51 11.31±13.31** 6.62 3.53±14.59 2.14 7.78±18.21 4.77 18.90±12.15*** 11.06 5.84±14.75 3.54 13.78±17.41 8.44 24.50±13.63*** 14.34 11.21±17.17 6.68 23.59±18.07** 14.46 32.56±16.41*** 19.06

3 討論

本試驗證明美白祛斑精華液有良好的體外抗氧化能力，可以清除DPPH 和ABTS 自由基；有較強的抑制酪氨酸酶活性的能力。通過HET-CAM 證明了該精華液對眼部無刺激性。美白祛斑功效宣稱的評價方法應(yīng)科學(xué)、合理，首要選擇已有的技術(shù)規(guī)范方法[11]。紫外線（UV）誘導(dǎo)人體皮膚黑化模型祛斑美白功效測試法為國家標(biāo)準(zhǔn)，該測試法評價的結(jié)果更科學(xué)有效[10]。人體試驗結(jié)果可見，使用美白祛斑精華液4 周后，與黑化后的皮膚相比較，膚色改善了5.72%，ITA°值增加了97.12%，MI 減少了14.46%，該精華液有良好的美白祛斑效果，尤其是在皮膚提亮方面。

中藥有效成分如熊果苷、光甘草定、白藜蘆醇等作為酪氨酸酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于美白化妝品中[12]，但光甘草定、氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇溶解度差，在化妝品中添加量有限，那么在無法提高活性物質(zhì)添加量的情況下，提高活性物質(zhì)之間的協(xié)同性是提高產(chǎn)品功效的有效解決途徑。本課題組發(fā)現(xiàn)以L-DOPA 為底物時，光甘草定和白藜蘆醇復(fù)配溶液抑制酪氨酸酶活性的能力較光甘草定溶液提高41.67%，復(fù)配較單獨使用抑制酪氨酸酶活性增強，表現(xiàn)出協(xié)同抑制酪氨酸酶作用[3]。同時細胞實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與氧化白藜蘆醇復(fù)配可以協(xié)同減少細胞中黑色素的生成[2]。動物實驗還發(fā)現(xiàn)光甘草定和氧化白藜蘆醇復(fù)配有協(xié)同治療黃褐斑的作用[1]。本文中的美白祛斑精華液是在既往研究基礎(chǔ)上得到的產(chǎn)品，其中含有光果甘草提取物中的主要成分光甘草定和桑根皮提取物中的主要成分白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇[4]，并添加了紅參和紅景天提取物等多種中藥提取物，紅景天已被證實有良好的抑制酪氨酸酶的作用[13]，而紅參則在抗衰老和抗氧化方面效果顯著，被應(yīng)用于各種護膚品中[14]。實驗結(jié)果也很好地證明了該精華液有美白祛斑的效果。因此，本研究驗證了美白祛斑精華液的功效和安全性，也為以后的美白祛斑類化妝品的開發(fā)提供了很好的參考和借鑒。