枇杷清肺飲治療痤瘡的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制研究

方如男，韓露，周揚(yáng)，龍永香，李建紅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

痤瘡（Acne）是一種好發(fā)于青少年的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚疾病[1]。該病好發(fā)于面頰、額部、胸背部等皮脂腺發(fā)達(dá)的部位，以粉刺、炎性丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫、色素沉著及瘢痕為主要表現(xiàn)。痤瘡的發(fā)病率高達(dá)85%[2]，其對皮膚和容貌的損害給患者的心理、工作、日?；顒蛹叭穗H關(guān)系帶來很大的影響。痤瘡的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為與內(nèi)分泌紊亂、微生物感染、毛囊口角化過度、遺傳、免疫炎性反應(yīng)有關(guān)，此外也與精神因素、飲食習(xí)慣有關(guān)。

古代醫(yī)家認(rèn)為痤瘡病位在肺，主受風(fēng)、熱外邪侵襲，當(dāng)代醫(yī)家也認(rèn)為肺經(jīng)風(fēng)熱證為痤瘡的主要證型之一，枇杷清肺飲為治療該證型的首選方。近年對枇杷清肺飲治療痤瘡的臨床研究證實其療效確切可靠[3]，但枇杷清肺飲治療痤瘡的活性成分及作用機(jī)制尚未完全闡明。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出枇杷清肺飲的有效活性成分、作用靶標(biāo)及有關(guān)信號通路，建立“藥物-疾病-靶標(biāo)-通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)，探究枇杷清肺飲治療痤瘡的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 枇杷清肺飲的有效成分篩選及其作用靶點獲取 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/index.php），分別檢索“枇杷葉”、“桑白皮”、“黃連”、“黃柏”、“人參”和“甘草”，根據(jù)該數(shù)據(jù)庫提供的設(shè)置“藥物口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似度（DL）≥0.18”篩選出符合該條件的候選活性成分，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果[4]。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取以上活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點，在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）將靶點進(jìn)行規(guī)范。

1.2 痤瘡相關(guān)靶點的獲取 以“acne”、“acne vulgaris”作為關(guān)鍵詞，對GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）進(jìn)行檢索，獲取痤瘡相關(guān)潛在靶點。合并2 個數(shù)據(jù)庫獲得的痤瘡潛在靶點，刪除重復(fù)項得到痤瘡的相關(guān)疾病靶點。

1.3 枇杷清肺飲成分-痤瘡靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用R 語言（https：//www.r-project.org）將上述枇杷清肺飲有效成分的靶點與痤瘡靶點取交集并繪制Venn 圖。后將獲得的交集靶點輸入String11.0 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）限定物種為“Homo sapiens”，從而獲得交集靶點相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8.2 對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，將Degree 值大于2 倍中位數(shù)的靶標(biāo)作為關(guān)鍵靶點。

1.4 基因功能和通路富集分析 使用R 語言的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”等安裝包對枇杷清肺飲和痤瘡交集靶點進(jìn)行基因本體功能富集分析（GO）、京都基因和基因組百科全書通路富集分析（KEGG）及可視化。

1.5 枇杷清肺飲“藥物-活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 根據(jù)上述所得到的枇杷清肺飲中的潛在活性成分與作用靶點與之間的關(guān)系，利用CytoScape 3.8.2 軟件建立藥物活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.6 活性成分與核心靶點分子對接驗證 在CytoScape 3.8.2 軟件構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖基礎(chǔ)上，選擇靶點數(shù)目最多的活性成分作為小分子配體，并通過PubChem 網(wǎng)站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取相應(yīng)活性成分的分子結(jié)構(gòu)。選取交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中“degree”值最大的靶點作為受體，在PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）獲取其蛋白結(jié)構(gòu)。使用AutoDock-Vina 軟 件（http：//vina.scripps.edu/index.html）對活性成分與核心靶點進(jìn)行分子對接驗證，并使用PyMOL 軟件（https：//pymol.org/2/）進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 枇杷清肺飲活性成分及靶點的獲取 共獲取173 個活性成分，其中枇杷葉9 個，桑白皮22 個，黃連10 個，黃柏22 個，人參17 個和甘草82 個。另外通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)枇杷葉的化學(xué)成分熊果酸有明顯的抗炎作用[5]，苦杏仁苷有免疫抑制和抗炎作用[6]。因此將熊果酸、苦杏仁苷2 個活性成分納入，最終獲得175 個活性成分。基本信息見表1。根據(jù)所得175 個有效成分，使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到作用靶點并刪去重復(fù)值獲得有效成分對應(yīng)的靶點328 個。

表1 枇杷清肺飲的活性成分信息

續(xù)表

2.2 痤瘡疾病靶點的獲取 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得痤瘡靶點1 395 個，并結(jié)合補(bǔ)充14 個相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1 407 個痤瘡相關(guān)靶點。

2.3 枇杷清肺飲成分-痤瘡靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將上述得到的藥物活性成分與疾病靶點取交集，使用R 語言繪制Venn 圖得到藥物-疾病交集靶點127 個，見圖1。將交集靶點輸入String11.0 數(shù)據(jù)庫，得到枇杷清肺飲靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含127個節(jié)點和2 389 條相互作用關(guān)系，利用2 倍DC 中位數(shù)，即DC≥68 篩選網(wǎng)絡(luò)得到核心蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2，共有節(jié)點19 個，關(guān)鍵靶點信息見表2。

表2 關(guān)鍵靶點信息

圖1 Venn 圖

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 和KEGG 分析 GO 結(jié)果顯示，枇杷清肺飲-痤瘡-基因的生物過程（BP）顯著富集在對脂多糖反應(yīng)、對細(xì)菌微生物源反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、類固醇代謝過程、對類固醇激素的反應(yīng)等。細(xì)胞組分（CC）主要富集在NA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜筏和膜微區(qū)等。KEGG 結(jié)果顯示與痤瘡相關(guān)的靶點主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等信號通路，提示枇杷清肺飲可能是通過上述通路起到治療痤瘡的作用。根據(jù)顯著性程度P<0.05（P 值由小到大）排序，取前20 進(jìn)行部分展示，見圖3～5。

圖3 GO-BP 富集分析

圖4 GO-CC 富集分析

圖5 KEGG 富集分析

2.5 枇杷清肺飲各有效成分-靶點-痤瘡網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.8.2 構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見圖6。其中各藥之間存在重復(fù)活性成分，為方便分析，故對其進(jìn)行編號A1～A13。圖中共包含280 個節(jié)點（1 個疾病，6 味藥材，146 個潛在活性成分，127 個作用靶點）和1 390 條邊。每條邊代表潛在活性成分與作用靶點之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點越大則該化合物點度中心性（DC）越大，該化合物越處于核心位置。枇杷清肺飲的有效

成分主要是A7，A6，PPY4，即槲皮素、異鼠李素、茶兒茶素。藥物-疾病交集靶點中與有效成分聯(lián)系密切的有前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）和雄激素受體（AR）等，見圖6。

圖6 藥物-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.6 活性成分與核心靶點的分子對接驗證 選取3 個核心靶點PTGS2、ESR1、AR 和網(wǎng)絡(luò)中相應(yīng)活性成分茶兒茶素、槲皮素、異鼠李素進(jìn)行分子對接，所得到的結(jié)果見表3，可視化結(jié)果見圖7。其中最低結(jié)合能≤-12.4 kcal/mol，最高結(jié)合能≤-3.9 kcal/mol表明藥效分子與蛋白對接效果良好，結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越佳。由表3 可見3 個靶蛋白與活性成分均有較好的結(jié)合力，結(jié)合上述實驗結(jié)果，表明枇杷清肺飲治療痤瘡的主要活性成分可通過調(diào)節(jié)以上靶點來實現(xiàn)。

圖7 核心靶點與活性成分分子對接

表3 分子對接結(jié)果信息

3 討論

枇杷清肺飲是中醫(yī)治療痤瘡的經(jīng)典方之一，由枇杷葉、桑白皮、黃連、黃柏、人參和甘草6 味藥組成，有清解肺胃熱毒之效，常用來治療痤瘡的肺經(jīng)風(fēng)熱證。其中枇杷葉為君，有清泄肺胃熱之功；桑白皮可入上焦以助君藥清肺熱，向下可利水，以助熱從小便去；黃連可助枇杷葉清胃之濕熱；黃柏可入下焦以清濕熱，三藥合用，上中下三焦之熱皆能瀉之；人參、甘草可瀉陰火，且能反佐寒性藥物防其苦寒傷胃?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)枇杷清肺飲不僅有抗毛囊角化作用[7]，還能降低睪酮水平和調(diào)節(jié)睪酮/雌二醇比例[8]從而有效防治痤瘡的發(fā)生與發(fā)展。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出枇杷清肺飲治療痤瘡的活性成分共175 個，其中作用靶點最多的是山奈酚（A2）、槲皮素（A7）、茶兒茶素（PPY4）和異鼠李素（A6）。痤瘡炎性反應(yīng)中的炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和IL-1α 等，能促進(jìn)毛囊口角化以及粉刺形成[9]。此外雄激素水平失衡也可導(dǎo)致痤瘡的發(fā)生，其中大量游離胰島素與胰島素樣生長因子-1（IGF-1）結(jié)合，可促使雄激素分泌增多，繼而導(dǎo)致皮脂腺分泌增加從而引起毛囊堵塞及毛囊口角化[10]。而山奈酚能通過IκB激酶-β（IKK-β）/TNF-α 信號通路抑制炎性反應(yīng)和提高機(jī)體對胰島素的敏感性[11]；槲皮素可通過減少IL-1β 和IL-6[12]發(fā)揮抑制炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的作用。另外飲食因素誘發(fā)或加重痤瘡與IGF 調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路有關(guān)[13]，而槲皮素有抑制PI3KAkt 信號通路的作用[14]；茶兒茶素能抑制5-α 還原酶的活性從而抑制皮脂的產(chǎn)生，來減輕或消除痤瘡的發(fā)生[15]，此外茶兒茶素還能通過抑制核因子-κB（NF-κB）活性降低TNF-α 基因表達(dá)達(dá)到抗炎作用[16]。有研究報道異鼠李素可抑制NF-κB 信號通路來影響?zhàn)畀彽陌l(fā)生[17]。

本研究得到枇杷清肺飲治療痤瘡的19 個關(guān)鍵靶點，如AKT1，IL-6，TP53 等。其中AKT1 是PI3K信號通路的主要下游靶蛋白之一，其功能異?？梢l(fā)糖、脂代謝障礙，繼而導(dǎo)致胰島素抵抗[18]，而有報道稱胰島素與雄激素水平呈正相關(guān)[19]，故能使雄激素水平失衡。Zhou 等[20]用棕櫚酸刺激HaCaT 角質(zhì)形成細(xì)胞，可引起IL-6 等炎性因子的產(chǎn)生和細(xì)胞增殖，從而潛在地促進(jìn)痤瘡炎性反應(yīng)和毛囊皮脂腺導(dǎo)管過度角質(zhì)化；并且有研究證實炎性因子IL-6 參與了痤瘡的發(fā)病[21]。TP53 雖是抑癌基因，但有研究發(fā)現(xiàn)TP53 除了能抑制雄激素受體的表達(dá)，還能誘導(dǎo)抑制異維A 酸效應(yīng)的關(guān)鍵誘導(dǎo)物的產(chǎn)生[22]，故認(rèn)為上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子TP53 是治療痤瘡的關(guān)鍵[23]。

在對枇杷清肺飲治療痤瘡的靶點進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)共有靶點主要與痤瘡發(fā)病機(jī)制中的炎性反應(yīng)、皮脂代謝有關(guān)，涉及PI3K/AKT、MAPK、TNF 等信號通路。根據(jù)文獻(xiàn)報道，PI3K/AKT 信號通路存在于各種細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的信號通路，可調(diào)控痤瘡皮脂代謝[24]。此外多項研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各種刺激因素活化PI3K/Akt 時，能激活其下游靶點AKT 和多種轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生胰島素抵抗而參與痤瘡的發(fā)病[25]。MAPK 通路是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的一個重要通路，而P38MAPK 通路是MAPK 家族之一。有研究發(fā)現(xiàn)藏雪蓮多糖可通過P38MAPK 通路抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1 等炎性因子的產(chǎn)生進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)[26]。TNF 信號通路通過與腫瘤壞死因子-α 受體（TNFR）結(jié)合起作用，當(dāng)二者結(jié)合時可激活NF-κB 信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而參與機(jī)體的炎性反應(yīng)[27]。除以上信號通路外，枇杷清肺飲治療痤瘡的靶標(biāo)也有部分富集在NF-κB 信號通路、胰島素抵抗等通路上，現(xiàn)有研究表明這些通路與痤瘡有一定關(guān)系[10，28]。

分子對接結(jié)果顯示槲皮素、茶兒茶素、異鼠李素能與PTGS2、ESR1、AR 受體蛋白較穩(wěn)定地自發(fā)結(jié)合，故驗證這3 種活性成分是枇杷清肺飲的核心藥效成分。因此枇杷清肺飲可能通過其活性成分與疾病核心靶點蛋白發(fā)生相互作用而達(dá)到治療痤瘡的目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅從理論上出發(fā)排除了中藥劑量、煎煮等因素等影響，所得出的結(jié)論仍需要進(jìn)一步實驗研究來證明。但不可否認(rèn)枇杷清肺飲這一經(jīng)典方劑治療痤瘡有很大的潛力，其有效成分、作用靶點和作用通路，與其他單味中藥或成分治療相比更加廣泛、全面，并且本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與現(xiàn)有的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果相一致。部分信號通路與痤瘡是否存在一定的聯(lián)系目前雖然無法證明，但這也為研究中藥治療痤瘡的作用機(jī)制研究提供了一個新的方向。