基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討當(dāng)歸飲子治療慢性自發(fā)性蕁麻疹的作用機(jī)制

韓露，周揚(yáng)，方如男，屈雙擎，陳兵，李建紅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

當(dāng)歸飲子首載于《嚴(yán)氏濟(jì)生方》[1]，有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)止癢的功效，是治療慢性自發(fā)性蕁麻疹（Chronic spontaneous urticaria，CSU）的經(jīng)典方劑，方藥組成為當(dāng)歸、生地、川芎、白芍、防風(fēng)、白蒺藜、荊芥、何首烏、黃芪以及甘草10 味中藥，主要用于治療血虛風(fēng)燥及氣血兩虛型慢性蕁麻疹，臨床療效確切[2-3]。有研究表明，當(dāng)歸飲子治療CSU 可能通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平、抑制遲發(fā)相過敏反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制過敏性炎性反應(yīng)等實(shí)現(xiàn)[2，4-5]。然而中藥復(fù)方的成分多樣，作用機(jī)制牽涉多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)，當(dāng)歸飲子治療CSU 的藥效成分和作用機(jī)制尚不完全明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將多元藥理網(wǎng)絡(luò)映射到人類疾病-基因網(wǎng)絡(luò)上，區(qū)別于傳統(tǒng)的“一種藥物針對(duì)一種疾病的一個(gè)靶點(diǎn)”假設(shè)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以系統(tǒng)地闡釋多種藥物活性成分與疾病基因間復(fù)雜的相互作用，更有利于對(duì)復(fù)雜疾病治療機(jī)制的探索[6-7]。而中藥復(fù)方亦有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，所以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)近年來被愈來愈多地應(yīng)用于中藥復(fù)方效應(yīng)機(jī)制的研究中。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析當(dāng)歸飲子治療CSU 的藥效成分和作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究當(dāng)歸飲子的藥理作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要化學(xué)成分的收集和篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）并結(jié)合中藥分子機(jī)制在線分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/index.php），收集當(dāng)歸、生地黃、川芎、白芍、防風(fēng)、蒺藜、荊芥、何首烏、黃芪和甘草的主要化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 作為篩選參數(shù)[8]。另外結(jié)合文獻(xiàn)研究，將未能符合篩選參數(shù)，但是有明確藥理作用的成分也納入候選。

1.2 靶點(diǎn)收集 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索候選活性成分靶點(diǎn)，剔除沒有靶點(diǎn)的活性成分。將收集整理到的靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物種為人，剔除非人源靶點(diǎn)，將所有靶基因名稱校正為官方名稱（Offical gene symbol）。

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中通過檢索關(guān)鍵詞“chronic spontaneous urticaria”收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)，通過R 語言進(jìn)行活性成分靶點(diǎn)和CSU 疾病靶點(diǎn)的匹配并繪制Venn 圖，得到二者交集靶點(diǎn)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用CytoScape 3.8.0（https：//cytoscape.org/）軟件構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)；使用String 在線工具（https：//string-db.org/）獲取共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用信息，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，用CytoScape 軟件進(jìn)行可視化處理。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的分析 利用CytoScape 的插件CytoNCA對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的點(diǎn)度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）和特征向量中心性（EC）。這些參數(shù)是評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性或影響力的指標(biāo)，數(shù)值越大，說明節(jié)點(diǎn)越處于網(wǎng)絡(luò)的核心地位。根據(jù)拓?fù)鋮?shù)篩選網(wǎng)絡(luò)核心活性成分及核心靶點(diǎn)。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，http：//www.rcsb.org/）獲取核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，從有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取相應(yīng)活性成分的分子結(jié)構(gòu)，使用AutoDock-Vina 軟件（http：//vina.scripps.edu/index.html）對(duì)核心靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并使用PyMOL 軟件（https：//pymol.org/2/）進(jìn)行可視化處理。

1.6 基因功能和通路富集分析 使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為人，對(duì)藥物-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體生物過程（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）注釋分析。使用微生信在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，分析當(dāng)歸飲子活性成分顯著影響的生物過程和信號(hào)通路，探討當(dāng)歸飲子治療CSU 的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸飲子主要化學(xué)成分的收集與篩選 剔除無靶點(diǎn)的化學(xué)成分后，共得到有效活性成分154個(gè)，其中當(dāng)歸6 個(gè)、何首烏7 個(gè)、生地黃4 個(gè)、川芎10 個(gè)、白芍9 個(gè)、防風(fēng)18 個(gè)、蒺藜8 個(gè)、荊芥11 個(gè)、黃芪18 個(gè)和甘草88 個(gè)，部分化學(xué)成分存在于多種中藥中。

2.2 靶點(diǎn)收集 共預(yù)測(cè)到154 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的2 621 個(gè)作用靶點(diǎn)。于GeneCards 數(shù)據(jù)庫與OMIM 數(shù)據(jù)庫分別得到817 和80 個(gè)靶點(diǎn)，去重后得到889個(gè)CSU 疾病相關(guān)靶點(diǎn)。其中活性成分和疾病的共同靶點(diǎn)120 個(gè)，見圖1，對(duì)應(yīng)當(dāng)歸飲子的138 個(gè)活性成分，見表1。

表1 當(dāng)歸飲子的活性成分信息

續(xù)表

圖1 Venn 圖

2.3 藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)模型如圖2 所示，圖中138 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)到CSU 的120 個(gè)潛在靶點(diǎn)上，其中深綠色節(jié)點(diǎn)代表共有靶點(diǎn)，橙色節(jié)點(diǎn)代表單一藥物成分，粉色節(jié)點(diǎn)代表藥物共有成分，節(jié)點(diǎn)大小與DC 值成正比。利用CytoNCA 工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的DC、BC、CC 和EC 值。一般認(rèn)為DC 值≥2 倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)，所以利用DC≥12 并結(jié)合BC、CC、EC 中位數(shù)，BC≥33.255 7、CC≥0.3982 71 以及EC≥0.0285 11 篩選網(wǎng)絡(luò)，得到的節(jié)點(diǎn)中活性成分節(jié)點(diǎn)占17 個(gè)，其中何首烏2 個(gè)，分別為白藜蘆醇和大黃素；荊芥1 個(gè)，為木犀草素；黃芪2 個(gè)，為7-O-甲基異丁香酚、黃芪紫檀烷；甘草6 個(gè)，分別為甘草甜素、柚皮素、驢食草酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素和甘草查爾酮A；防風(fēng)1 個(gè)，為漢黃芩素；當(dāng)歸、白芍、防風(fēng)與荊芥的共有成分1 個(gè)，為β-谷甾醇；黃芪與甘草的共有成分1 個(gè)，為刺芒柄花素；黃芪、甘草與荊芥的共有成分1 個(gè)，為槲皮素；黃芪、甘草與蒺藜的共有成分1 個(gè)，為異鼠李素；黃芪、甘草、蒺藜與白芍的共有成分1 個(gè)，為山奈酚。

圖2 藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含120 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 247 條相互作用關(guān)系，利用2 倍DC 中位數(shù)，DC≥68 結(jié)合BC、CC、EC 中位數(shù)，BC≥28.362 871 31、CC≥0.573 497 306以及EC≥0.787 89 篩選網(wǎng)絡(luò)得到核心PPI 網(wǎng)絡(luò)，共有節(jié)點(diǎn)16 個(gè)，分別為基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、活瓣內(nèi)切核酸酶-1（FN-1）、環(huán)氧化酶-2（PTGS-2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、蛋白激酶B（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、MMP2、IL-10、胱天蛋白酶3（Casp-3）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、IL-1B、腫瘤蛋白質(zhì)53（TP53）、CXC 趨化因子配體-8（CXCL-8）以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3（STAT-3），其中度中心性最高的有IL-6、AKT1 和VEGFA，分別可以與96、91、90 個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，見圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 分子對(duì)接結(jié)果 選取3 個(gè)核心靶點(diǎn)IL-6、AKT1、VEGFA 和網(wǎng)絡(luò)中相應(yīng)活性成分白藜蘆醇、槲皮素、木犀草素進(jìn)行分子對(duì)接，所得到的結(jié)果見表2、圖4。其中最低結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol 即表明藥效分子與蛋白對(duì)接效果良好，結(jié)合能越低，表明分子與蛋白結(jié)合能力越佳。對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，說明3 個(gè)靶蛋白與活性成分均有較好的結(jié)合力，且結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與之結(jié)合的活性成分均為當(dāng)歸飲子治療CSU 的核心成分。

圖4 核心靶點(diǎn)與活性成分分子對(duì)接

表2 分子對(duì)接結(jié)果信息

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析 在對(duì)藥物-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析后，共得到709 條結(jié)果，包括GO 結(jié)果596 條、KEGG 結(jié)果113條。本研究通過enrichment、P 值和富集到生物過程、通路上的基因個(gè)數(shù)來衡量GO 與KEGG 富集程度，其中enrichment 值表示差異表達(dá)的基因中位于該生物過程/通路條目的基因數(shù)目與該物種所有注釋基因中位于該生物過程/通路條目的基因總數(shù)的比值，enrichment 越大，表示富集的程度越大。靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的生物過程主要有細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控（27個(gè)靶點(diǎn)）、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)（22 個(gè)靶點(diǎn)）、缺氧反應(yīng)（18 個(gè)靶點(diǎn)）、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)（12 個(gè)靶點(diǎn)）以及細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)（24 個(gè)靶點(diǎn)）等。共有靶點(diǎn)主要富集的通路有TNF 信號(hào)通路（20個(gè)靶點(diǎn)）、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（16 個(gè)靶點(diǎn)）、PI3K-Akt信號(hào)通路（30 個(gè)靶點(diǎn)）、HIF-1 信號(hào)通路（18 個(gè)靶點(diǎn)）、FoxO 信號(hào)通路（19 個(gè)靶點(diǎn)）及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（16 個(gè)靶點(diǎn)）等，見圖5、6。

圖5 GO 富集分析

圖6 KEGG 富集分析

3 討論

本研究共得到當(dāng)歸飲子治療CSU 的有效活性成分138 個(gè)，對(duì)應(yīng)120 個(gè)疾病靶點(diǎn)，其中普遍存在一種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)疾病靶點(diǎn)，以及多種活性成分對(duì)應(yīng)一個(gè)疾病靶點(diǎn)的關(guān)系，反應(yīng)了當(dāng)歸飲子治療CSU 多組分和多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。

通過對(duì)藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的篩選，預(yù)測(cè)出當(dāng)歸飲子在CSU 治療中較重要的活性成分為：白藜蘆醇、大黃素、木犀草素、7-O-甲基異丁香酚、黃芪紫檀烷、甘草甜素、柚皮素、驢食草酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素、甘草查爾酮A、漢黃芩素、β-谷甾醇、刺芒柄花素、槲皮素、異鼠李素和山奈酚。白藜蘆醇有抗氧化、抗炎的特性，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能[16]；木犀草素及柚皮素有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎活性，可以降低小鼠體內(nèi)高活性氧自由基（ROS）水平，從而在氧化應(yīng)激方面改善CSU 癥狀，木犀草素還可以抑制IL-6、IL-17、TNF-α等各種促炎因子，以減輕機(jī)體過度的炎性反應(yīng)[17-18]；山奈酚、槲皮素、異鼠李素等可以減少自由基生成，通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕機(jī)體損傷，還可以通過TNF、PI3K-Akt 等信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)過程而發(fā)揮治療作用[19-21]，其中山柰酚還可以通過調(diào)節(jié)VEGF 及其受體（VEGFR-2）以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K-Akt 等對(duì)VEGF 刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞生成有抑制作用[22]。以上各重要活性成分，多為黃酮類化合物，由此推測(cè)黃酮類化合物是當(dāng)歸飲子在CSU 中發(fā)揮治療作用的主要活性成分。其可以通過PI3KAkt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等多通路及抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能等多途徑發(fā)揮對(duì)CSU 的干預(yù)作用。

通過對(duì)藥物與疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和篩選，共得到16 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，例如IL-6、AKT1和VEGFA 等。IL-6 是與自身免疫密切相關(guān)的促炎細(xì)胞因子，也是CSU 炎性反應(yīng)中其他促炎因子表達(dá)和抗體產(chǎn)生的基礎(chǔ)因子，實(shí)驗(yàn)研究顯示CSU 患者IL-6 水平明顯高于健康對(duì)照，而在接受治療后，IL-6水平也隨之下降[23-25]。VEGFA 是VEGF 家族的成員，其表達(dá)產(chǎn)物是血管通透性的調(diào)節(jié)因子，主要由肥大細(xì)胞產(chǎn)生，在CSU 的炎性反應(yīng)中起著重要作用[26-27]。有研究表示IL-6 可以單獨(dú)誘導(dǎo)人皮膚肥大細(xì)胞產(chǎn)生VEGFA，在肥大細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮作用[28]。而這一過程主要是通過PI3K-Akt-HIF-1-VEGF 軸實(shí)現(xiàn)的[26，29]。以上關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)多涉及炎性反應(yīng)、血管通透性的增加以及自身免疫等病理過程，這些也是CSU 的主要病理反應(yīng)，據(jù)此推測(cè)，這可能是當(dāng)歸飲子對(duì)CSU 發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵所在。

分子對(duì)接結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素、白藜蘆醇均能與上述3 個(gè)靶點(diǎn)的受體蛋白較穩(wěn)定的自發(fā)結(jié)合，驗(yàn)證了此3 種活性成分作為當(dāng)歸飲子的核心藥效成分。且由此可以推測(cè)，當(dāng)歸飲子可能通過其活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用而達(dá)到治療CSU 的目的。

在對(duì)當(dāng)歸飲子治療CSU 的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析后，發(fā)現(xiàn)共有靶點(diǎn)主要涉及CSU 發(fā)病機(jī)制中血管通透性的調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞增殖與凋亡等生物過程[17，22-23，25-28]，以及TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等通路。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TNF 信號(hào)通路的激活與CSU 有關(guān)，是該疾病全身炎性反應(yīng)的一部分，此外TNF 活性和其可溶性受體（sTNF-Rs）之間的平衡決定了機(jī)體免疫激活和炎性反應(yīng)的過程，其失調(diào)可能在CSU 對(duì)藥物的敏感性和耐藥性中起作用[30-31]；有實(shí)驗(yàn)研究表示CSU 患者血清可通過PI3K-Akt 信號(hào)通路上調(diào)HIF-1α 的表達(dá)，激活下游HIF-1 信號(hào)通路，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞表達(dá)VEGF 以調(diào)節(jié)血管通透性，從而導(dǎo)致CSU 的發(fā)病[26]；自身免疫也是引起CSU 的常見原因之一，包括IgE 抗體介導(dǎo)的針對(duì)自身抗原的Ⅰ型自身免疫反應(yīng)和IgG 抗體介導(dǎo)的針對(duì)IgE 或FcεRI 的Ⅱ型自身免疫反應(yīng)[32]。以上內(nèi)容所涉及的生物學(xué)過程是CSU 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過程，綜合GO 與KEGG 富集分析結(jié)果進(jìn)一步表明了當(dāng)歸飲子多成分、多環(huán)節(jié)、多通路的整合作用機(jī)制。